JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Быстрое Количественное митоген-индуцированной бластогенеза в Т-лимфоцитах для идентификации иммуномодулирующих препаратов

Published: December 27, 2016
doi:
10.3791/55212
, , ,
1Department of Neuroscience, Cell Biology and Physiology, Boonshoft School of Medicine,Wright State University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Boonshoft School of Medicine,Wright State University

Summary

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

Abstract

Лимфоцит пролиферации в ответ на антигенные или митогенная стимуляция представляет собой легко количественному явление полезно для тестирования иммуномодулирующих (т.е. иммуносупрессивной или иммуностимулирующее) химических соединений и биопрепаратов. Одним из первых шагов в митогенеза является увеличение клеток или зародышевый трансформация, в результате чего увеличивается объем ячейки перед делением. Это, как правило, обнаруживается в течение первых нескольких часов, Т-лимфоцитов-стимуляции. Здесь мы опишем быстрый метод количественного бластогенез в Т-лимфоцитов, выделенных из селезенки мышей и мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС) с использованием автоматического счетчика клеток. Различные часто используемые анализы пролиферации по большей части являются трудоемкими и отражают лишь общий эффект населения, а не отдельные клеточные эффекты внутри популяции. В отличие от этого, представлены автоматизированный счетчик клеток анализ обеспечивает быстрое, прямые и точные измерения диаметров клетки, которые могут бытьиспользуется для оценки эффективности различных митогены и иммуномодулирующих препаратов в лабораторных условиях .

Introduction

Т-лимфоциты являются первичные клетки, ответственные за адаптивного иммунитета у млекопитающих. Известно, что они реагируют на конкретные антигенных пептидов, представленных молекулами МНС на поверхности антиген-представляющих клеток. При активации родственным Т-клеточного рецептора (TCR), клетка расширяется в процесс называется зародышевый преобразования или бластогенез. Этот процесс может быть обнаружено в первом ~ 6 ч после стимул применяется 1. Во время бластогенеза, объемы отдельных Т – клеток увеличивают до 2- 4 раза 2-6. Лимфоциты начинают размножаться в процессе, называемом клональной экспансии, целью которого является создание, как многие клоны антиген-специфичных TCR-клеток, несущих, как это возможно. Потомство клетки затем проявляют свою иммунологическую функцию, дифференцироваться в цитотоксических (CD8 +) или помощника (CD4 +) эффекторных Т – лимфоцитов. Таким образом, наивные Т – лимфоциты человека или мыши крови находятся в фазе G 0 (покоя) клеткицикл и поддержка минимальна метаболическая активность. Под воздействием антигенов или митогенами, Т – клетки повторно ввести клеточного цикла с сопутствующим стимуляции транскрипции и белкового синтеза 7-10. Митогены, такие как форбол 12-миристат – 13-ацетата (РМА) и иономицином стимулируют лимфоциты через активацию протеинкиназы С (ПКС) и Са 2+ -зависимые сигнальных путей 1. Активацию Т-клеток ФМА / иономицином минует сигнализации шаги TCR.

В пробирке анализа пролиферации широко используются для целей оценки функции лимфоцитов и реакции на раздражители. Показания пролиферации, как правило, принимаются от одного до трех дней после начала стимуляции Т-клеток и отражают коллективное состояние сотен или тысяч клеток. Эффективность различных митогены и иммуномодулирующих препаратов в пробирке может быть оценена простым измерением скорости пролиферации в присутствии этих соединений. Некоторые из них вssays и их ограничения обсуждаются ниже.

Для подсчета прямой номер ячейки, процедура отнимает много времени, с высокой вероятностью ошибок оператора.

Для синтеза ДНК-3Н-тимидина анализ измеряет синтез ДНК, но его главным ограничением является его радиотоксичность. Нерадиоактивного альтернатива BrdU, но диапазон линейного отклика для роста клеток ограничено, и требуется лечение антителом, которое увеличивает количество шагов в процедуре 11,12.

Для метаболической активности солей тетразолия (МТТ, МТС, ХТТ и WST-1) и резазурин на основе красителя, колориметрические анализы сообщают общее метаболическое состояние деления клеточных популяций. Тем не менее, МТТ не растворим в культуральной среде, что требует дополнительных шагов стирки, таким образом, включение ошибок в измерении; ХТТ необходимы дополнительные компоненты для эффективного уменьшения; MTS-, WST-1- и измерения резазурин основе являются влияютред культурой рН среды и ее компонентов сыворотки, альбумин или фенола красного 13-16. Эти анализы не измеряют фактическое количество жизнеспособных клеток, а сами оценить объединенные активности ферментов. Таким образом, скорость пролиферации может не быть точно определено с помощью метаболических анализов из – за нелинейной корреляции между числом клеток и уменьшение красителя 12,17.

Для измерения концентрации АТФ, Т-клеток активации увеличение вызванных АТФ коррелирует с пролиферацией. Тем не менее, повышение концентрации АТФ в клетке является одним из первых шагов активации Т-клеток; много шагов за фактическое распространение 17,18.

Для разбавления красителя анализа, CFSE флуоресцентный краситель окрашивает клетки путем ковалентного связывания с внутриклеточными белками. Краситель показывает пролиферацию зависит уменьшение интенсивности флуоресценции, которая может отслеживать количество клеточных делений. Однако из-за ковалентного мечения белков, функции этихбелки могут быть поставлена ​​под угрозу. Краситель является токсичным для клеток при более высоких концентрациях. При более низких концентрациях красителя, тем не менее, начальная интенсивность флуоресценции снижается, уменьшая количество клеточных делений, которые могут быть отслежены. Кроме того, после того, как маркировка с CFSE, существует пролиферация независимый от ~ потеря 50% от исходной флуоресценции в период первой 24 до 48 ч, что ограничивает динамический диапазон этого анализа 19,20.

Большинство из этих анализов отражают коллективное состояние большого числа клеток и требуют обработки клеток с флуоресцентными красителями. Некротические и апоптотических клеток также могут внести свой вклад в эти измерения, если они не будут удалены из анализа с помощью окрашивания химическими веществами или антителами.

Лимфоцит бластогенеза может быть оценена различными методами, такими как оптическая микроскопия или проточной цитометрии 4,21,22. Здесь мы описываем быстрый метод для измерения размеров Т-клеток с использованиемп автоматического счетчика клеток, который собирает изображения в режиме реального времени ячейки, которые хранятся и могут быть повторно проанализированы в более позднее время. В дополнение к измерениям размера, это устройство обеспечивает точное количество клеток и процент жизнеспособных клеток, как определено трипанового синего красителя. Устройство, используемое в данном протоколе является коммерчески доступным, и производитель протестировали точность прибора с использованием трех различных инструментов и несколько концентрации и жизнеспособности управления. Результаты этих исследований показали, коэффициент дисперсии, что в целом было ниже 6%. Как отмечено в протоколе, устройство калибруют на регулярной основе с 6 до 8 мкм, полистирола диаметром бусин. Преимущества использования счетчика клеток дифференцироваться между покоящихся Т-клеток и Т-лимфобластов на основе диаметра клеток является простота использования и автоматизированный характер анализа. Программное обеспечение может рисовать круг вокруг каждой ячейки и расчета диаметра ячейки. Кроме того, имвозрасты видны оператору, который может проверить точность прибора в идентификации клеток и правильно рисовать круг вокруг них. С точки зрения ограничений, прибор сам по себе не может различать мусора и клеток; Поэтому, важно, чтобы оператор видит каждое изображение, оно обрабатывается. Существует потенциал для включения пузырьков воздуха, что позволит уменьшить число используемых полей для анализа; Тем не менее, это случается редко, если выполняется регулярное техническое обслуживание смыва.

В этом исследовании группы селезеночных Т-лимфоциты были стимулированы иономицина и возрастающими концентрациями РМА в течение 12-48 ч. Концентрации PMA, как низко как 2 нг / мл, индуцированной как надежной зародышевый реакции и значительного распространения. Измерения воздействия нескольких препаратов, таких как иммунодепрессанты циклоспорин А (CsA), FK506 (такролимус), и рапамицин (сиролимус), а также блокаторы ионных каналов трамвайно-34 и FTY720 (fingoliмод), на бластогенеза продемонстрировали хорошее согласие с сообщенных эффектами на пролиферацию. Зародышевый реакция человеческих МКПК на ФМК / Ionomycin и мышиный стимуляции Т-клеток анти-CD3 и анти-CD28-антитело покрытием магнитных шариков также были измерены.

Счетчик клеток анализ квантифицирует как бластогенезу и скорость пролиферации (плотность ячеек) одновременно, но раздельно, в отличие от вышеуказанных способов, которые выглядят на комбинации этих эффектов. Представленный протокол обеспечивает быстрый и надежный метод для оценки потенции митогенных и иммуномодулирующих агентов.

Protocol

Все эксперименты проводятся в соответствии с протоколами, утвержденными Советом Райт государственный университет Лаборатория по уходу за животными и использование комитета и организационного обзора. Примечание: Человеческие РВМС выделяют с помощью градиента плотности методом центрифугирования Ficoll 5. 1. Селезенка Урожай Дом для взрослых самок мышей ICR в стандартных лабораторных условиях с пищей, водой, а также требования к напластования , характерные для данного вида. ПРИМЕЧАНИЕ: Животные имели средний возраст 2,9 месяцев и средний вес 30,4 г во время эвтаназии. На дату изоляции (DOI), эвтаназии животных по отдельности без других конспецифичных присутствующих животных. Прилагать все усилия для обеспечения минимального напряжения на мышь. Эвтаназии использованием CO 2 с вторичным смещением шейных позвонков , чтобы обеспечить смерть. Место животное, все еще внутри переноса клетки, в CO 2 камеры и ГНАк.т. поток газа на 5 л / мин. Эта скорость потока вытесняет кислород в рекомендуемой 10-30% в мин. После того , как животное находится в бессознательном состоянии , увеличивают скорость потока СО 2 до 15 л / мин. Проверьте животное для остановки дыхания и оставить в камере еще в течение 2 мин. Применить шейки дислокации с отвлечение силой, чтобы обеспечить смерть. Урожай селезенки от животного с помощью асептической техники в течение 10 мин смерти. Стерилизация два набора ножниц и щипцов для удаления селезенки в автоклаве печи перед использованием. Стерилизовать поверхность рассечение с применением 70% этанола. Применяют 70% этанола в брюшной полости мыши. Используя один набор ножниц и щипцов, сделать разрез в меха и кожи с левой стороны живота, а затем растащить и отогните кожу, чтобы раскрыть брюшины. После того, как подвергаются, применять 4% раствор хлоргексидина перед открытием брюшины. С помощью второго набора ТСМssors и пинцетом, сделать 2- до 3-х см разрез вдоль центральной части живота. Откройте брюшины и удалить селезенку путем срезания висцеральные вложений и лишний жир. Поместите селезенку в фосфатно-буферном солевом растворе Дульбекко (DPBS). 2. Подготовка сырья спленоцитах Примечание: Выполните все шаги, под шкафом ламинарного потока биологической безопасности с использованием асептической техники. Замочите заготовленные селезенок в 10 мл деионизованной стерильной H 2 O в течение 5 мин в культуральной чашке 10 см , чтобы лизировать поверхности эритроцитов. Примечание: Этот шаг может быть пропущен, если селезенка была повреждена во время изоляции. Для того, чтобы освободить спленоцитов, раздавить селезенке между двумя стерилизованных стеклянных пластинках (матовое сторона, обращенная к селезенка) над свежей 10 см культуры блюдо. Смешать с 10 мл RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 50 МЕ / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина (именуемыми кс полной RPMI). Фильтр клетки через стерильный 40 мкм нейлоновый клеточный фильтр в новый 10 см культуры блюдо, чтобы удалить соединительную ткань и мусор. Лизировать оставшиеся эритроцитах путем добавления 20 мл буфера для лизиса эритроцитов , состоящий из 155 мМ NH 4 Cl, 10 мМ NaHCO 3, и 0,1 мМ ЭДТА при рН 7,4 и ~ 300 мОсм / л. Примечание: Осмолярность измеряют с помощью точки замерзания или осмометре давления паров. Передача клетки от 10 см пластины в 50 мл коническую пробирку и центрифугируют при 250 х г в течение 10 мин (4 ° С). Удалить супернатант, добавить 20 мл буфера для лизиса эритроцитов, и вновь приостановить Осажденные клетки пипетированием. Инкубируют при комнатной температуре в буфере для лизиса, в течение 10 мин при осторожном покачиванием. Центрифуга в течение 10 мин при 250 х г (4 ° C) для осаждения клеток. Слейте буфер для лизиса. Повторное приостановить клеток в 10 мл полной среды RPMI и центрифуга снова (250 XG, 10 мин, 4 ° С). дискARD супернатант. Повторное приостановить спленоцитов в 2 мл полной среды RPMI нагревают до 37 ° С, для передачи в колонну нейлона шерстяного волокна. 3. Очистка Т-лимфоцитами Мытье колонки нейлон шерсть дважды 5 мл полной среды RPMI. Инкубируют при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе для культивирования клеток в течение 1 ч с. Примечание: Необходимо, чтобы держать нейлоновую шерсть мокрой на протяжении всего эксперимента и использовать полную среду RPMI нагревают до 37 ° С в течение всех стадий выделения нейлон шерсть. Добавить изолированные спленоцитов на колонку и инкубировали в течение 1 часа , чтобы дать В – клетки, фибробласты, и вспомогательные клетки прилипать к нейлоновой шерстью. Добавляют 2 мл среды RPMI, содержащих спленоцитов в колонну и проходит через до верхней нейлоновой шерсти пока не будет достигнута. Добавляют 2 мл полной среды RPMI нагревают до 37 ° С в верхней части нейлоновой шерстью и проходят среды через шерстьпока уровень жидкости не достигнет верхней поверхности. Добавьте 3 мл теплой полной среде RPMI в колонну, чтобы полностью покрыть нейлоновой шерстью. Выдержите загруженную колонку ненарушенных в 37 ° C, 5% CO 2 инкубатор для культивирования клеток в течение 1 часа. Элюируйте клетки путем промывания колонки дважды 5 мл полной среды RPMI. Выполните дополнительную промывку элюированного клеток центрифугированием. Заполните колонку к началу 2 раза с полной RPMI и дайте раствору в колонке через стечь в 50 мл стерильного коническую трубку. Примечание: Избегайте разговоров или натыкаясь колонки, которые могут смещаться В-клетки, вспомогательные клетки, фибробласты и прилипшие к нейлоновой шерсти. Собирают фракцию проточные и спина при 250 х г в течение 10 мин (4 ° С) для осаждения клеток. Промывают один раз 10 мл полной среды RPMI. Гранул клетки снова (250 мкг, 10 мин, 4 ° С) и повторно приостанавливать в 2 мл полной среды RPMI. Измерьте гр Плотность ELL с помощью гемоцитометра и развести в полной среде RPMI до 0,5 × 10 6 клеток / мл. Семенной 1 или 2 мл аликвоты клеток в каждую лунку 24- или 6-луночный планшет для культивирования, соответственно, и культивирования клеток при 37 ° С с 5% CO 2. Примечание: 1 мМ 1,4-дитиотреитола (DTT), могут быть добавлены в каждую лунку на данном этапе, чтобы улучшить выживаемость Т-клеток. Дополнительно: Подтверждение эффективности протокола изоляции с помощью проточной цитометрии. Этот протокол обычно дает ~ 80% Т – лимфоциты 23. Примечание: Нейлон шерсть очищенные клетки содержат приблизительно 50% CD4 + и 23% CD8 + клеток. Для очистки CD4 + и CD8 + субпопуляций далее, один шаг иммуномагнитный истощение может быть выполнено с использованием антител и восемь магнитных шариков 24. В качестве альтернативы, более чистым CD4 + и популяции Т-клеток CD8 + , могут быть выделены путем позитивного или негативного отбора со специфическими антителами. _title "> 4. Активация Т-лимфоцитами и экспериментальной воздействия наркотиков Активация Т – лимфоцитов в течение 24 часов изоляции путем добавления ФМА и иономицином соли кальция или магнитных шариков , покрытых анти-CD3 и анти-CD28 антителами , 23,25,26. Добавить экспериментальные препараты (например, CsA, FK506, рапамицин, трамвайно-34, и FTY720) в момент активации. Примечание: В данном случае концентрация РМА варьировалась от 2-х до 250 нг / мл, а концентрация иономицин выдерживали при 250 нм. Если это возможно, их разбавленные быть получены из запаса аликвоты каждого лекарственного средства таким образом, чтобы объем добавили в каждую лунку клеток ≥1 мкл для обеспечения воспроизводимости результатов. Анти-CD3 / анти-CD28, покрытые магнитные гранулы добавляют в соотношении 1: 1 шарик к клетке. Увеличение количества шариков на клетку (то есть отношение шарик к клетке) будет увеличивать интенсивность стимуляции 25,26. Шарики промывают и повторно суспендировали в полной среде RPMI перед их добавлением к клеткам. Обратите внимание, что Трипановыйсиний пятна бисер. Культуры клеток в течение 12-72 ч при 37 ° С с 5% СО 2 перед анализом с автоматического счетчика клеток. 5. Автоматизированная Cell Сбор данных счетчика Перед запуском образца, убедитесь , что клетки осторожно смешивают с серологической пипеткой , чтобы избежать комков. Это особенно важно для активированных лимфоцитов из – за их повышенной липкостью. Для культур, которые активируются с анти-CD3 / CD28 бусинок, после того, как пипеткой, перенести образец в центрифужную пробирку на 1,5 мл или 2 мл. Отдельные бусины, держа трубку на магнит в течение 1-2 мин. Используйте супернатант, содержащий клетки для анализа. Примечание: анализировать как покоящиеся и активированные клетки в течение 1 часа, чтобы объяснить какой-либо предварительной активации покоящихся клеток сыворотки, присутствующей в культуральной среде. Через 12 ч РМА / иономицин стимуляции, небольшое увеличение размеров клеток был обнаружен (рис 2 </сильный>). Через 72 ч, никакого значительного размера ячейки увеличение по сравнению с не наблюдалось через 48 часов (данные не показаны). Передача 1 мл клеточной суспензии в чашку для образца и запустить его через автоматизированный счетчик клеток в соответствии с инструкциями , приведенными в руководстве. Примечание: Для каждого из испытаний, как минимум 1 мл (не более 2 мл) клеточной культуры должны быть использованы. Автоматизированный счетчик клеток использует шприц для смешивания трипанового синего с клеточной суспензии и проходит клеточную трипанового синего смесь над полем, которое изображаемого и анализируют с помощью программного обеспечения. Программное обеспечение обнаруживает трипанового синего окрашенных клеток, рисует круг вокруг каждой ячейки, и определяет диаметр. 100 изображений собраны из каждого образца, и жизнеспособность клеток и размеры определяются. Порог обнаружения счетчика клеток, используемых здесь, имеет нижний предел 5 мкм. Передача данных с каждого запуска в электронную таблицу для дальнейшего анализа. Калибровка устройства на регулярной основе с использованием 1мл образца 6 до 8 мкм полистирольных диаметр бусин. Примечание: Фактические размеры бортов, измеренные изготовителем для каждой партии должны быть использованы, а не номинальный размер. 6 и 8 мкм шарики удобны , так как эти диаметры близки к ожидаемым диаметрами отдыха и активированных Т – клеток (рисунок 1). 6. Данные и статистический анализ Анализ данных с использованием соответствующих статистических и графическое программное обеспечение. Примечание: таблица для каждого прогона содержит число клеток с каждого диаметра (диапазон: от 5 мкм до 70 мкм). Клетки выше диаметром 17 мкм удаляются из анализа, чтобы исключить частицы пыли и мелкие пузырьки, которые могут быть считаны в качестве жизнеспособных клеток с помощью прибора. Выполнение проверки гипотез с помощью Т-тест Уэлча для наборов данных с неравной дисперсией; Результаты считаются статистически значимыми при р <0,001. Формула была использована, <imг альт = "Уравнение 1" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 55212 / 55212eq1.jpg" /> где а также приведены в качестве примера средства, а также приведены примеры отклонения, и а также примерные размеры для каждого набора данных. Число степеней свободы консервативно оценивается с использованием меньшего из двух размеров выборок для каждого сравнения. Гистограммы представлены как среднее ± SEM. 7. Splenic Т-лимфоцитов Анализ пролиферации Измерьте пролиферацию Т-клеток с помощью MTS- или колориметрический пластины анализа пролиферации МТТ-ридер на основе. Примечание: Анализ является базойd на тетразолия соединения MTS (реагент Оуэна) сокращения растворимого продукта формазана, вероятно, с помощью НАДФН или НАДН производства в метаболически активных клетках ферментов дегидрогеназы. Количество очищенных Т – клеток с помощью гемоцитометра и повторно приостанавливать их в полной среде RPMI-1640 при конечной плотности 1 х 10 6 клеток / мл. Примечание: 1 мМ ДТТ могут быть добавлены к клеткам на этой стадии. Активировать клетки ФМА и Ionomycin вместе с тестируемыми препаратами, если это необходимо, и аккуратно перемешать (аналогично шагу 4). Пластина 100 мкл клеток в каждую лунку 96-луночный культуральный обработанной пластиной и инкубировать при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 48 часов. Добавьте 100 мкл среды RPMI-1640 без клеток в одну лунку, чтобы получить показание фоновой оптической плотности. Добавьте 20 мкл реагента MTS на основе в каждую лунку и инкубировали при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 4 часов. Проводите измерения спектральной поглощательной способности при 490 нм с использованием планшет – ридера.Измерения bsorbance соответствуют количеству метаболически активных клеток в каждую лунку. Примечание: Вычтите фоновые уровни, если это необходимо. Значения фонового поглощения зависит от типа культуральной среды, сыворотки, внешний рН и продолжительности воздействия реагента MTS к свету. МТС на основе реагенты светочувствительные, и воздействие света в течение нескольких часов может привести к увеличению фоновых значений оптической плотности.

Representative Results

Мы использовали этот анализ, чтобы сравнить образование лимфоцитов взрыва во время стимуляции РМА, форбола эфира, и иономицина, в ионофора кальция. Рисунок 1А показывает распределение частоты диаметров отдыхавших и фармакологически активированных Т – клеток в селезенке. Обработка клеток РМА / иономицином в течение ~ 2 дней привело к значительному сдвигу в медианы распределения в направлении больших диаметров (см, например , ссылка 4). Число ячеек с меньшим диаметром была соответственно уменьшена. Для того чтобы убедиться , что наше устройство сообщает правильные диаметры, мы провели два калибровок с полистирольных шариков 6 мкм и 8 мкм диаметры (см Материалы таблицу). Фигуры 1В и 1С представлены показания из активированных Т – клеток , наложенных друг на друга с 8 мкм стандартных и покоящихся Т – клеток , наложенных друг на друга со стандартными 6 мкм. фигура1D показывает размеры управления бусинка представленные производителем в виде зависимости от медианного диаметра , измеренных с помощью нашей автоматизированной счетчика клеток. Оказалось, что размер 6 мкм был немного завышен в наших измерениях, вероятно, из-за порога измерения прибора, имеющего нижний предел 5 мкм. Тем не менее, стандартное отклонение диаметра борта, вычисленных из измерений счетчика клеток находится в согласии со стандартным отклонением сообщает производитель. Мы пришли к выводу из этих экспериментов, что это устройство можно использовать надежно для сравнения отдыха и митоген-стимулированных размеров Т-клеток мышей и что устройство может точно измерить фактические диаметры ячеек. Затем мы исходили, чтобы проверить зависимость увеличения среднего диаметра на концентрацию РМА и обнаружили, что при фиксированной Ionomycin концентрации 250 нМ, эффект РМА существенно не изменилась путем повышения его концентрации FРим.2 до 250 нг / мл (фиг. 2А) С помощью анализа МТС на основе, мы измерили пролиферацию Т-клеток при 50 и 250 нг / мл РМА и не обнаружили заметной разницы (рис 2С), согласуется с данными наших диаметра ячейки. Ингибитор кальциневрина препаратов циклоспорина А (300 нМ) и FK506 (1 нМ) подавляется как бластогенез (рис 2В) и пролиферации (рис 2С). Ингибирование не была завершена, в обоих случаях, однако. Измерения проводили 12 ч после того, как РМА / иономицин добавка показала увеличение на 7,2% и 6,8% в диаметре на 50 нг / мл и 250 нг / мл РМА, соответственно (рис 2D). Размер увеличивается при этих двух концентрациях существенно не отличались, как это имело место в течение 48 часов стимуляции ( по сравнению с фиг.2А). Данные диаметра клеток, собранных из состояния покоя и активированных Т-клеток после 48 ч РМА / Ionomycin стимуляции обобщены в <stronг> Таблица 1. Средняя площадь поверхности и объем покоящихся ICR мыши селезеночные Т – клетки 151,4 мкм 2 и 1,9 х 10 -4 NL, соответственно. Средняя площадь поверхности и объем активированных Т – клеток были 300,6 мкм 2 и 5,9 х 10 -4 NL, соответственно. Общий средний прирост диаметра для всех активированных клеток было 40,92% (Таблица 1). Мы также проверили другие химические соединения, представленные иммуносупрессивной: CsA, FK506, рапамицин, FTY720, и трамвайная-34. На рисунке 3, измерения размера ячейки , полученные в состоянии покоя и активированные Т – клетки в отсутствие и в присутствии этих препаратов показаны. ДСА и FK506, которые сориентированы на кальциневрина-зависимого ядерного фактора активированных Т – клеток (NFAT) 27,28, были самыми мощными, ингибируя зародышевый ответ почти на 72% (фиг 3А и 3В). Интересно, что сповышенные концентрации РМА, активность CsA и FK506 несколько снизилась, несмотря на то, что не было никакого дополнительного увеличения диаметра клеток при отсутствии этих препаратов (рис 2А и 2В). Рапамицин, иммунодепрессант , который ингибирует мишень рапамицина у млекопитающих (МРМ) 29,30, была умеренной , но статистически значимый эффект (рис 3А, 3В и 3С). FTY720 является сфингазина 1-фосфат рецептора агонистом , который ингибирует лимфоцитами EGRESS в обращение 31 и недавно было обнаружено, ингибирует TRPM7 катион канала с высоким уровнем экспрессии в Т – лимфоциты 32. Оба FTY720 и рапамицин имел сопоставимый эффект на бластогенеза, уменьшая его от среднего увеличением диаметра 52% до приблизительно 34% (рисунок 3А и 3В). Трамвайно-34 является блокатор кальция активируемых калиевых каналов KCa3.1 33. Испытано на длине волны 700 нм, трамвайно-34 оказался неэффективным в мышиных Т-клеток, яп соответствии с недавнего исследования пролиферации Т-клеток человека; его активность может зависеть от природы и силы митогенной стимуляции 34 (фиг.3А и 3В). 700 нМ трамвайно-34 был эффективен в блокировании KCa3.1 каналов в наших экспериментах электрофизиологических патч зажим (данные не показаны). Это сравнение было сделано между отдыха и клетками с наркотиками в нескольких воздействию испытаний в пределах одного эксперимента в 48 ч. Когда рапамицин , так и КАС были использованы вместе, бластогенеза был полностью ингибируется (3С). Активация мышиных Т – клеток , анти-CD3 / анти-CD28-покрытием магнитных гранул в течение 72 ч произвел увеличение среднего диаметра, который был уменьшен до 5% в присутствии CsA (рис 3D) 27%. Клетки человека мононуклеарных Upon ФМК / Ionomycin активации в течение 48 ч в диаметре увеличилась на 33%, а активация в присутствии CsA снижало реакцию на 23% ( <stronг> Рисунок 4). На рисунке 1: частотное распределения мышиных диаметра селезеночных Т-клеток. (A) Черные столбцы показывают , отдыхая и красные столбцы указывают / иономицин-активированные (48 ч) , клетки PMA. (B) Распределения активированных селезеночных Т – клеток , наложенных друг на друга на размер частиц калибровочного стандарта 8 мкм. (C) Распределения покоящихся Т – клеток , наложенные на калибровочного стандарта 6 мкм. Число клеток и шариков, используемых указаны в коробках. (D) , средний диаметр частиц измеряли с помощью счетчика клеток в виде зависимости от диаметра борта шины сообщает производитель. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <p class="jove_content" fo:keep-together. в-странице = "1"> Рисунок 2: Зависимость мышиной активации Т-клеток на концентрацию РМА. (А) средние диаметры Т – клеток , либо необработанные , либо обрабатывают 2, 50 и 250 нг / мл РМА при фиксированной Ionomycin концентрации (250 нМ). (B) Счетчик клеток измерения покоящихся и активированных (2, 50, 250 нг / мл РМА) Т – клеток в отсутствие и в присутствии 300 нМ CsA или 1 нМ FK506. (C) , анализ MTS пролиферации при 50 и 250 нг / мл РМА с 250 нМ иономицина в отсутствии и в присутствии 300 нМ CsA. Значительные различия (р <0,001), обозначены звездочками. п общее число испытаний. Данные взяты из клеток, выделенных из 3 мышей. (D) Клеточные диаметры покоящихся и активированных Т – клеток (250 нг / мл РМА и 250 нМ иономицин) 12 ч после активации в отсутствии и в присутствии 300 нМ CsA. pload / 55212 / 55212fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3: Влияние CsA, FK506, FTY720, рапамицин и трамвайно-34 по размеру ячейки. (А и С) Средние диаметры покоящихся и РМА / иономицин-активированные мышиные Т – клеток в отсутствие и в присутствии лекарственных средств. Концентрации приведены в поле. (В) данных из выражается как процентное увеличение по диаметру покоящихся Т-клеток. активацию лимфоцитов проводили с 250 нг / мл РМА и 250 нМ иономицина, а измерения проводились после 48 часов. (D) , Счетчик клеток измерения отдыха и анти-CD3 / CD28-активированных Т – клеток, 72 часа после активации в отсутствии и в присутствии 300 нМ CsA.rge.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4: бластогенеза в человеческих МКПК после стимуляции митогеном. (A) Черные столбцы показывают , отдыхая и красные столбцы указывают активированные МНПК. (В) Средние диаметры покоящихся и активированных РВМС в отсутствие и в присутствии 300 нМ CsA. Клетки активировали 250 нг / мл РМА и 250 нМ иономицина, а измерения проводились после 48 часов активации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Столбец1 Отдыхающий активированная CsA 100 нМ CsA 200 нМ Средний диаметр 6.94 мкм 9.78 мкм 8.19 мкм 7.92 мкм Среднее увеличение диаметра 40,92% 17,88% 14,09% Средняя площадь поверхности 151.37 μm² 300.61 μm² 210.56 μm² 197.22 μm² Среднее увеличение площади поверхности 98.59% 39.00% 30,16% Таблица 1: среднего диаметра клеток и относительного увеличения площади поверхности. Измерения проводились через 48 часов после активации с 250 нг / мл РМА и 250 нМ иономицином.

Discussion

Здесь мы опишем метод для быстрого обнаружения и определения количества Т-клеток зародышевый трансформации с использованием автоматического счетчика клеток. В наших условиях (250 нг / мл РМА и 250 нМ Ionomycin стимуляции), площадь клеточной поверхности была увеличена в два раза, а объем в три раза после 48 часов активации. Анализ достаточно чувствителен для обнаружения взрывных работ в течение первых 12 ч активации, где объем ячейки увеличился лишь на 1,25 раза по сравнению с состоянием покоя (рис 2D). Более физиологически соответствующий механизм активации Т-клеток с использованием анти-CD3 и анти-CD28 антитела , покрытые магнитные гранулы получают значительный зародышевый ответ, при среднем 2,3-кратное увеличение объема (72 ч после активации, Рисунок 3D). Клетки человека одноядерные показали 2,6-кратное изменение объема при РМА / Ionomycin стимуляции в течение 48 ч (рисунок 4). Средний диаметр и объем ICR мыши селезеночной Т-клеток были определены как6,9 мкм и 1,9 × 10 -4 п соответственно. Человеческие РВМС (от одного здорового донора) имели средний диаметр 7,7 мкм и средний объем 2,7 х 10 -4 нл. Используя этот протокол, мы также протестировали возрастающие концентрации ФМА на предмет их способности активировать Т-клетки. Эти результаты одноклеточные согласуются с анализах пролиферации, проведенных при аналогичных концентрациях РМА.

Несколько соединений сообщили влиять на пролиферацию клеток были испытаны: FTY720 31,32; иммунодепрессанты циклоспорин A, FK506 и рапамицин 27,28; и трамвайно-34, блокатор кальциевых активированных KCa3.1 каналов 33,35. Мы нашли, что, при испытанных концентрациях, наиболее эффективными ингибиторами бластогенеза были ДСА и FK506. Рапамицин был меньше, но статистически значимое влияние на подавляющий бластогенеза. Трамвайно-34, с другой стороны, не влияет на бластогенеза.

CsA подавлено как бластогенез и рroliferation, но не полностью (рис 2B и 2C), демонстрируя , что автоматическое измерение счетчика клеток является хорошим коррелируют эффективности лекарственного средства в пролиферации Т-клеток. В присутствии рапамицина вместе с CsA, бластогенеза полностью ингибировалась, предполагая , что NFAT- и МРМ-опосредованных путей в сочетании могут в полной мере учесть расширение Т-клеток митогенной при стимуляции ФМА / иономицином (рис 3C).

Динамический диапазон некоторых анализов пролиферации ограничено (см рисунок 2). Для анализа пролиферации, такие , как тот , который мы использовали (рис 2С), сообщают сигнал , который включает в себя вклады от апоптотических и некротических клеток. Автоматизированные измерения изменения диаметра не имеют этого ограничения, так как измерения относятся только жизнеспособных клеток. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью трипанового голубого пятна от здоровых, жизнеспособных клеток. При измерении размеров, с использованием прямогорассеяние света в проточной цитометрии дискриминации дуплет клеток может быть проблематичным 22. В автоматизированных измерений счетчика клеток, ни один дуплет населения не было найдено (Рисунок 1). Кроме того , измерение было достаточно точным , чтобы различать между эффектами 100 и 200 нМ циклоспорина (таблица 1) , и для обнаружения бластогенеза в течение 12 ч митогенных стимуляции (рис 2D).

Этот новый анализ особенно полезен для небольшого количества образцов. До 15 образцов могут быть измерены в 1 ч. Тем не менее, этот анализ имеет свои ограничения, большинство из которых могут быть смягчены. Несмотря на то, что может эффективно решать небольшой (<1 мкм) разница в диаметре ячейки, модель машины мы использовали более низкий порог обнаружения 5 мкм. Это ограничение может привести к завышению очень малых размеров клеток, так как он эффективно исключает все клетки с меньшим диаметром. Тем не менее, новые модели счетчика клеток имеют Thresh обнаружениядети из ~ 2 мкм, которая должна решить эту проблему. Если есть слишком много мусора в образце, прибор обрабатывает их как жизнеспособные клетки. Кроме того, воздушные пузырьки могут иногда получить в проточную кювету и вызвать искажение изображения клеток, захваченных машиной. Искажение-видимому, не влияет на определение жизнеспособности, но он может повлиять на измеряемые диаметры. Поэтому рекомендуется, чтобы все изображения будут проверены экспериментатором для пузырьков воздуха, прежде чем данные из каждого испытания принимаются для анализа. Поскольку программное обеспечение только рисует круги вокруг ячеек, диаметры несферических клеток могут быть искажены в направлении длинной оси, что делает анализ менее подходящим для несферических клеток.

Этот анализ является быстрым, принимая примерно 4 мин на пробы, по сравнению с анализах пролиферации, которые требуют несколько часов. Сбор данных также довольно просто с помощью программного обеспечения, поставляемого вместе с устройством. Программное обеспечение может экспортировать данные измерений в зрЭлектронная таблица для анализа. И, наконец, это одноклеточные, в отличие от населения, измерения; как бластогенеза и пролиферации измеряются; и он различает жизнеспособных и мертвых клеток одновременно. Он может быть использован для оценки различных линий мышей на предмет их способности смонтировать иммунный ответ. Анализ также может быть успешно использован для измерения бластогенеза в Т – клетках у людей – доноров (фигура 4), и он также может быть использован и в других типах клеток.

Увеличение объема клеток , как известно, способствуют регуляции обмена веществ: набуханием клеток стимулирует глутамин-индуцированный синтез гликогена и липогенез в гепатоцитах 36,37. Нейтрофилы дисплей с миграцией связано увеличение объема 35-60%, в то время как хемотактильными агенты вызывают 10-15% набухания 38-40. Текущий анализ потенциально может быть использован для изучения этих процессов.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Lucile Wrenshall for the use of the plate reader, Nancy Bigley for useful discussion, and Tom Brown for the gift of ICR mice. This work was funded by grant 1R01AI114804 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases and by WSU Faculty Development funds (to J.A.K.). J.N.G. was supported in part by the National Institute of General Medical Sciences grant R25GM090122.

Materials

RPMI-1640  Lonza BW12-702F
40 μm nylon cell strainers  Thermo Fisher Scientific 22363547
nylon wool fiber columns Polysciences, Inc.  21759-1
50 ml conical tubes  The Lab Depot TLD431697
6-well cell culture treated plates USA Scientific CC7682-7506
96-well cell culture treated plates Thermo Fisher Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher BioReagents BP231-100
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay  Promega G3582 MTS based assay
Cyclosporine A Sigma-Aldrich 30024
FK506 Cayman Chemical Company 104987-11-3
Rapamycin Santa Cruz Biotechnology sc-3504
TRAM-34 Sigma-Aldrich T6700
FTY720 Sigma-Aldrich SML0700
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 Gibco 11456D
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)  Acros Organics  356150010
Ionomycin calcium salt Sigma-Aldrich I0634
Penicillin-Streptomycin MP Biomedicals  ICN1670049 100 x stock
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)  HyClone SH30378.02 10 x stock
1,4-dithiothreitol (DTT)  Research Products International 12/3/3483 reducing agent
8 µm micro particle size standard  Sigma-Aldrich 84192-5ML-F Actual  8.02 µm
6 µm micro particle size standard  Sigma-Aldrich 89756-5ML-F Actual 6.084 µm
Single magnetic separation stand for 1.5 – 2 mL tube V&P Scientific, Inc. VP772F5
Cell culture incubator Forma Scientific  3110
Synergy H1 hybrid reader  Bio Tek BTH1M
Vi-CELL cell viability analyzer  Beckman Coulter 731050
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weiss, A., Samelson, L. E., Paul, W. E. T-lymphocyte activation. Fundamental Immunology. , 321-364 (2003).
  2. Gergely, P., Ernberg, I., Klein, G., Steinitz, M. Blastogenic response of purified human T-lymphocyte populations to Epstein-Barr virus (EBV). Clin Exp Immunol. 30 (3), 347-353 (1977).
  3. Sanderson, R. J., Rulon, K., Groeneboer, E. G., Talmage, D. W. The response of murine splenic lymphocytes to concanavalin A and to co-stimulator. J Immunol. 124 (1), 207-214 (1980).
  4. Decoursey, T. E., Chandy, K. G., Gupta, S., Cahalan, M. D. Mitogen induction of ion channels in murine T lymphocytes. J Gen Physiol. 89 (3), 405-420 (1987).
  5. Nibbering, P. H., Zomerdijk, T. P., Tilburg, A. J., Furth, R. V. Mean cell volume of human blood leucocytes and resident and activated murine macrophages. J Immunol Methods. 129 (1), 143-145 (1990).
  6. Segel, G. B., Cokelet, G. R., Lichtman, M. A. The measurement of lymphocyte volume: importance of reference particle deformability and counting solution tonicity. Blood. 57 (5), 894-899 (1981).
  7. Cooper, H. L., Braverman, R. Protein synthesis in resting and growth-stimulated human peripheral lymphocytes. Evidence for regulation by a non-messenger RNA. Exp Cell Res. 127 (2), 351-359 (1980).
  8. Cooper, H. L., Braverman, R. Close correlation between initiator methionyl-tRNA level and rate of protein synthesis during human lymphocyte growth cycle. J Biol Chem. 256 (14), 7461-7467 (1981).
  9. Teague, T. K., et al. Activation changes the spectrum but not the diversity of genes expressed by T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12691-12696 (1999).
  10. Tzur, A., Kafri, R., Lebleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell growth and size homeostasis in proliferating animal cells. Science. 325 (5937), 167-171 (2009).
  11. Messele, T., et al. Nonradioactive techniques for measurement of in vitro T-cell proliferation: alternatives to the [3H]thymidine incorporation assay. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (4), 687-692 (2000).
  12. Maghni, K., Nicolescu, O. M., Martin, J. G. Suitability of cell metabolic colorimetric assays for assessment of CD4+ T cell proliferation: comparison to 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) ELISA. J Immunol Methods. 223 (2), 185-194 (1999).
  13. Weichert, H., Blechschmidt, I., Schröder, S., Ambrosius, H. The MTT-assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing: application to human peripheral blood lymphocytes (PBL). Allerg Immunol (Leipz). 37 (3-4), 139-144 (1991).
  14. Huang, K. T., Chen, Y. H., Walker, A. M. Inaccuracies in MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids. Biotechniques. 37 (3), 410-412 (2004).
  15. Rampersad, S. N. Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays. Sensors (Basel). 12 (9), 12347-12360 (2012).
  16. Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
  17. Augustine, N. H., Pasi, B. M., Hill, H. R. Comparison of ATP production in whole blood and lymphocyte proliferation in response to phytohemagglutinin. J Clin Lab Anal. 21 (5), 265-270 (2007).
  18. Sottong, P. R., Rosebrock, J. A., Britz, J. A., Kramer, T. R. Measurement of T-lymphocyte responses in whole-blood cultures using newly synthesized DNA and ATP. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (2), 307-311 (2000).
  19. Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell tracking 2007: a proliferation of probes and applications. Immunol Invest. 36 (5-6), 527-561 (2007).
  20. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  21. Teague, T. K., Munn, L., Zygourakis, K., Mcintyre, B. W. Analysis of lymphocyte activation and proliferation by video microscopy and digital imaging. Cytometry. 14 (7), 772-782 (1993).
  22. Böhmer, R. M., Bandala-Sanchez, E., Harrison, L. C. Forward light scatter is a simple measure of T-cell activation and proliferation but is not universally suited for doublet discrimination. Cytometry A. 79 (8), 646-652 (2011).
  23. Lee, J., Sadelain, M., Brentjens, R. Retroviral transduction of murine primary T lymphocytes. Methods Mol Biol. 506, 83-96 (2009).
  24. Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J Immunol Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
  25. Trickett, A., Kwan, Y. L. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 275 (1-2), 251-255 (2003).
  26. Pène, J., Rahmoun, M., Temmerman, S., Yssel, H. Use of anti-CD3/CD28 mAb coupled magnetic beads permitting subsequent phenotypic analysis of activated human T cells by indirect immunofluorescence. J Immunol Methods. 283 (1-2), 59-66 (2003).
  27. Sigal, N. H., Dumont, F. J. Cyclosporin A, FK-506, and rapamycin: pharmacologic probes of lymphocyte signal transduction. Annu Rev Immunol. 10 (1), 519-560 (1992).
  28. Fruman, D. A., Klee, C. B., Bierer, B. E., Burakoff, S. J. Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (9), 3686-3690 (1992).
  29. Pollizzi, K. N., Waickman, A. T., Patel, C. H., Sun, I. H., Powell, J. D. Cellular size as a means of tracking mTOR activity and cell fate of CD4+ T Cells upon antigen recognition. PLoS One. 10 (4), e0121710 (2015).
  30. Pollizzi, K. N., Powell, J. D. Regulation of T cells by mTOR: the known knowns and the known unknowns. Trends Immunol. 36 (1), 13-20 (2015).
  31. Mandala, S., et al. Alteration of lymphocyte trafficking by sphingosine-1-phosphate receptor agonists. Science. 296 (5566), 346-349 (2002).
  32. Qin, X., et al. Sphingosine and FTY720 are potent inhibitors of the transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7) channels. Br J Pharmacol. 168 (6), 1294-1312 (2013).
  33. Wulff, H., Kolski-Andreaco, A., Sankaranarayanan, A., Sabatier, J. M., Shakkottai, V. Modulators of small- and intermediate-conductance calcium-activated potassium channels and their therapeutic indications. Curr Med Chem. 14 (13), 1437-1457 (2007).
  34. Petho, Z., et al. The anti-proliferative effect of cation channel blockers in T lymphocytes depends on the strength of mitogenic stimulation. Immunol Lett. 171, 60-69 (2016).
  35. Wulff, H., et al. Design of a potent and selective inhibitor of the intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel, IKCa1: a potential immunosuppressant. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (14), 8151-8156 (2000).
  36. Lang, F., et al. Functional significance of cell volume regulatory mechanisms. Physiol Rev. 78 (1), 247-306 (1998).
  37. Hue, L. Control of liver carbohydrate and fatty acid metabolism by cell volume. Biochem Soc Trans. 22 (2), 505-508 (1994).
  38. O’Flaherty, J. T., Kreutzer, D. L., Ward, P. A. Neutrophil aggregation and swelling induced by chemotactic agents. J Immunol. 119 (1), 232-239 (1977).
  39. Hsu, L. S., Becker, E. L. Volume changes induced in rabbit polymorphonuclear leukocytes by chemotactic factor and cytochalasin B. Am J Pathol. 81 (1), 1-14 (1975).
  40. Rosengren, S., Henson, P. M., Worthen, G. S. Migration-associated volume changes in neutrophils facilitate the migratory process in vitro. Am J Physiol. 267, C1623-C1632 (1994).

Tags

T LymphocyteBlastogenesisBlast TransformationImmunomodulatory DrugsAutomated Cell CounterCell DiameterT Lymphocyte ActivationT Lymphocyte ProliferationSpleenSplenocyteNylon Wool ColumnRed Blood Cell LysisRPMI Medium

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Gibson, J. N., Beesetty, P., Sulentic, C., Kozak, J. A. Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs. J. Vis. Exp. (118), e55212, doi:10.3791/55212 (2016).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image