多聚-PAGE：生物样品中的用于拍摄方法和解决蛋白复合体

正常细胞功能是依赖于蛋白质-蛋白质相互作用^1,2。其结果是，人类疾病通常是由在不同的蛋白质复合物³的组件和行为的扰动标记。表征这种相互作用的能力因此，至关重要。检测这些相互作用电流的装置需要的靶蛋白，通常随后通过相互作用配偶的下拉的纯化。常规纯化通过差速离心，沉淀和/或色谱法⁴来实现的。这些方法是耗时的，必须改变用于每个靶蛋白，并经常导致低的产率。现代纯化方法涉及肽标签融合到靶蛋白，随后通过免疫沉淀或萃取上装载有结合于捕获分子⁵珠粒柱^，“> 6，虽然这是可扩展到许多蛋白质，这需要目标的序列修饰，潜在地导致在亲和力差异，它们通常的结合配偶体的构建体。一些蛋白质-蛋白质相互作用的微妙特性意味着这种方法可能不适用许多方案。另外，用于映射蛋白质 – 蛋白质相互作用的下拉测定法可以不捕获准确蜂窝图片，由于受限制的自由度和诱饵蛋白的非天然的水平。

理想情况下，蛋白复合物能够在他们的原生状态进行检测，而不需要净化或下拉。蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）被开发作为变性少替代十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并允许某些蛋白质和复合物从生物样品⁷的分离。然而，在BN-PAGE蛋白质分离的基础上LARGE数的变量，包括大小，电荷，三维结构，和关联与其他分子。这些因素的相互作用通常导致蛋白质的共分离，聚集体形成，差的蛋白质条带的分辨率。二维原生聚丙烯酰胺凝胶电泳解决了一些，但不是全部，这些问题^8。

为了避开与天然分离相关的并发症，一些作者使用胺反应性的交联试剂，如二硫代双（琥珀酰亚胺丙酸酯）（DSP），以捕获蛋白复合物在组织裂解物^4。然后将这些处理过的溶胞产物可变性，并通过SDS-PAGE分离，同时保持蛋白质复合物的天然大小和化妆。然而，由于交联试剂反应基于一个分子到另一个的接近度，以及在组织裂解液的蛋白质具有许多自由度，并且可以随机相互作用，非特异性背景交叉-linking可以是高的，尤其是浓缩的样品英寸这可能会导致难以解释结果。

在这里，我们证明了使用混合BN-PAGE / SDS-PAGE的方法，被称为多聚聚丙烯酰胺凝胶电泳（多聚-PAGE），以分离和复杂混合物中检测蛋白组件。最初，细胞裂解物通过BN-PAGE悬浮于聚丙烯酰胺凝胶。含溶胞产物 – 凝胶，然后用交联试剂DSP反应。伪固定，并略微在凝胶上分离，蛋白可能非特异性反应少得多，这意味着背景交联剂反应性降低。交联后，将凝胶条带切下并通过SDS-PAGE分离。将所得的凝胶然后可以通过典型地与聚丙烯酰胺凝胶电泳相关的任何手段进行分析。这种方法允许在未修饰的组织裂解物天然蛋白质复合物的分离和检测，而无需额外的纯化或上拉陶氏ñ。