协议来生成使用iCRISPR平台HPSC突变系和分化hPSCs成葡萄糖反应β样细胞中有描述。结合基因组编辑技术,HPSC-定向分化为血统决定因素在人的发展和疾病发展中的作用的系统分析了强大的平台。
在自我更新和分化的人类多能干细胞(hPSCs)询问基因功能提供了对理解人类的发展和在培养皿中解剖疾病机制的宝贵平台。利用这一潜在的应用需要高效率的基因组编辑工具,以产生在疾病相关基因HPSC的突变体,以及在体外 HPSC分化协议以产生疾病相关的细胞类型紧密概括其在体内的对应。命名iCRISPR为hPSCs一种高效的基因组编辑平台已经通过Cas9表达盒在AAVS1轨迹TALEN介导的靶向开发的。这里,对于使用在化学上确定的培养基和无饲养条件培养的细胞诱导Cas9 HPSC线产生的协议进行了描述。使用iCRISPR系统用于基因敲除或hPSCs精确的遗传改变的详细过程,或者到n上同源末端连接(NHEJ)或通过使用同源性定向修复(HDR)模板精确核苷酸改变分别被包括在内。这些技术程序包括设计,制作的描述,以及CRISPR导的RNA(gRNAs)的转染;通过T7E1或RFLP测定的CRISPR突变率的测量;并建立和克隆突变品系验证。最后,我们纪事程序HPSC分化通过体内胰腺胚胎发育模仿成葡萄糖反应胰岛β细胞样细胞。结合iCRISPR技术和定向分化HPSC使基因功能的系统检查,以进一步推动我们的胰腺发育和糖尿病的发病机制的认识。
人类多能干细胞(hPSCs)有能力既自我更新和产生的三个胚系的衍生。它们由作为一个独特的平台在人类发育上下文概括细胞过程提供用于细胞置换治疗和疾病建模的宝贵资源。它们也是实验电池为可伸缩的,高通量分析的来源。然而,进展有限,因为两个主要挑战:缺乏有效的遗传修饰的工具和在扼要在培养皿复杂胚胎发育的步骤的难度。
基因改良是一个不可缺少的工具来研究正常发育和疾病的基因功能。然而,虽然经典的基因打靶通过同源重组的方法已经被证明是解剖基因功能在小鼠胚胎干细胞(mESCs)的强有力的工具1中 ,这种方法当应用于hPSCs 2,3一直非常低效的。最近从自然到实验室使用可编程的,位点特异性核酸酶,包括锌指核酸酶(ZFN),转录活化剂 – 样效应核酸(TALENS),和群集定期相互间隔短回文重复序列(CRISPR)/ CRISPR相关的轻快加入(CAS)系统4,是指基因组工程已经成为一个广泛的生物和细胞系的一个更容易的任务,包括在hPSCs。这些基因的编辑工具采取的事实,即嵌合核酸酶如Cas9核酸内切酶可以通过诱导在精确的位置双链断裂(DSB的),从而触发内源性DNA修复机制允许遗传修饰的整个范围来激活或者非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)。这两种机制可通过诱导eith被利用基因操纵呃随机插入和缺失突变(插入缺失; 经由 NHEJ),以创建抵消基因的等位基因,或精确的核苷酸取代(通过HDR)移码突变,以概括为人类疾病模型患者突变或以校正用于基因治疗的一个致病突变。
CRISPR / CAS介导的基因组工程需要两个组成部分:必要的DNA裂解和可变CRISPR RNA(crRNA)和反式激活(tracrRNA)双工恒RNA引导Cas9核酸内切酶,指定DNA目标识别。所述crRNA / tracrRNA双工可以用单个嵌合导向的RNA(gRNA),这已经被发现更有效的5,6,7的工作所取代。而CRISPR / Cas9系统已经适应大多数实验生物体和细胞系的Cas9和gRNA显著变化的递送和表达,需要进一步优化,以阿希前夜高效的基因组编辑在很多系统中,包括hPSCs 8。一个高效的基因组编辑平台,iCRISPR,已建立了hPSCs 5。在这个系统中,一个TALEN介导的方法已被用于靶向反式 ,一个等位基因与反向四环素控制式激活(M2rtTA)和其他具有四环素响应元素中的“转基因安全港轨迹”AAVS1的两个等位基因(TRE )驱动Cas9(iCas9在hPSCs的表达式)。在建立无性系(iCas9 hPSCs),Cas9高度用强力霉素治疗表示。同时,由于它的小尺寸(100个核苷酸),单个或多个gRNAs可以容易地输送到iCas9 hPSCs具有高效率和可以直接Cas9位点特异性切割,从而实现高效的NHEJ介导的基因破坏,以及HDR介在短的单链DNA(ssDNA)供体模板的存在下精确核苷酸修饰。该iCRISPR系统可以是用于成功地产生的疾病模仿HPSC线与双等位基因(纯合或杂合化合物)或失功能杂合突变面板中重要发育基因5,9。虽然一些团体已经报道hPSCs使用CRISPR / CAS有效的基因编辑,成功仍然是有限的少数熟练掌握技术实验室。所述iCRISPR平台提供由不同技术水平的研究人员进行常规基因编辑的有效而简单的解决方案,并且它已经在若干由我们的组和其他9,10,11,12日公布的研究中使用。这一做法也得到了进一步延伸到基于dCas9-KRAB 13的表达诱导沉默。
随着基因组编辑TECHNO进度迟缓,显著改进也已经在HPSC维护和定向分化来实现。为hPSCs培养条件从照射小鼠胚胎成纤维细胞(IMEF)馈线依赖上定义的细胞外基质成分无饲养条件,并从复杂培养基配方,以合成培养基条件14发展而来的。这些改进减少了在由于IMEF制备和敲除血清替代品组件批次到批次差异hPSCs的变异性,并且因此提供用于HPSC分化更可再现的环境。同时,改善了信令从高通量药物掩护了人类胚胎发育的途径,以及发现的知识,导致改善分化协议15,16,17,18。这些协议在VIV更加紧密地模仿Ø发展步骤和生成的细胞类型密切概括其在体内的同行。对于HPSC分化为胰腺谱系,初步协议模仿早期胰腺发育相对完善,但最终产生的不成熟胎儿的表型和不良反应,以葡萄糖刺激polyhormonalβ细胞。最近的进步16,17,19,20已经允许葡萄糖反应胰岛β细胞样细胞,这将使我们能够调查后的事件,诸如形成和monohormonalβ细胞的进一步成熟的产生。
在这里,我们详细介绍了胰腺发育的研究基因组修饰的线条由iCRISPR系统与基于HPSC- 体外分化平台对葡萄糖响应pancr结合应用eaticβ样细胞。强大的基因组编辑工具具有改进的HPSC分化协议这种耦合不仅提供必要的速度和规模,以满足验证疾病的因果关系的不断增长的需求,同时也能够为进一步的机理调查转录调控的正常发育和疾病9背后复杂的遗传操作。
为了产生突变系时间注意事项
虽然基于基因组编辑CRISPR / CAS系统的最新方法已经导致了成功定位,更有效和通用平台将是可取的大规模基因功能进行了分析。该iCRISPR平台提供了一个快速,高效的方法来引入突变感兴趣5,9任何基因。第一,基于PCR的gRNA合成方法允许在不耗时的克隆步骤生产数百gRNAs的排列格式在一天的。其次,随着iCas9 hPSCs强力霉素诱导Cas9表达,涉及gRNA转染的步骤仅需要工作的最小量,因此,多gRNA靶向实验可以同时进行。第三,由于高的定位效率可达到与我们的系统,分析〜24 – 每gRNA转染48菌落应SUFF虽然效率取决于目标轨迹icient建立多个单等位基因和双等位基因突变系为一单个基因。由于它是可行的受过训练的个体以机械地挑384菌落(4×96孔板)在一个坐位,其中应考虑在解剖显微镜下〜4小时,经过培训的个人可以预期产生影响内12个基因突变系12个月。在很短的时间内流线型代HPSC突变体允许对与彼此交互,调节发育进程9的转录因子和/或信号传导途径组分的阵列的系统的分析。此外,有效的复用基因打靶也打开大门,调查遗传相互作用底层复杂的人类特征。
精确的遗传修饰的生成
特定病人的iPS细胞,从方便体细胞类型推导 S和分化为疾病相关的细胞类型提供疾病相关的基因突变的功能验证的大好机会。然而,由于在个体之间的遗传背景的相当大的可变性,从患者的iPSC之间和来自健康供体的直接比较可能不允许一个从背景效果区分疾病表型。因此,有必要通过校正所述疾病突变回野生型序列以产生同基因控制的iPSC或引入患者特异性突变引入野生型HPSC背景,提出了由他人25,26。除了失功能(空)的突变,人们现在可以更精确地通过引入患者特异性序列改变的解剖疾病机制成hPSCs内源性基因座,包括hypermorphic,亚效等位基因,neomorphic,或显性负患者突变。
ntent“>精确遗传修饰以修复模板的存在下使用的HDR为DSB修复,由于它是有效得多小于NHEJ介导的DNA修复,含有该特定病人的突变,一个药物选择盒和同源臂的供体的质粒先前已用作修复模板2。药物筛选和患者特异性突变的验证后,一般需要第二步骤以除去药物选择盒。尽管使用最广泛的Cre-loxP序列和FLP-FRT系统留下内源性基因座残余序列,使用转座子piggyBac的已经允许无缝除去药物选择盒27的。最近,短的ssDNA模板也已经显示,以支持高效的HDR与工程改造的DNA内切核酸酶28,相对于一个供体的质粒,单链DNA可以直接合成,从而绕过费时克隆步骤,在这里,它具有可烯表明,通过共转染gRNA和一个单链DNA模板以诱导同源定向修复,iCRISPR可用于引入以高效率特异性核苷酸修饰。这不仅对于解剖必需核苷酸的蛋白功能域内的作用,而且还用于模拟人类疾病的突变和潜在校正干预治疗这些疾病相关的突变的关键。由于大量的易感性基因座即各自与多个序列变体相关联,造型复杂和多基因疾病,如糖尿病一直遗传学家一个挑战。作为iCRISPR平台是允许的用于快速产生的等位基因系列或multiplexable基因打靶,它可以促进多种疾病相关的基因座的调查,无论是单独或与同基因背景的组合。瞄准效率和脱靶效应
我们有发现T7E1和RFLP分析结果和通过测序鉴定突变体线的数目之间的良好的相关性。这强调平行设立的无性系进行这些试验的重要性。而获得可根据基因组位点有所不同,在大多数的单基因靶向实验靶向效率,20 -克隆的60%的被发现与两个等位基因的突变(包括在帧和移码突变)9。在被执行多重基因打靶的情况下,获得了5 5-10%的效率三重双等位基因突变克隆。还进行了几个基因的单链DNA介导的HDR,以获得精确的遗传变异,具有纯合子获得敲的克隆,从1的效率- 10%5。在不共享同一gRNA靶序列潜在的脱靶部位在hPSCs与CRISPR / CAS工作,任何突变尚未被检测小姑娘=“外部参照”> 5,9,12。在最近的研究中进行全基因组测序也未能识别克隆HPSC线大幅偏离目标突变使用CRISPR / CAS 29产生的。然而,为了最大限度地减少混淆通过在脱靶效应位点突变引入表型的任何潜在的影响,建议以产生使用至少两个独立gRNAs相同基因内靶向不同序列的独立突变品系。使用不同gRNAs可以主要排除表型来自一个脱靶效应的可能性产生的多行观察到类似的表型。
馈线依赖与独立的文化和目标
对于HPSC文化传统的方法涉及其在含血清或血清替代品,包括动物督促媒体在饲养层细胞的维护和扩展UCTS,如牛血清白蛋白。饲养细胞,血清,血浆置换,以及白蛋白都含有复杂的,不确定的成分和表现出相当一批变异。适应无饲养和化学成分确定的条件显著减少HPSC维护和,更重要的是,增加的分化实验的一致性的努力。目前,这里并没有描述在完全定义的培养条件下培养30基因组hPSCs编辑过程很少有研究。我们发现CRISPR较高时gRNA转染和克隆沉积是在无饲养条件相比,馈线相关的培养条件进行靶向效率。我们认为,这是由于转染和单细胞接种于集落形成后增加的细胞存活。此外,饲养细胞先前已经显示出螯合转染试剂,从而降低了转染效率。
结合基因组编辑与定向分化
以前分化协议已经仅产生胰岛素阳性细胞的一小部分,其中大部分是polyhormonal和类似胎儿内分泌细胞23。最近的进展已经允许hPSCs分化成更成熟葡萄糖反应β样细胞16,17,19,20。我们可以经常获得至少75%的定形内胚层细胞中,40%的PDX1 + NKX6.1 +胰祖细胞,并在20%左右NKX6.1 + CPEP +葡萄糖反应β样细胞使用HUES8 hPSCs 9。当与iCRISPR基因组编辑系统相结合,这更强大的分化方案促进了转录因子是胰腺分化的胰腺祖和内分泌阶段至关重要的分析。这将使它可能,在今后的研究,以检查大量的候选疾病基因的功能验证和调查背后糖尿病9的机制。
未来的应用方向或
我们的iCRISPR系统可以便于更复杂的基因组修饰,如通过建立记者等位基因的产生HDR介导的基因使用长供体的DNA模板编码蛋白质标签或荧光报告12定位。我们已经表明的是,由于高CRISPR定位系统中获得的效率,这个过程可以在hPSCs来执行,而不需要进一步的药物选择12。此外,复用基因打靶,可以用来研究基因相互作用的潜在复杂的人类疾病,如在我们最近的研究,我们认为这是此类工作31的第一个例子。 ICRISPR也可用于通过创建缺失或在非编码RNA或基因的调节区,如启动子和增强理解基因调节控制。使用iCRISPR有效地产生调节突变体,gRNAs可被设计为破坏的DNA结合蛋白的结合位点,包括但不限于基础转录机制或组织特异性转录因子。单链DNA模板介导的HDR还可以用于改动特定的蛋白质结合位点。最后,我们设想,当与体外分化方案合并进一步优化将使利用iCRISPR平台hPSCs的多能性表型或疾病表型的更高的通量遗传分析。这些iCRISPR介导的研究可以允许的候选疾病相关基因及其功能相关的研究的更快速鉴定。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由美国国立卫生研究院/ NIDDK(R01DK096239)和纽约州干细胞科学(NYSTEM C029156)部分资助。 ZZ被从中心NYSTEM博士后研究的斯隆凯特林研究所干细胞生物学的支持。
Chemically defined medium (E8) | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included |
Truncated recombinant human form of vitronectin | Thermo Fisher Scientific | A14700 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563029 | 1X, animal origin free, recombinant enzyme |
G418 Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | Geneticin Selective Antibiotic |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | Puromycin Selective Antibiotic |
DNA Polymerase (Herculase II Fusion) | Agilent Technologies | 600679 | PCR kit |
MEGAshortscript T7 Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1354 | |
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
Opti-MEM medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Reduced Serum Medium |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778150 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | QIAGEN | 69504 | Genomic DNA extraction kit |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
MCDB 131 medium | Thermo Fisher Scientific | 10372-019 | |
BLAR medium | Thermo Fisher Scientific | Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014) | |
L-glutamine supplement (GlutaMAX) | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
NaHCO3 | Thermo Fisher Scientific | 144-55-8 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
BSA | LAMPIRE Biological Laboratories | 7500855 | Fatty acid free |
GDF8 | PeproTech | 120-00 | |
CHIR-99021 | Stemgent | 04-0004 | GSK-3 inhibitor |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Vitamin C |
FGF7 | R&D Systems | 251-KG | |
SANT1 | Tocris Bioscience | 1974 | Hedgehog inhibitor |
RA | Sigma-Aldrich | R2625 | Retinoic acid |
LDN | Stemgent | 04-0019 | BMP inhibitor |
IWP-2 | Tocris Bioscience | 3533 | Wnt antagonist |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | |
TPB | EMD Millipore | 565740-1MG | PKC activator |
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
ALK5i II | Enzo Life Sciences | ALX-270-445 | ALK5 inhibitor II |
ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
GSiXX | EMD Millipore | 565789 | Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor |
N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Trolox | EMD Millipore | 648471 | Vitamin E analogue |
R428 | Selleck Chemicals | S2841 | AXL receptor tyrosine kinase inhibitor |
24mm Transwell with insert | Corning Life Sciences | 3414 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | |
0.4 cm Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652081 | |
AAVS1-TALEN-L | Addgene | 59025 | |
AAVS1-TALEN-R | Addgene | 59026 | |
AAVS1-Neo-M2rtTA | Addgene | 60843 | |
AAVS1-Puro-iCas9 | Addgene | 58409 | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302L | |
Buffer 2 | NEB | B7002S | NEBuffer 2 |
Long oligonucleotide | Eton Bioscience or IDT | ||
SOX17 antibody | R&D Systems | AF1924 | 1: 500 |
FOXA2 antibody | Millipore | 07-633 | 1: 100 |
CXCR4-APC antibody | R&D Systems | FAB170A | 1: 25 |
PDX1 antibody | R&D Systems | AF2419 | 1: 500 |
NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12 | 1: 500 |
NKX2.2 antibody | DSHB | 74.5A5 | 1: 100 |
NEUROD1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1084 | 1: 100 |
Insulin antibody | Dako | A0564 | 1: 2000 |
C-peptide antibody | DSHB | GN-ID4-c | 1: 2000 |
Glucagon antibody | Sigma-Aldrich | G2654 | 1: 1000 |