Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

Função celular normal é dependente de interacções proteína-proteína de ^{1, 2.} Como resultado, as doenças humanas são frequentemente caracterizadas por perturbações na montagem e comportamento de vários complexos de proteínas ^3. A capacidade de caracterizar essas interacções é, por conseguinte, crítica. meios actuais de detecção destas interacções requerem purificação de proteínas alvo, muitas vezes seguidos por suspenso de seus parceiros interactuantes. Clássica de purificação é realizado por centrifugação diferencial, precipitação e / ou cromatograf ia em ^4. Estes métodos são demorados, deve ser alterado para cada proteína alvo, e muitas vezes resultam em baixos rendimentos. Modernos métodos de purificação envolvem a fusão de sinais peptídicos a proteínas alvo, seguido de imunoprecipitação ou de extracção em colunas carregadas com esferas ligadas a uma molula de captura ^5,"> 6. Embora esta seja extensível para muitas proteínas, que exige modificação da sequência do alvo, potencialmente resultando em construções que diferem na afinidade para os seus parceiros de ligação usuais. A natureza delicada de algumas interacções proteína-proteína significa que este método pode não ser aplicável para muitos cenários. Além disso, os ensaios de pull-down utilizadas para mapear as interações proteína-proteína pode não capturar uma imagem celular precisa, devido à graus restritos de liberdade e os níveis de não-nativos da proteína isca.

Idealmente, os complexos de proteína podia ser detectada nos seus estados nativos, sem a necessidade de purificação ou suspenso. Electroforese em gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE) foi desenvolvido como uma alternativa menos desnaturante a electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), e permite a separação de algumas proteínas e complexos a partir de amostras biológicas ^7. No entanto, as proteínas em BN-PAGE separadas com base em um large número de variáveis, incluindo tamanho, carga, estrutura tridimensional, e associação com outras moléculas. As interacções destes factores resultam frequentemente em co-separação de proteínas, formação de agregados, e pobre resolução banda de proteína. Electroforese em gel nativo de poliacrilamida bidimensional resolve alguns, mas não todos, estes problemas ^8.

Para contornar as complicações associadas com a separação nativa, alguns autores utilizam reagentes reactivos de amina de reticulao, tais como ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP), para capturar os complexos de proteína em lisados de tecido ^4. Estes lisados ​​tratados pode então ser desnaturado e separadas por SDS-PAGE, preservando ao mesmo tempo o tamanho nativo e a composição de complexos de proteínas. No entanto, uma vez que os reagentes de reticulação reagir com base na proximidade de uma molécula para outra, e proteínas em lisados ​​de tecido tem muitos graus de liberdade e pode interagir estocasticamente, inespecífica transversal fundo-linking pode ser elevado, especialmente em amostras concentradas. Isso pode levar a resultados difíceis de interpretar.

Aqui, demonstramos a utilização de um método híbrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominada electroforese em gel de poliacrilamida-multero (multímero-PAGE), para separar e detectar os conjuntos de proteínas em misturas complexas. Inicialmente, lisado de células é suspenso em gel de poliacrilamida através BN-PAGE. O gel contendo o lisado é então feito reagir com o reagente DSP reticulação. e ligeiramente separadas no gel imobilizada-pseudo, as proteínas são muito menos susceptíveis de reagir de forma não específica, o que significa que a reactividade cruzada de fundo ligante é reduzida. Após a reticulação, as bandas de gel são excisadas e separados por meio de SDS-PAGE. O gel resultante pode então ser analisada por quaisquer meios tipicamente associados com electroforese em gel de poliacrilamida. Este método permite a separação e a detecção de complexos de proteínas nativas em lisado de tecido não modificada, sem a necessidade de purificação adicional ou puxar-Down.