用运动调节血清治疗韧带结构：转化组织工程模型

以下程序遵守经加州大学戴维斯分校机构审查委员会批准的议定书;在开始研究之前，请咨询当地的道德委员会。 1.从人类ACL残留物中分离初级成纤维细胞注意：保持不育，并在生物安全柜（BSC）中执行所有步骤。 获得适当的伦理审查委员会的批准，以收集和使用人体组织，如下所述。 通过将100倍抗生素/抗真菌溶液稀释到1倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）中来制备5x抗生素/抗真菌（ABAM）溶液。 将5X ABAM溶液中的ACL组织碎片收集在50mL锥形管中，在4℃下储存直至消化步骤。如果需要，用剃须刀将组织切成更小的碎片，最大尺寸为1×1×1cm 3 。 小心：符合当地生物危害条例妥善使用生物危害材料，去除和处置生物危害废物。 准备足够的胶原酶溶液以淹没组织碎片。在含有1μg青霉素/链霉素和20％胎牛血清（FBS）的高糖Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中溶解II型胶原酶（1mg / mL），并在0.22μm下过滤。 在PBS中冲洗ACL组织3次。 摘要组织。将ACL组织转移到新的50mL锥形管中，并加入足够体积的胶原酶溶液以淹没组织。在37℃下孵育过夜（〜17小时）。 在消化持续时间完成之前，通过用10％FBS和100U / mL青霉素补充DMEM高葡萄糖培养基来制备生长培养基（GM）。 在消化时间完成前15分钟，每5分钟短暂涡旋含有组织的50mL管3次。 使用25 mL血清移液管，大量地消化消化的组织以破坏ti进一步下降并移除细胞。 以1,500 xg离心5分钟。吸出上清液并将沉淀重悬于10mL GM中。 重复步骤1.8-1.9三次。 最后一次离心后，将沉淀重悬于5-10 mL GM。使用小样本的细胞悬液用血细胞计数器进行细胞计数，并使用台盼蓝评估细胞活力。 将细胞悬浮液以每平板3-4×10 5个细胞的密度将细胞悬浮液平板化到15cm组织培养板上。 在37℃和5％CO 2的无菌培养箱中培养至70％汇合，每三天更换一次GM。使用或储存（见下文）细胞5代。 冻结细胞以备将来使用。 以70％汇合胰蛋白酶消化细胞如下。吸出培养基并用PBS洗涤细胞。加入足够的预热（37℃）0.05％胰蛋白酶以覆盖组织培养板的底部。将板放在培养基中ator〜5分钟，直到细胞分离（验证细胞使用光学显微镜漂浮）。使用移液器收集细胞并分配到Falcon管中。 离心以沉淀细胞，并将细胞重悬于含有20％FBS和10％二甲基亚砜（DMSO）的DMEM高葡萄糖培养基中。将等分细胞悬浮液放入冷冻管中，以-1℃/ min冷却至少24小时。将冷冻冻存于液氮中。 2.准备硅胶涂层准备35毫米组织培养板：移除盖子并在平坦的表面上铺开开放的平板。 根据制造商的说明混合硅橡胶套件。 使用10 mL注射器，每35 mm板分配2 mL。 让硅胶在室温下固化2-3天。 3.准备刷石泥水泥锚 提前，准备含有圆柱形的硅胶反模lls用于锚定形成。可以将反模具制成所需锚定形状和尺寸的规格。 确定最终锚的所需高度和直径。该方案使用在35mm组织培养皿中由工艺硅氧烷形成的定制模具，其中放置直径约3.25mm的塑料圆筒，使最终模具高度为约6.5mm。最终锚固尺寸约为3-3.5毫米高，直径约3.4毫米，1.5毫米的针从锚的底部伸出。 将未固化的硅胶添加到将​​要制造模具的35毫米的盘子上。相应地放置塑料瓶。 注意：塑料瓶的尺寸将决定最终锚的直径。可以修改塑料圆柱体的位置和使用的硅酮的量，以产生不同高度的锚。模具中孔的底部和模具本身的底部之间的厚度将d引脚可以从锚的底部突出多少，使得锚固件可以稍后被牢固地固定在有机硅涂覆的盘中。 使硅树脂固化后，取出塑料圆筒，并将模具从35毫米的培养皿中取出。 制备3.5M正磷酸/ 100mM柠檬酸溶液。将0.961g柠檬酸溶解在11.5mL正磷酸中。用MilliQ水将溶液的体积提高至50mL。在室温下储存溶液，防止光照。 准备模具：将一个细小针放在模具中每个圆柱形孔的中心。 在冰上的塑料称重船中，以1μg/ mL浓度将β-磷酸三钙和正磷酸/柠檬酸溶液合并。 用塑料电池刮刀大力混合水泥。 研磨水泥以继续混合并将混合物移入模具中以2,250×g离心填充的模具1分钟。 使水泥凝固锚固体在室温下放置过夜。 从模具中取出锚固件，并在每个有机硅涂层的板上将两个锚定体相隔12毫米。 通过喷洒70％乙醇灭菌钉扎板，填充板和盖子，并放入BSC。至少30分钟后，抽吸板并更换盖子，存放在BSC中直至需要。 4.获得人体血清确保本协议获得了适当的伦理审查委员会的批准。 确保已从人类受试者获得书面知情同意书，以参与将影响血清预期变化的特定干预（ 如运动，食物或药物干预）。在这里，我们描述休息后的收集和抵抗运动后15分钟。 使用训练有素的静脉注射器，通过静脉穿刺从参与者获得静息血液样品到适当的抽空容器中。 </li> 在参与者参与所需的运动方案后15分钟收集运动后血液样本。如前所述1 ，使用本实验中的阻力运动方案来刺激内源性生化反应。 有参与者进行五套腿按压，每组之间休息一分钟。接下来，让参与者连续执行一组膝盖伸展和一组绷带卷曲，不用休息，然后重复背靠背练习三次，每组之间休息1分钟。 在1500 xg离心10分钟之前让血液凝结。在无菌条件下，将血清转移到无菌管中，以备将来的培养基补充（4℃下储存血清）和生化分析（-20℃下储存的少量血清）。 表示工程韧带注意：提前扩展主fi并用固定的刷毛锚定剂制备涂有硅油的板。 准备试剂： 准备凝血酶在DMEM高葡萄糖培养基中溶解牛凝血酶200U / mL。过滤0.22μm，等分，并保存在-20°C。 准备纤维蛋白原在DMEM高葡萄糖培养基中溶解20mg / mL的牛纤维蛋白原。在37°C水浴中孵育3-4小时，每30分钟旋转一次以帮助溶解。过滤器为0.22μm（可能需要多个过滤器），等分，并保存在-20°C。 准备抑肽酶将抑肽酶溶于10mg / mL的水中。过滤0.22μm，等分，并保存在-20°C。 准备氨基己酸。将氨基己酸溶于0.1g / mL的水中。过滤0.22μm，等分，并在4℃下储存。 准备抗坏血酸。将抗坏血酸溶解在浓度为50mM的DMEM高葡萄糖培养基中。过滤器为0.22μm，储存于4°C。 <li>准备L-脯氨酸。将L-脯氨酸溶于PBS中，浓度为50 mM。过滤器为0.22μm，储存于4°C。 准备转化生长因子-β1（TGF-β1）。根据制造商的方向，以10μg/ mL的浓度重建TGF-β1。等分并储存于-20°C。 确定实验所需的结构数量，并确保准备足够数量的固定板。推荐生物和技术重复。在这里突出的研究1中 ，使用重复的技术重复和12个生物重复（来自12个人的静息和运动后的血清）。 注意：在BSC的无菌条件下执行以下步骤。 通过在15cm板培养至70％汇合来扩增细胞。每个构建体需要2.5×10 5个细胞。 胰蛋白酶消化细胞并以3.67×10 3的浓度重悬于GM中5个细胞/ mL。 产生所需结构数量的主混合物：对于1次构建，主混合物含有681μL细胞悬浮液（含2.5×10 5个细胞），29μL凝血酶，2μL抑肽酶和2μL氨基己酸。 混合好主混合物后，以“图8”模式在每个钉扎板上加入714μL的水泥锚固件。确保主混合物直接接触锚的侧面。 轻轻敲击每个平板，将主混合物均匀分布在板上。 一次一片，在一个平板上均匀地快速添加286μL纤维蛋白原，并立即将板向前后移动到BSC的表面上，以分布纤维蛋白原，形成细胞嵌入的纤维蛋白凝胶。继续下一盘。 将构建体置于保持在37℃和5％CO 2的无菌培养箱中并孵育至少15分钟以允许纤维蛋白原聚合。 准备足够的饲料介质（FM），每个构建体2 mL。补充GM与200μM抗坏血酸，50μM脯氨酸和5 ng / mL TGF-β1。 加入2毫升FM覆盖每个构造。在保持37℃和5％CO 2的无菌培养箱中培养构建体总共14天或达到所需的终点，每2天用2mL FM刷新培养基拉伸试验工程胶注意：使用定制的拉伸试验机在PBS浴中进行拉伸试验;耦合到力传感器的反模压手柄在测试期间将挥发性水泥锚固器保持就位。 使用数字卡尺确定韧带结构的长度和宽度;计算组织的横截面面积。 从板上取下韧带结构，并将锚固件放在反向模制夹具，确保构造物浸没在PBS中。 调整把手之间的距离，将构造的长度设置为其初始长度。 开始测试：在0.4 mm / s（或〜3％/ s）的应变速率下将构件变形为失效。 测试完成后，处理组织残留物的胶原蛋白含量（见第7节）。 从合成的载荷 – 变形数据中，计算应力应变数据并量化感兴趣的机械性能;例如，最大拉伸载荷，极限拉伸强度和模量（ 即在应力 – 应变曲线的线性区域上的弹性）。 7.工程胶原胶原含量的定量从黄铁矿水泥锚固件中取出工程韧带，并在120℃下干燥25分钟。 确定构建体的干质量并放入单个1.5 mL管中。干构建体可以在室温下储存直到进一步处理。 向每个构建体加入200μL6 M HCl。在加热块中在120℃下在通风橱中煮沸2小时。 注意：HCl具有高度腐蚀性和酸性，建议使用防爆/安全锁管或其他固定管道的方法。 将管子短暂离心以收集液体，并将其封闭，在通风橱中在加热块中在120℃下蒸发1.5小时。 将所得沉淀重悬于200μL羟脯氨酸缓冲液中。储存于-20°C直到需要。 准备羟脯氨酸缓冲液。在300 mL水中加入16.6 g柠檬酸，4 mL乙酸，11.4 g NaOH，搅拌至溶解。 pH至6-6.5，体积达500 mL。加入250μL甲苯作为防腐剂，保存在4°C，防止光照。 准备试剂。 准备反式-4-羟基-L-脯氨酸。溶解于水中以制成4 mg / mL溶液。 <li>准备氯胺T。溶解于水中制成14.1 mg / mL溶液。 准备醛 – 高氯酸盐。将1.5g 4-二甲基氨基苯甲醛溶于6mL 1-丙醇，2.6mL高氯酸（注意：腐蚀性强，强氧化剂，使用适当的预防措施）和0.5mL水。 在一组新的1.5 mL管中，将每个重悬浮的沉淀物的样品稀释到200μL的羟基脯氨酸缓冲液中。 注意：根据样品预期的胶原蛋白含量，稀释度可以为1:4至1:50的样品：缓冲液。因此可能需要进行一些试验和错误测试来确定适用于给定样品组的稀释因子（即将样品置于标准曲线的中间）。 准备羟脯氨酸标准品。将羟脯氨酸缓冲液中的羟脯氨酸稀释（见7.5.1）至80μg/ mL。进行系列稀释，使0〜20μg/ mL之间的标准品为6-8 200μL。 加入150μL14.1 mg /mL氯胺T溶液，每个标准品和稀释样品。涡旋并在室温下孵育20分钟。 向每个样品和稀释样品中加入150μL醛 – 高氯酸盐溶液。涡旋并在60℃加热块中孵育15分钟。根据当地法规（含有高氯酸）处理过量的高氯酸盐溶液作为危险废物。 允许标准品和样品冷却，等分200μL每份，一式两份，96孔板。 用分光光度计在550 nm读板。根据当地法规（含有高氯酸）处理板和剩余体积在1.5 mL管中作为危险废物。 总胶原蛋白和胶原蛋白分数的计算。 使用羟脯氨酸标准曲线将每个样品的吸光度值转换为微克的羟脯氨酸。 将每个孔乘以2.5，计算羟脯氨酸的含量稀释样品。回想一下，将500μL总混合物（200μL稀释样品+150μL氯胺T+150μLAP溶液）中仅有200μL加入到每个样品孔中。 乘以稀释因子（7.7节）计算原始样品中羟脯氨酸的含量。 除以0.137计算胶原蛋白（假定胶原含有13.7％羟脯氨酸20 ）。 注意：胶原中的哺乳动物羟脯氨酸丰度在组织和哺乳动物物种间略有不同;例如，猪和羊跟腱分别含有13.5和13.7％（羟脯氨酸质量/干组织质量） 21 。在这里，使用13.7％估计胶原蛋白中羟基脯氨酸的百分比，其用于使用以下等式计算组织样品的胶原蛋白含量： 除以干质量计算胶原蛋白并转换成百分比。 8.分子终点的定量注意：除了拉伸试验和胶原蛋白含量的主要结果外，可以在2D或3D组织上测量分子终点，以增加机械性的洞察力。生物测定可以用于确定分子终点（参见下文的上下文）运动后血清环境对体外韧带功能的影响）。 对于3D组织： 按照上述步骤5准备结构。 构建治疗/干预后，在液氮中快速冷冻构建体。 使用在干冰上冷却的砂浆和研杵，将构造物研磨成粉末。继续步骤8.4 / 5）。 对于2D组织： 文化人类ACL成纤维细胞在一个mon汇合在含有DMEM的六孔板中。 吸入DMEM并根据您的实验策略（ 例如时间过程或剂量反应实验）应用治疗培养基。 吸出处理介质并用PBS洗涤细胞。 使用适当的提取缓冲液/试剂刮洗细胞进行收集（见下文）。 蛋白质表达分析：使用胞质提取缓冲液（ 例如 ，250mM蔗糖，50mM Tris pH 7.4,5mM MgCl 2和蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物）以获得蛋白质裂解物。进行蛋白质浓度测定，并根据标准的免疫印迹法继续分析。 基因表达分析：根据制造商的说明书使用500μLRNA分离试剂分离总RNA，以获得高质量的RNA。按照标准程序进行逆转录和实时定量PCR分析。 DNA分离：分离和定量g根据制造商的说明使用DNA分离试剂进行染色体DNA测序。通过使用分光光度计来量化DNA浓度以测量260nm处的样品吸光度。