Méthode Agitateur magnétique pour la détection des<em> Trichinella</em> Larves dans les échantillons de muscle

1. Préparatifs Collecte d'échantillons Note: La méthode de l'agitateur magnétique peut être utilisé pour des échantillons musculaires simples ou groupés. Prélever des échantillons à partir des sites de prédilection appropriés et en une quantité appropriée 9. Reportez-vous aux exigences du pays ou aux recommandations des TIC, de l'OIE ou ISO. Pour l'Union européenne, par exemple, prendre un échantillon de 1 g d'un pilier de diaphragme à la transition vers la partie tendineuse des porcs domestiques. Veiller à ce que tous les échantillons de muscle sont exempts de toutes les graisses et le fascia. Si la languette est testée, enlever la couche superficielle avant l'essai. Prenez garde si les échantillons sont congelés, comme la plupart des larves de Trichinella ne sont pas geler résistants et déroulez après la mort, sont moins résistants à la digestion et ont tendance à coller aux parois du récipient, ce qui entraîne la sensibilité du test a diminué. Remarque: En cas de gel, le double de la taille de l'échantillon à lest et augmenter le temps de sédimentation (voir ci-dessous). Préparation du liquide de digestion Ajouter HCl à 25% (16 ± 0,5 ml) à 2 litres d'eau du robinet préchauffé à 46-48 ° C dans un bêcher de 3 L de verre. Trop faible d'un résultat de température dans la digestion incomplète; trop élevé d'une température désactive les propriétés enzymatiques de la pepsine. Placez une tige d'agitation dans le bécher, et agiter la solution sur une plaque préchauffée (46-48 ° C). Ajouter 10 ± 0,2 g de pepsine (1: 10 000 NF, 1: 12.500 BP 2000 FIP) à la solution acide. Remarque: La qualité de la pepsine est de la plus haute importance et l'activité enzymatique doivent être certifiés par le producteur. Pour des raisons de sécurité en laboratoire et pour maintenir l'activité de la pepsine, la séquence d'addition des composants du liquide de digestion doit être respectée. La préparation d'échantillons de muscle Hacher jusqu'à 100 g d'échantillons de muscle dans un mélangeur ou un broyeur. Pour faciliter blending, ajouter 2 ml d'eau préchauffée aux échantillons et mélanger à la vitesse max pour 2 – 3 s. Avant le second mélange, ouvrir le mélangeur et transférer un échantillon de muscle en haut du bord marge bol de mélange vers le bas et répétez le mélange. Continuer le mélange avec des éclats de 2 – 3 s jusqu'à ce qu'aucun fragments visibles de viande restent. Remarque: Trop peu de mélange peut entraîner une digestion incomplète, alors que trop de mélange peut endommager le Trichinella larves présentes dans les échantillons 6. 2. procédure Muscle digestion de l' échantillon Transfert 1 L du liquide de digestion dans un cylindre. Transférer la viande hachée dans le bécher et diffuser dans le liquide de digestion avec une cuillère ou une fourchette. Rincer soigneusement le bol couvercle du mélangeur, la lame et mélangeur avec 500 ml de liquide de digestion préchauffé dans le 3 L bêcher. Remarque: le rinçage incomplet peut entraîner la perte du sensibilité. Couvrir le bécher avec une feuille d'aluminium et de garder une température constante de 44-46 ° C et surveiller avec un thermomètre. Agiter le liquide de digestion pendant 30 min pour créer un tourbillon profond sans éclaboussures jusqu'à ce que les particules de viande disparaissent. Selon le type de viande testés (par exemple , la viande d'animaux sauvages), augmenter le temps de la digestion jusqu'à un maximum de 60 min. La filtration et la sédimentation du liquide de digestion Pour déterminer la quantité de tissu non digérés, ajuster la balance à zéro, peser le tamis avant utilisation, et noter son poids. Le tamis doit être propre et exempt de toutes les particules de tissu, ce qui pourrait entraver les larves de Trichinella atteindre l'entonnoir de sédimentation. Vérifiez que l'entonnoir de séparation est nivelé verticalement. Après digestion, versez délicatement le liquide de digestion à travers un tamis de 180 um dans une ampoule de verre de séparation. La largeur de l'entonnoir en verre de séparation ne doit pas be plus grand que 55% de la longueur pour permettre une bonne sédimentation des larves. Prenez soin d'éviter tout débordement. Pour éviter la perte de sensibilité, bien rincer le récipient en verre et le tamis avec environ 200 ml d'eau du robinet d'une bouteille de lavage de presser et transférer l'eau de rinçage dans l'entonnoir en verre de sédimentation. Prenez soin de rincer soigneusement les bords du 3 L bêcher. Soulevez le tamis et rincer la zone sous le tamis à fond. Détermination du montant des tissus non digérés Remarque: En raison d'erreurs dans l'exécution de la méthode, le tissu musculaire peut rester sur le tamis, comme fascia bien et du tissu conjonctif qui sont indigestes. La quantité de tissu non digéré est déterminé pendant la première étape de sédimentation de 10 min (voir 2.5). Cela permet à environ 30 min pour le tamis à sécher, car l'eau résiduelle peut influencer le poids déterminé du tissu non digérés. Placez une serviette en papier sur une échelle, et peser le tamis avec les undigestissus ted. Soustraire le poids de tamis avant la filtration à partir du poids de tamis avec des tissus non digérés. Le processus de digestion est considéré comme satisfaisant si pas plus de 5% du poids de l' échantillon de départ reste sur le tamis ( par exemple 5 g / 100 g de matière de départ). Si la quantité de tissu non digérés dépasse 5%, répéter le test en utilisant des échantillons de muscle frais. Si le tissu restant est principalement constitué de tissus musculaires non digérés et les échantillons frais ne sont pas disponibles, digérer les restes non digérés de nouveau et d'examiner en plus des échantillons originaux. Décantation du liquide de digestion Garder le liquide de digestion filtré dans l'ampoule à décanter pendant 30 min. Si elle reste intacte, les larves de Trichinella se déposent au fond de l'entonnoir. Si les échantillons congelés sont utilisés, augmenter le temps de sédimentation à un maximum de 60 min. Une fois que la sédimentation est terminée, ouvrir complètement le robinetde l'ampoule à décanter de laisser au moins 40 ml de liquide de digestion rapide de ruissellement dans un cylindre de mesure (80 mL si les échantillons musculaires avaient été préalablement congelés). Tout d'abord, laisser la moitié du fluide dans le cylindre, puis ouvrir complètement le robinet d'arrêt dans le sens opposé pour permettre à 10 ml de liquide de digestion à passer. Enfin, ouvrir le robinet dans le sens opposé pour 10 ml. Cette procédure garantit que les larves de Trichinella ne sont pas pris au piège dans le robinet. Remarque: la vitesse suffisante est nécessaire pour éviter les larves restant dans l'ampoule à décanter, diminution de la sensibilité. Sédimentation du liquide de digestion dans le cylindre Laisser le sédiment dans le cylindre pendant 10 minutes pour permettre aux larves de sédiments. Retirer 30 ml surnageant par aspiration avec une pipette sans perturber le sédiment 10 mL. Pour réduire la quantité de fibres de tissus dans l'échantillon, ajouter 30 ml d'eau du robinet pour les sédiments et quitter pour un autre 10 mdans. Répétez jusqu'à ce que le liquide est clair. Retirer le surnageant et transférer lavé les 10 ml de sédiments dans une boîte de Petri grillagée ou d'un bassin de comptage des larves. Rincer le cylindre avec 10 ml d'eau du robinet, puis ajouter l'eau à l'échantillon. Remarque: Comme de grandes quantités de débris dans l'échantillon peuvent empêcher l'identification des larves de Trichinella (Figure 1), d' autres étapes de lavage doivent être effectuées, si nécessaire. L' examen microscopique Utiliser un trichinoscope ou un stéréo-microscope avec une source de lumière transmise sous-étage d'intensité réglable à un 15 grossissement de 20X pour examiner les échantillons immédiatement après les étapes de lavage. Après avoir versé l'échantillon dans la boîte de Petri maillées, examiner le plat / bassin systématiquement grille en grille. Si aucune structure suspects sont trouvés, déplacez doucement le liquide dans la boîte de Pétri maillées ou d'un bassin de comptage des larves de façon circulaire pour permettre à toute la Trichinellarvae, qui ont été potentiellement négligé, d'accumuler dans le centre de la boîte de Pétri. Répétez l'examen. Si une structure suspect est trouvé, augmenter le grossissement de 40 – 100X. Retirer les larves de Trichinella du plat / bassin avec une pipette et de recueillir dans un tube avec 90% d' éthanol. Après le plat complet a été examiné, répétez la procédure, à partir de l'agitation douce du plat / bassin. Répétez la procédure au moins trois fois ou jusqu'à ce que plus les larves se trouvent. Comptez le nombre de larves. Corréler la quantité de tissu musculaire testé et présente sous forme de larves par gramme (lpg). Si un trop grand nombre de larves sont présentes dans le liquide de digestion pour déterminer le nombre de larves de manière fiable, retourner le fluide contenant les larves au cylindre de mesure, rincer à l'eau du robinet d'une bouteille de lavage de compression, et de laisser les larves à se déposer au fond. Après un temps de sédimentation de 10 minutes, réduire le surnageant dans un volume défini (par exemple ,10 ml). Pour déterminer le volume exact, transférer le surnageant dans un nouveau cylindre avec une pipette. Suspendre les larves de façon homogène dans le liquide par agitation vigoureuse. Pendant le mouvement secouant, ajouter 12 gouttes de 20 ul de suspension larvaire sur une boîte de Pétri. Examinez chaque goutte au microscope. Déterminer le nombre de larves dans 240 pi et supprimer le nombre le plus élevé et le plus bas. Extrapoler le nombre de larves au volume total (par exemple 10 ml) de surnageant. Remarque: La qualité de la stéréo-microscope est d' une importance primordiale pour l'identification des larves de Trichinella. Lorsque les larves sont collectées dans un tube par une pipette, vérifier soigneusement que les larves ne colle pas sur le mur de la pipette, mais sont transférés dans le tube. Remarque: les résultats positifs Trichinella à partir d' échantillons mis en commun doivent faire remonter de la piscine à la carcasse d'origine. Ici, la taille de la piscine doit être progressivement diminuée jusqu'à ce que la carcasse positive est identifié. La taille de l'échantillon peut également être augmenté au cours de ce processus pour augmenter la sensibilité. Lorsque l'examen d'un échantillon collectif produit un résultat positif ou incertain, un échantillon de 20 g est prélevé sur chaque porc. Les échantillons de 20 g de cinq porcs sont réunies et examinées à l'aide du procédé décrit. De cette façon, des échantillons de 20 groupes de cinq porcs seront examinés. Lorsque Trichinella est détectée dans un échantillon groupé de cinq porcs, des échantillons de 20 g sont prélevés sur les porcs individuels dans le groupe et chacun est examiné séparément jusqu'à la carcasse positive de l' origine est détectée.