Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoi: raccolta, crioconservazione e fecondazione In Vitro eterologa
Summary
Qui, presentiamo i protocolli che sono stati utilizzati con successo per la collezione di spermatozoi di dolphin, crioconservazione e prestazioni di FIVET eterologa usando i oocytes bovina.
Abstract
L’uso degli spermatozoi crioconservati delfino facilita lo scambio di materiale genetico tra parchi acquatici e rende gli spermatozoi accessibile ai laboratori per studi per avanzare la nostra comprensione della riproduzione di mammiferi marini. FIVET eterologa, un sostituto per la FIVET omologa, potrebbe fornire un mezzo per testare la fertilità dello sperma potenziali; per studiare la fisiologia dei gameti e sviluppo iniziale dell’embrione; e per evitare l’uso di ovociti prezioso dei delfini, che sono difficili da ottenere. Qui, presentiamo i protocolli che sono stati utilizzati con successo per raccogliere e crioconservare gli spermatozoi delfino. La raccolta di sperma viene eseguita da stimolazione manuale su delfini addestrati. Crioconservazione avviene utilizzando un extender di tuorlo d’uovo basata TRIS con glicerolo. Inoltre, vi presentiamo un protocollo che descrive la FIVET eterologa utilizzando delfino gli spermatozoi e gli ovociti bovini e che verifica la natura ibrida dell’embrione risultante usando la PCR. Fecondazione eterologa solleva interrogativi sulla fecondazione e può essere utilizzata come strumento per studiare la fisiologia dei gameti e sviluppo iniziale dell’embrione. Inoltre, il successo della FIVET eterologa dimostra il potenziale di questa tecnica per testare le capacità, che vale la pena di ulteriore esame di fecondante dello spermatozoo di delfino.
Introduction
Tecnologie di riproduzione assistita sono scarsamente sviluppate negli animali selvatici, tra cui mammiferi marini. La mancanza di metodi sensibili per valutare il successo di fertilizzazione dello sperma contribuisce allo sviluppo lento delle tecnologie riproduttive in specie come il delfino. Non era fino a poco tempo che il base parametri seminali di tursiope (Tursiops truncatus) sono stati segnalati1,2. Tuttavia, le variabili come motilità e morfologia, sebbene ampiamente usato, dare informazioni limitate sull’efficienza riproduttiva. Il migliore indicatore della qualità dello sperma è la valutazione del potenziale fecondante.
Recentemente, il nostro gruppo ha utilizzato un metodo per valutare sperma delfino potenziale di fertilizzazione valutando formazione pronuclei maschile e/o formazione dell’embrione ibrido dopo FIVET eterologa utilizzando ovociti bovina intatta zona3. L’uso della FIVET eterologa delfino-bovino ha importanti vantaggi rispetto alle FIVET omologa, come supera la difficoltà di ottenere ovociti delfino e facilita l’uso dei sistemi di maturazione ben testati in vitro degli ovociti bovini. Al fine di evitare la specificità di specie, la fecondazione eterologa è generalmente svolta in assenza di ZP. Anche se esso consente per la valutazione della capacità degli spermatozoi ha reagito acrosomiale di fondersi con la membrana vitellina, si altera la valutazione di altre caratteristiche legate alla fertilizzazione. La procedura descritta utilizza zona intatta ovociti e permette la valutazione dei seguenti parametri: associazione di zona di sperma e allegato, penetrazione, gamete, formazione pronuclei e fenditura dell’embrione ibrido.
Qui, presentiamo diversi protocolli per la raccolta dello sperma, sperma base analisi, congelamento di spermatozoi così come la valutazione della funzionalità degli spermatozoi delfino valutando formazione maschile dell’embrione di pronuclei e/o ibrido dopo FIVET eterologa utilizzando zona intatta ovociti bovini.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per molte diverse specie di mammiferi, ci sono diversi vantaggi nell’utilizzo di spermatozoi congelati. Questi includono la capacità di trasferire il prezioso materiale genetico, il potenziale per la distribuzione in tutto il mondo, il basso rischio di contaminazione e la capacità di conservare i gameti maschili per decenni. L’utilizzo di spermatozoi crioconservati è essenziale per il tursiope, perché questa specie è protetta in appendice II della CITES, che limita il trasporto e lo scambio di animali tra diversi pa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
il suo lavoro è stato finanziato dal Ministero spagnolo dell’economia e competitività (AGL2015-70140-R a D. Rizos), AGL2015-66145R a A. Gutierrez-Adan e J.p. F. Pérez-Gutiérrez · e Seneca Foundation di Murcia (Grant 20040/GERM/16 a F. García-Vázquez)
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
