"Acufection"와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 DNA 전달 시스템의 개발
Summary
이 프로토콜은 마우스의 피부에 벌거 벗은 플라스미드 DNA를 표현하기위한 비용 효율적인 대안이다. 프로토콜의 전반적인 목표는 피부 염증의 특정 유전자의 기능적 역할을 묘사하기 위해 피부 조직에 면역 관련 유전자를 제공하는 것입니다.
Abstract
피부 면역 반응의 조절 장애는 수많은 인간의 피부 질환과 연관되어 있습니다. 피부 조직에 면역 관련 유전자의 직접 전송은 인간의 질병의 마우스 모델에서 피부 염증의 면역 변조를 조사 할 수있는 매력적인 방법입니다. 여기에서 우리는 마우스의 피부에 벌거 벗은 DNA를 전달 유전자 발현에 이르게 비용 효율적인 프로토콜을 제시한다. 상기 방법은 천공 ACU 매개 DNA 트랜스 fection를 나타내는 "acufection"를 만들어 낸된다. acufection을 수행하려면 마우스 피부 제 인산 완충 용액 (PBS)에 DNA 주입 후 세포 내로의 DNA 및 형질 흡수를 용이하게 침 다발로 가볍게 찔러 하였다. 플라스미드 DNA는 아마도 각화 세포 및 피부의 수지상 세포에 의해 용해 단백질로 발현된다. 바늘 자체와 기계 녀석은 피부 손상을 일으키거나 각질 세포의 활성화를 유도하지 않았다. 표현형질 전환 된 유전자의 2 일간 acufection 다음 전사 및 번역 모두 수준에서 피부에서 발견 된 7 일까지 유지했다. 이 acufection 방법의 개발에 주 목적은 IL-15의 미리 정의 이성체를 조사 하였다. 염증을 유도하기 위해, 피부에 표현하고이어서 수신자 같은 수용체 7 (TLR7) 작용제, 이미 퀴 모드 (IMQ) 처리이있어서, 부분적으로 삭제 엑손 7 (IL-15ΔE7)와 다르게 스 플라이 싱 된 IL-15 이성체이었다 사용. Acufection-전달 피부는 IL-15ΔE7 IMQ 유도 된 피부 염증의 각질 세포 증식, 상피 두께 및 호중구 모집을 억제 하였다. 피부 염증의 조절기구를 식별하는 관심이 증가함에 따라, 프로토콜은 여기에 기재된 생체 내에서 DNA 전달을위한 유전자 총 시스템 또는 microseeding에 비용 효과적인 다목적의 대안을 제공한다. 잠재적으로 새로운 기능의 검색을 허용 할 수있다피부 또는 피부 질환에 대한 새로운 치료법을 조사하는 유전자.
Introduction
피부 숙주 방어의 첫 번째 라인이다. 각질 세포 (KCS)는 인간과 쥐의 피부의 주요 세포 유형입니다. 환경 적 자극 (예를 들면 태양 광, 산소, 화학 물질 및 병원균 침입)에 응답하여, 관세청 활성화 및 IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF-α과 같은 염증성 사이토 카인 및 케모카인의 다양한 생산되고 α 및 GM-CSF 1. 이들은 피부에 면역 세포의 채용을 트리거합니다. 악화되는 피부 염증은 종종 급성 자궁외 접촉 피부염 및 만성 T 세포 매개 성 염증 (예를 들어 알레르기 성 접촉 피부염 및 건선) 2 등 다양한 인간 질병과 연관되어 있습니다. KC 활성화를 억제함으로써 피부의 염증 반응을 조절하는 것은 피부 염증을 치료하는 그럴듯한 방법입니다. 이 프로토콜은 일시적으로 면역 고해상도를 연구하기 위해 표피에서 사이토 카인 유전자를 표현하는 새로운 접근 방식을 설명합니다피부에 이러한 치료에 결과적 ponse.
표피는 피부의 가장 표층을 구성한다. 그러한 피부의 심층 들어가는 병원체 핵산과 같은 외부 물질을 유지하는 물리 장벽으로서 기능한다. 여러 바늘없는 기술은 표피 DNA 전달 3, 4 설립되었다. 용액 중의 DNA 또는 양이온 성 리포솜 또는 아데노 바이러스 벡터와 연관된 직접 이러한 각질층의 제거 또는 시약과 함께 탈모 치료 기법으로 변성 표피에 적용되었다. 각질화 된 상피를 제거하여 DNA는 면역 반응을 유도하는 5 각화 세포 및 랑게르한스 세포, 표피의 장벽 작용을 넘어 용이하게한다. 큰 표면적이 DNA 전송을 위해 사용할 수 있으며이 방법은 바늘을 포함하지 않지만, 요구 사항을 포함하여 단점이있다스트리핑에 의해 – (100 μg의 10), 피부 가혹하고 DNA 전달 부스터 6 않고 면역화 된 동물에서 면역 반응을 유도하는 일관성있는 결과 DNA의 대량 대한. 피부 벗은 DNA의 미립자 – 매개 세포 내 전달은 면역 반응을 7, 8을 유도하는 고효율 및 재현성 것으로 밝혀졌다. 휴대용 유전자 총 가압 헬륨 기류 (9)의 수단에 의해 크기가 2 ㎛의 직경의 플라스미드 DNA 코팅 된 금 입자는 피부의 표적 부위 도배 사용되고있다. 플라스미드 DNA는 아마도 피부 KCsand 수지상 세포에 의해 흡수되고, 단백질은 로컬 표현 또는 수지상 10 림프절로 이송된다. 유전자 총 시스템은 간단하고 제한된 기술 경험은 "DNA의 BUL을 준비하고 제공하기위한 비용이 필요하지만하자 "(즉, 금 분말, 헬륨 가스)와 유전자 총을위한 자체는 일반 응용 프로그램을 제한하고있다. 실험은 서로 다른 위치에서 수행 할 때 또한, 헬륨 가스 공급 시스템에 대한 요구 사항이 유전자 총 수송의 용이성을 제한합니다. Microseeding 단일 분사 입자 충격 (11)에 비해 유전자 전달의 높은 효율을 달성하는 것으로 입증되었다. Microseeding 입자 비드를 사용하지 않고 피부에 DNA를 전달하기 위해 문신 총을 사용한다 (11). 진동이 방법을 이용하여 피부에 미세 바늘이 가능성 직접 동시에 여러 세포에 DNA를 전송하므로 세포막을 긁어. 그러나, 0.254 mm 직경의 바늘 주사 다수과 관련된 통증이 단점이다.
여기에서 우리는 생체 내에서 DNA 전달에 대한 대안 접근 방식을 제공합니다. 은 "acufection" </str옹> 우리는 여기에 설명 된 프로토콜은 마우스의 피부에 플라스미드 DNA를 전달하는 경제적이고 효율적인 방법을 제공합니다. 간략 10 개 침 (× 길이 13mm, 직경 0.2 mm)를 접착 테이프에 의해 다발로 결합 하였다. 관심있는 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA의 10 μg의와 PBS의 10 μL의 볼륨은 면도, 제모 크림 처리 된 측면 피부에 배치되었다. 피부 표면 (1cm X 1cm)을 진동 침술 바늘 뭉치를 사용하여 각질층의 케라틴 느슨하게하고, 표면에 적용되는 플라스미드 DNA는 표피에 흡수시켰다. 피부 손상 모니터링하고 최소한의 것으로 밝혀졌다. acufected 피부 형질 감염된 유전자의 발현은 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR) 및 ELISA에 의해 확인 하였다. 피부 염증에 acufection-전달 IL-15ΔE7의 면역 조절 성 효과는 IMQ 처리 된 마우스 모델 (12)을 이용하여 증명되었다. acufection가 증명하는 동안 쉽고 덜 DEMA 수생체 내에서 DNA 전달을위한 방법을 웍 다른 유전자와 피부를 찌를 수있는 시간에 대한 DNA의 최적의 양은 신중하게 재현 가능한 결과를 얻기 위해 최적화되어야한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
acufected 플라스미드 DNA의 발현을 확인하기 위해 가장 중요한 단계는 균일 진동과 피부의 각질층을 느슨하게한다. 피부를 절단하지 않고 부드럽게 바늘을 누르는 동안, 힘이 표면을 누르기 힘든 충분해야한다. 1cm X 1cm의 면적에 10 μL의 용액에서 DNA의 흡수를 용이하게하기 위해, 바늘은 30 초에 100 회 상하 진동을한다. 하나는 피부를 찌를 필요가 힘을 결정하고 acufected 유전자의 최고 발현 수준을 산?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 과학 기술부에서 부여에 의해 지원되었다 (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). 우리는 박사 감사합니다. 원고를 읽기위한 베티 우 셰 행정 원장과 하와이 대학에서 스탠포드 대학 박사 피터 호프만에서 NTU에 치엔 쿠오 리, 리 저보니, 농업 생명 공학의 기술 지원 NTU에서 윤 치엔 박사 웬 – 치 웨이 기술 자문에 대한 중앙 연구원에서 연구 센터.
Materials
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| QIAGENⓇ Plasmid Midi Kit | QIAGEN | 12143 | Purification of plasmid DNA from E. coli |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
| ScanScopeⓇ XT | Aperio | N/A | Whole-field image scanner |
| MetaMorphⓇ Research Imaging | Molecular Devices | N/A | Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells |
References
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5′ untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes’ response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
