Framställning av horisontella skivor Adult mus Retina för elektrofysiologiska studier
Summary
Vi utvecklat en horisontell skiva beredning av den vuxna däggdjurs näthinnan med planet för snittning parallellt med retinal ytan. Dendritiska områden nonradially orienterade näthinnans nervceller inte trunkerade, vilket gör att studier av signalbehandling med patch-clamp och avbildningstekniker.
Abstract
Vertikala skiva preparat är väl etablerade för att studera kretsar och signalöverföring i den vuxna däggdjur näthinnan. Planet snitt i dessa preparat är vinkelrät mot näthinnans yta, vilket gör den idealisk för att studera radiellt orienterade nervceller som fotoreceptorer och bipolära celler. Emellertid de stora dendritiska hållare av horisontella celler, bredfälts amakrina celler och ganglieceller är mestadels stympad, lämnar markant reducerad synaptisk aktivitet i dessa celler. Medan ganglion celler och fördrivna amakrina celler kan studeras i en hel monterad beredningen av näthinnan, horisontella celler och amakrina celler som finns i det inre kärnskiktet är endast dåligt tillgängliga för elektroder i hela näthinnan vävnad.
För att uppnå maximal tillgänglighet och synaptiska integritet har vi utvecklat en horisontell skiva beredning av mus näthinnan, och studerade signalöverföring vid synapsen mellan fotoreceptorer och horisontellceller. Horisontell sektionering gör (1) lätt och entydig visuell identifiering av horisontella cellkroppar för elektrodinriktning och (2) bevarande av de förlängda horisontella cell dendritiska fält, som en förutsättning för intakt och funktionell kon synaptiska ingång till horisontella cell dendriter.
Horisontella celler från horisontella skivor uppvisade tonic synaptisk aktivitet i mörkret, och de svarade att informera ljusblixtar med en minskning av aktiv ström och minskad synaptisk aktivitet. Immunocytokemisk bevis tyder på att nästan alla koner i den dendritiska området en horisontell cell skapa synapser med dess perifera dendriter. Den horisontella skiva preparatet därför väl lämpad för att studera de fysiologiska egenskaperna hos horisontellt utsträckta näthinnans nervceller samt sensoriska signalöverföring och integration över utvalda synapser.
Introduction
Visuell information kodas som en dynamisk tid och rum mönster av fotoreceptor-aktivering, och bandet synapsen mellan fotoreceptorer och andra ordningens neuron bestämmer nedströms överföring av visuell information. Den vertikala skiva beredning av däggdjurs näthinnan är ett mycket värdefullt verktyg för att studera signalbehandling i vertikala vägar, det vill säga mellan fotoreceptorer och bipolära celler, och mellan bipolära celler och vissa typer av amakrina cell 1, 2, 3, 4.
Men vertikal sektionering orsakar alltid svår trunkering av de dendritiska områdena många näthinnans nervceller, vilket leder till betydande förlust av synaptiska kontakter. Speciellt i den yttre näthinnan, är horisontella celler påverkas på grund av deras sidled spridda utökade dendritiska fält och axon terminalsystem 5. I en vertikalförberedelser skiva, den synaptiska ingång hundratals kon fotoreceptor terminaler till dendriter i en horisontell cell således reduceras till några glesa kontakter. Detta kan räcka för att studera egenskaperna hos enskilda synapser, men det gör inte på något sätt representerar signalbehandlingsfunktioner ligger till grund för synkroniserad aktivering av fotoreceptorer band synapser.
Vi utvecklade därför en horisontell skiva beredning, vilket lämnar nästan alla könen ljusmätare synaptiska ingång till horisontella cell dendriter intakt och funktionell. Planet för sektione löper parallellt med ytan av näthinnan, helst skära genom det inre kärnskiktet mellan horisontella celler och amakrina celler. Sålunda är horisontella skivor av den yttre näthinnan skapas som innehåller, på den presynaptiska plats, fotoreceptorer med inre och yttre segment samt synaptiska terminaler, och horisontella celler och bipolära celler på den postsynaptiska stället. Detta preparat är väl lämpad to undersöka samordnade synaptiska ingångar i horisontella cell dendriter av alla kon fotoreceptorer inom sitt dendritiska fält. Det således kan vara användbar för att bättre förstå hur fotoreceptorn band synapsen, vilket är avgörande för överföring av visuell information från matrisen av fotoreceptoraktivering i en postsynaptiska svar.
Protocol
Representative Results
Discussion
I motsats till vertikala skivor, är den dendritiska morfologi radiellt orienterade neuroner som horisontella celler och amakrina celler väl bevarade. Jämfört med hela näthinnan preparat dessa celltyper är lätt åtkomliga för mikroelektroder och kan studeras genom både elektrofysiologiska och avbildningstekniker. Här har vi fokuserat på den yttre näthinnan; har dock ett liknande tillvägagångssätt har rapporterats speciellt för amakrina cellerna i inner näthinnan 10.
<p class="…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.
Materials
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35-mm petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20-gauge needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
