마취 유발 신경 독성 (AIDN) 연구를위한 돼지 모델의 사용 : 번역 신경 과학적 접근법

건강한 국내 새끼 돼지 ( Sus scrofa) 는 오하이오 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)가 승인 한 농장에서 얻습니다. 모든 동물 실험은 의정서 승인 후 Ohio State University IACUC 정책에 따라 수행됩니다. 1. 동물과 동물 취급 이 실험에서 남성 piglets를 사용하여 섹스의 혼란스러운 효과를 제거하십시오. 참고 : 실험 목적에 최대 뇌 성장 기간 동안 동물에 대한 실험의 영향 평가가 포함 된 경우 14 일이 넘은 새끼 돼지를 사용하지 마십시오. 환경에 순응하도록 실험하기 최소 24 시간 전에 새끼 돼지가 사육장에 도착하도록 계획하십시오. 참고 : 허가 된 수의사가 감독하는 숙련 된 수의사 기술자는 일상적인 동물 관리를 제공합니다. 새끼 돼지를 개별 온도 조절 새장에 보관하고 영양 염류를 제공하십시오완벽하게 상업적인 돼지 새끼 우유 대체제를 자유롭게 섭취하십시오. 동물에게 담요와 장난감을 보급하십시오. 동물 인클로저의 온도를 지속적으로 모니터링하십시오. 이 예비 타당성 연구를 위해, 이소 플라 우린 팔에 18 마리의 새끼 돼지와 대조군에 22 마리의 새끼 돼지를 사용했다. 가능한 경우 연구 설계에 따라 표본 크기 계산을 수행하십시오. 적절한 노출 시간 동안 사용 가능한 새끼 돼지를 대조군 또는 노출 그룹으로 무작위 배정하십시오. 여러 조사자가 있어도 경험상 하루 2 회 이상 (총 2 마리) 실험을 수행 할 수 있습니다. 2. 동물 통제 대조 동물에 실험적 개입을 수행하지 마십시오. 재관류 및 조직 수집 절차를 위해 얼굴 콘 마스크를 통해 심한 전신 마취를 유도하십시오. 구체적으로, 24 시간 순응 기간 후, 100 % 산소에서 5 % 이소 플루 란 또는 8 % 세보 플루 란으로 마늘을 마취 <em> face 콘 마스크를 통해. 유도를 위해 데스 플루 란을 사용하지 마십시오. 참고 : 마취 유도와 차가운 PBS 재관류 사이의 시간은 가능한 한 짧아야합니다. 숙련 된 기술자가 5 분 이내에이 과정을 완료 할 수 있습니다. 외과 용 클램프를 사용하여 드라큘라 핀치 반사가 없기 때문에 적절한 마취 깊이를 확인하십시오. 저산소증 / 허혈성 뇌 손상을 피하려면 맥박 산소 측정기를 사용하여 돼지 새끼를 모니터링하여 차가운 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 관류가 시작될 때까지 적절한 산소 공급, 인공 호흡 및 심장 출력 유지를 보장하십시오. 참고 : 조직 손상을 추가로 방지하려면 마취 유도 후 동물의 머리 (머리 포함)를 얼음에 담으십시오. transcardiac 관류를 수행하십시오. 참고 : 파라 포름 알데히드가 사용되기 때문에, 관류 절차는 흄 후드 또는 하강 테이블에서 수행되어야합니다. craniocaudal 내가 만들어메스를 사용하여 흉골의 길이를 따라 ncision. 절개의 깊이는 흉골을 노출시키기에 충분해야합니다. 조심스럽게 심장, 폐 또는 횡격막 손상을 피하면서 한 쌍의 날카로운 중공 가위로 정중선 흉골 절개술을 시행하십시오. 필요한 경우 부상을 피하기 위해 흉골의 뒤쪽과 흉막 내 사이에 손가락을 놓습니다. 횡격막에 작은 (손가락 크기의) 절개를 만들어서 종격동으로 손가락을 조종하십시오. 흉강에 들어간 후, 자기 유지 식 견인기를 사용하여 흉곽을 열어 두십시오. 겸자와 가위를 사용하여 심낭을 절개하여 박동하는 심장을 노출시킵니다. 심장을 손상시키지 않도록주의하십시오. 좌심실을 확인하고 심실 정점을 통해 정맥 (예 : 14G 혈관 내시경)을 조심스럽게 배치합니다. 바늘을 제거하고 카테터를 제자리에 남겨 둡니다. 참고 : 심실의 후벽을 뚫지 않도록주의하십시오.카테터로부터의 맥박이 심한 혈액 순환은 그것이 적절히 놓여 졌음을 나타냅니다. 혈액은이 시점에서 동물로부터 쉽게 채취 할 수 있습니다. 우심방을 확인한 후, 아트리움을 가위로 크게 절개하여 삽과와 관류 액의 도피를 허용하여 절개를하십시오. 참고 : 흡입을 통한 이소 플루 란은 심장 사망이 확인 될 때까지 계속되어야합니다. 심장 사망은 직접적으로 관찰 된 심장 출력 부족으로 확인됩니다. 추위로 구성된 관류 액을 사용하여 돼지를 관류 (4 ° C) 5 ML / mL의 농도로 헤파린을 함유 한 인산염 완충 식염수 (PBS). 분당 300 mL에서 5 분간 또는 용액이 깨끗해질 때까지 관류한다. 재관류 중 재관류 캐뉼라가 빠지지 않도록주의하십시오. 이것과 다른 모든 관류를 위해 시판되는 연동 펌프를 사용하십시오. 다시 hemicraniectomy 수행신선한 조직 분석을 위해 뇌의 반구를 움직입니다. 참고 :이 프로토콜은 신선한 뇌 조직의 반구를 검색 할 수 있습니다. 다른 반구는 고정되어 있습니다. 신선한 조직이 필요하지 않으면 단계 2.6으로 건너 뜁니다. 이 과정에서 뇌가 차가워 지는지 확인하기 위해 시간당 50 mL의 속도로 얼음이 차는 PBS 순환을 계속하십시오. 메스를 사용하여 foramen 매그넘 때까지 sagittal 봉합의 길이를 따라 두피에 세로 절개를하십시오. 과정에서 확고한 압력을 가하여 두개골에 점수를 만듭니다. 두피 전체를 드러내 기 위해 두피를 반사하십시오. Rongeurs를 사용하고 foramen magnum에서 시작하여 밑에있는 뇌 조직을 손상시키지 않도록주의하면서 두개골과 경질 막 사이에 rongeurs를 삽입하여 한쪽면의 두개골을 제거하십시오. 론자를 사용하여 두뇌 실질에서 멀어 지도록 뼈를 제거하십시오. 해골이 제거되면, 절개하고 du를 제거하십시오.뇌 조직을 손상시키지 않도록 조심스럽게 사용하여 포셉과 가위를 사용합니다. 두 반구 사이에 메스 잎을 놓고 조심스럽게 코퍼스를 협상합니다. 포셉의 넓은 손잡이 끝과 같은 평평한 도구를 사용하여 전두엽을 부드럽게 철회하고 점차적으로 뇌 신경을 절단하여 후방으로 전방으로 작업합니다. 반구의 가장 후방 측면에서 척수를 자르기 위해 메스를 사용하십시오. 반구를 삭제합니다 . 참고 : 고정되지 않은 뇌 조직은 허약합니다. 남은 반구의 혈액 공급이 중단되지 않도록 반구를 제거 할 때주의하십시오. 제거 된 반구를 단면. 지시가있는 경우 즉시 액체 질소 욕조에서 -160 ° C로 냉각 된 2- 메틸 부탄에서 섬광 동결시켜 조직 파괴를 피하고 나중에 분석을 위해 -80 ° C에서 즉시 보관하십시오. 참고 : 우리는 뇌를 2 mm 간격으로 뇌를 관상 동맥으로 절개 할 것을 권장하지만,섹션 화는 특정 실험 목적에 달려 있습니다. 관류 액을 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 바꿉니다. 적어도 5 분 동안 분당 300 ML에서 PFA 관류를 계속하십시오. 주의! PFA는 독성이 있으므로 피부, 눈 또는 점막과의 접촉을 피하십시오. PFA 연기를들이 마시지 마십시오. 근육에서 생성되는 알데히드 교차 결합의 형성으로 인해 돼지의 몸이 뻣뻣해질 것으로 예상됩니다. PFA의 관류가 완료된 후 2.5.5 단계에서 설명한 것과 동일한 방법으로 남은 반구를 제거합니다. 참고 : 적절하게 통증 된 뇌는 창백 해지고 완전히 삽질 될 것입니다. 남아있는 반구를 4 ℃에서 신선한 4 % PFA가 담긴 작은 용기에 넣으십시오. PFA에 반구를 24 ~ 48 시간 동안 고정시켜 고정 과정을 완료하십시오. 24-48 시간 후 고정 된 뇌를 0.1 % 나트륨 아자 이드가 들어있는 PBS 용액으로 옮기십시오. 과도한 고정을 방지하는 것이 필수적입니다. 과도한 고정은 엄마를 초래할 수 있습니다.에피토프의 왕 또는 강한 비특이적 인 배경 염색. 나트륨 아 지드의 첨가는 박테리아 성장을 방지합니다. 참고 : 조직은 4 ° C에서 최대 1 개월 동안 보관할 수 있습니다. 3. 이소 플루 란 (실험 동물) 동물 참고 : 모든 마취 또는 개입을 사용할 수 있지만 흡입 유도시 데스 플루 란을 권장하지 않습니다. 마취 유도 및 유지 : 소아용 인공 호흡기 및 모니터링 장치가 장착 된 임상 마취 워크 스테이션을 사용하여 마취를 수행합니다. 24 시간의 순응 기간이 경과 한 후, 안면 마스크를 통해 100 % O 2 에서 8 % 세보 플루 란으로 마돈을 마취시킨다. 유도 기간 동안 그리고 연구 과정 중 항상 맥박 산소 측정법, 비 침습성 혈압, 심전도 및 온도를 지속적으로 모니터링합니다. 유도 후, Sevoflurane 또는 isoflu를 적정한다.(일반적으로 3-4 %의 농도에서) 지속적인 자발적 호흡을 보장하면서 적절한 마취 깊이를 허용하는 농도로 설정합니다. 주변 귀 정맥에 24 G 말초 정맥 카테터를 놓습니다 ( 그림 1 ). 기관 삽관을 위해 등의 기립 자세로 돼지 새끼를 삽입하십시오 ( 그림 2 , 패널 A). 하악 인스트루먼트와 기관 삽관을 용이하게하기 위해 Miller # 1 또는 # 1.5 블레이드를 사용하십시오. 참고 : 숙련 된 운전자와 조수가 후두경 검사 중에 필요합니다. 조수에게 건조한 거즈를 사용하여 동물의 혀를 옮겨 후두 노출과 성대 시각화를 촉진하십시오 ( 그림 2B ). 참고 : piglet epiglottis는 형태 학적으로 인간과 유사합니다 ( 그림 2 C ). piglet 보컬 오호ds는 후두 입구 ( 그림 2D )에서 수 밀리미터의 깊이이므로 시각화하기 어려울 수 있습니다. 후두를 교체하십시오 : 후두경 블레이드의 끝을 후두개 아래에 놓고 날을 위쪽으로 들어서 후두를 드십시오. 돼지를 기관지에 넣기 전에 성대를 2 % 리도카인 0.5 mL로 스프레이하여 새끼 돼지가 특히 후두 경련에 취약하기 때문에 기관 내 튜브가 통과하는 동안 후두 경련을 예방하십시오. 수갑을 채운 3.0 mm 튜브 튜브를 놓고 고정하십시오. 청진기 및 EtCO 2 모니터링과 함께 가슴 청진을 사용하여 양측 호흡 소리와 지속적인 호흡 이산화탄소를 확인하십시오. 돼지의 폐를 20 cmH2O의 지속적인기도 압력으로 팽창시킨 다음, 20 cmH의 압력에서 공기 누출을 방지하는 데 필요한 최소 압력까지 기관 내 튜브의 커프를 팽창시킵니다. <sub> 2 O, 존재하는 경우 공기 누출을 확인하기 위해 기관을 경청하십시오. 참고 : 이것은 간헐적 인 양압 환기 동안 점막 허혈을 예방하는 데 중요합니다. Normoxia 및 normocarbia는 마취 중 유지됩니다. 50 % 산소 / 50 % 공기 중 2 % 이소 플루 란의 투여를 시작하십시오. PaO2가 90 – 100 mmHg로 유지되도록 산소를 적정하십시오. 3 시간 (또는 원하는 실험 기간) 동안 계속하십시오. 마취 기간 동안 건조를 방지하기 위해 안과 용 연고를 눈에 바르십시오. 2 % isoflurane의 개시 후 대퇴 동맥 카테터 삽입술을 시작하십시오. 수술 부위 감염을 예방하기 위해 말초 정맥 주사 를 통해 광범위한 항생제 사전 절개 (cefazolin, 25 mg / kg) 를 시행하십시오. 적절한 살균 장을 보장하기 위해 착색 된 chlorhexidine을 사용하여 두 개의 사타구니를 모두 살균하고 적절한 살균 드레이프를 놓습니다 ( 그림 3 </strong> B ). 생존 수술에 참여하는 직원은 최소한 수술 뚜껑, 마스크, 살균 장갑 및 안구 보호구를 착용해야합니다. 사타구니 주름에 색인 및 중간 손가락을 사용하여 대퇴부 펄스를 촉진합니다. 메스를 사용하여 1.5 cm 크기의 외과 적 절개를 만듭니다 ( 그림 3 C ). 외과 지혈이나 둔기 가위 ( 그림 3 D )와 같은 무딘 도구를 사용하여 gracilis 근육의 두 머리 사이를 해부합니다. 참고 : 대퇴 신경 혈관 번들은 일반적으로 이러한 두 근육 사이에서 발견됩니다. ( 도 4a ). 혈관 루프 또는 실크 넥타이를 사용하여 근위 및 원위 단부에서 동맥을 분리합니다. 루프를 사용하여 동맥을 피부의 높이까지 끝까지 당깁니다 ( 그림 4B ). 동안혈류를 방해하기에 충분한 근위부 넥타이에 견인력을 가하고, 한 쌍의 건 절단술 가위로 작은 동맥 절개술을하십시오. 동맥을 가로 지르지 않도록주의하십시오. 작은 동맥 절개만으로도 충분합니다. 또는 동맥에 접근하기 위해 needle-and-wire 접근법을 사용하십시오 ( 그림 4 C ). 근위 동점의 부드러운 견인은이 부분의 절차 중 과도한 혈액 손실을 예방합니다. 바늘 및 와이어 방식을 사용하는 경우 가이드 와이어 (키트와 함께 제공되거나 별도로 구입)를 바늘을 통과시켜 최대 5cm의 동맥에 통과시킵니다. 심실 외전을 일으킬 수 있으므로 전선을 더 멀리 전진시키지 않도록주의하십시오. 이 경우에는 즉시 1-2cm 전선을 빼내십시오. 용기에서 가이드 와이어를주의해서 제거하면서 용기에서 바늘을 제거합니다. 카테터를 전선과 혈관으로 부드럽게 통과시킵니다 ( 그림 4 <strong> D). 대퇴 동맥 카테터 삽입시 3-French, 8cm 카테터를 사용하십시오. 카테터의 팁이 혈관의 표면 벽에 처음 들어가면 약한 저항을 기대합니다. 동맥 절개 접근법을 사용하는 경우 카테터 또는 폴리에틸렌 튜빙을 용기로 직접 전진하십시오. 혈액 회수는 즉시 관찰해야합니다. 즉시 압력 변환기에 부착 된 카테터를 부착하십시오. 카테터를 정상 생리 식염으로 플러시하여 카테터 개통을 유지하십시오. 카테터를 제 위치에 고정시키는 봉합을하십시오. 오염을 방지하기 위해 멸균 된 거즈로 절개를 덮으십시오. 대퇴 동맥 도관 삽입술에 경피적 접근법을 사용하십시오. 참고 : 초음파는 숙련 된 기술자가 수행해야합니다. 수술 중 상태 및 모니터링 : 강제 공기 가온 장치로 새끼 돼지를 적극적으로 따뜻하게하고 지속적으로 모니터직장 온도 ( 그림 3A). 덱스 트로 오스를 함유 한 등장 액 (링거 젖당 또는 생리 식염수 중 5 % 덱스 트로 오스)을 유지율 (젖돈의 체중의 4 배, mL / hr)으로 주입하십시오. 섭동 (저혈압, 부정맥, 저 / 고열, 저산소증)에 대한 생체 신호 모니터링 참고 : 이상 징후의 경우 정상적인 생체 신호 범위와 해당 제안 관리가 표 1 에 요약되어 있습니다. 시중에서 판매되는 혈액 분석 시스템을 사용하여 실험 중 적어도 시간당 동맥혈 가스 (동맥 pH, pCO2, pO2), 전해질 (중탄산염, 기본 과량 / 결핍, 나트륨, 칼륨, 이온화 ​​칼슘), 헤모글로빈 및 포도당 측정 기간. 대퇴 동맥 도관에서 동맥혈 샘플을 가져옵니다. 참고 : 정상적인 산 염기 및 전해질 값과 비정상적인 경우 보정을위한 권장 사항표 1에 요약되어있다. 이소 플루 란 노출 3 시간 후 대퇴 동맥 도관을 제거하십시오. 근위부 혈관 실크를 조심스럽게 묶어 대퇴 동맥을 영구적으로 막아 출혈을 예방하십시오. 또는 혈관 클립을 사용하십시오. 절개를 닫기 전에 완전한 지혈을하십시오. 감염을 방지하기 위해 멸균 식염수 용액 10-20 mL로 절개를 관개하십시오. 실험이 끝나면 3-0 비 흡수성 봉합사 재료를 사용하여 단순하고 중단 된 봉합사로 피부 절개를 마무리하십시오. 고통 조절을 위해 1 : 200,000 에피네프린이 함유 된 0.25 % bupivacaine 0.5-1 mL / kg을 사용하여 상처에 침투하십시오. 절개를 멸균 된 외과 용 피부 접착제로 덮으십시오. 참고 : 드레싱은 필요하지 않습니다. 마취를 중단하고 새끼 돼지가 각성하게하십시오. 아와의 증상이 나타나면 기관 내 튜브를 제거하십시오.안정된 혈류 역학, 적절한 산소 공급 및 적절한 인공 호흡의 징후로 눈을 뜨고, 걷고, 걷어차 고, 입을 열고 닫는 케닝 (눈을 뜨고 발을 차디려고 시도). 인공 호흡 후 산소 공급과 환기의 적절성이 보장 될 때까지 페이스 콘을 통해 보충 산소를 공급하십시오. 추가 통증 조절을 위해 buprenorphine 0.05 mg / kg을 피하 투여. 또는, 경피적 펜타닐이 사용될 수있다. 적절한 경우 새끼 돼지를 새장으로 가져갑니다. 흉골의 정좌를 유지하기에 충분한 의식이 회복 될 때까지 돼지 새끼를 방치하지 마십시오. 마취에서 완전히 회복 될 때까지 다른 동물들과 함께 새장에 동물을 돌려 보내지 마십시오. 온난화로 개인 가정 새장을 적극적으로 따뜻하게하십시오. 숙련 된 수의사 또는 연구원이 마취 후 동물을 밀접하게 모니터하십시오. piglet milk replacer를 제공하십시오. 새끼 돼지가 회복하도록 허용하십시오.실험적 목표에 따라 48-72 시간 동안. 동물에서 수술 후 불편 함을 조절하는 경험이있는 동물 관리 직원의 재량에 따라 통증 조절을 보장하기 위해 필요시 3 시간마다 적절한 복용량으로 부프레핀을 사용하여 새끼 돼지를 주입하십시오. 수술 후 처음 6 시간 동안은 매시간, 그리고 이후 4 시간마다 새끼 돼지를 모니터링하십시오. 동물을 희생시키고 조직 조달을 수행하여 위에서 설명한대로 동물을 통제하십시오.