סינתזה של 1,2-Azaborines ואת ההכנה של קומפלקסי החלבונים שלהם עם מוטאנטים ליזוזים T4
Summary
A protocol for the synthesis of 1,2-azaborines and the preparation of their protein complexes with T4 lysozyme mutants is presented.
Abstract
We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor diffusion. Oxygen- and moisture-sensitive compounds are prepared and isolated under an inert atmosphere (N2) using either a vacuum gas manifold or a glove box. As an example of azaborine synthesis, we demonstrate the synthesis and purification of the volatile N-H-B-ethyl-1,2-azaborine by a five-step sequence involving distillation and column chromatography for the isolation of products. T4 lysozyme mutants L99A and L99A/M102Q are expressed with Escherichia coli RR1 strain. Standard protocols for chemical cell lysis followed by purification using carboxymethyl ion exchange column affords protein of sufficiently high purity for crystallization. Protein crystallization is performed in various concentrations of precipitant at different pH ranges using the hanging drop vapor diffusion method. Complex preparation with the small molecules is carried out by vapor diffusion method under an inert atmosphere. X-ray diffraction analysis of the crystal complex provides unambiguous structural evidence of binding interactions between the protein binding site and 1,2-azaborines.
Introduction
בורון-חנקן המכיל heterocycles (כלומר 1,2-azaborines) משך תשומת לב משמעותית לאחרונה isosteres של ארנס. Isosterism זה יכול להוביל גיוון של מוטיבים מבניים קיימים כדי להרחיב את השטח הכימי 2, 3, 4. יש Azaborines שירות פוטנציאל היישום במחקר ביו 5, 6, 7, 8, במיוחד בתחום של כימיה רפואית שבה כימאים לבצע סינתזה של ספריות של מבנית ומולקולות רלוונטיות מבחינה תפקודית. ראוי לציין, עם זאת, בעוד ישנם מסלולים סינטטיים מפותחים רבים למולקולות arene המכיל זמינות, רק מספר מצומצם של שיטות לסינתזה של azaborines דווח 9, 10, </sעד> 11, 12, 13. זאת בעיקר בשל מספר מצומצם של אפשרויות עבור מקור בורון ואת האוויר והטבע רגיש לחות של המולקולה בשלב המוקדם של רצף סינטטי.
בחלקו הראשון של מאמר זה, נתאר סינתזה סולם רב-גרם של N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) תוך שימוש בטכניקות אוויר ללא תקן. תרכובת זו משמשת ביניים צדדיים שיכול להיות פונקציונלי נוסף למולקולות מורכבות יותר מבחינה מבנית 14, 15. החל מ 3, סינתזה וטיהור N -H- B -ethyl-1,2-azaborine (5) לשימוש במחקרים חלבון מחייב יתוארו. בשל התנודתיות של 5, הבידוד היעיל שלה דורש שליטה מדויקת של טמפרטורת תגובה, זמן, distillation תנאים.
בחלק השני, פרוטוקולים עבור ביטוי חלבון ובידוד של מוטציות ליזוזים T4 (L99A ו L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 יוצגו, ואחריו התגבשות חלבון והכנת מתחמי קריסטל חלבון-ליגנד. מוטציות ליזוזים T4 L99A ו L99A / M102Q נבחרו כמערכות מודל ביולוגי לבחון את יכולת מליטה המימן של NH המכיל מולקולות azaborine 17. באמצעות פרוטוקול ביולוגיה מולקולרית סטנדרטי, החלבון מתבטא המתח Escherichia coli RR1 המושרה עם איזופרופיל- β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). טיהור חלבון מתבצעת באמצעות כרומטוגרפיה טור-חילוף יונים. התגבשות חלבון מתבצעת עם פתרון חלבון מטוהר מרוכז מאוד (> טוהר 95% על ידי ג'ל אלקטרופורזה) באמצעות התלייהטיפת שיטת דיפוזיה אדי. בשל הרגישות של ליגנדים של מחקר זה לחמצן, המתחמים ליגנד החלבון מוכנים בתנאי אוויר חינם.
Protocol
Representative Results
Discussion
בחלקו הראשון של פרוטוקול זה, תארנו סינתזה שונה של 1,2-azaborines מבוסס על שיטות שדווחו בעבר 12, 13. Triallylborane 22 שימש כתחליף המסלולים באמצעות allyltriphenyl allyltrifluoroborate פח או אשלגן להכין N -allyl- N adduct כלוריד -allyl -TBS- B (1). שי…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) and Boston College.
Materials
| Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
| Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free | Sigma Aldrich | 309966 | |
| Methylene chloride (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) | Fisher | D37-20 | |
| Toluene | Fisher | T290-4 | |
| Pentane, HPLC | Fisher | P399-4 | |
| Acetonitrile | Fisher | A21-4 | |
| Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 208027 | Pyrophoric |
| Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd | Strem | 46-1900 | |
| 1.0 M Boron trichloride solution in hexane | Sigma Aldrich | 211249 | Highly toxic/ Pyrophoric |
| Triethylamine, ≥99.5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
| Grubbs 1st generation catalyst | materia | C823 | |
| Acetamide | Sigma Aldrich | A0500 | |
| n-Butanol, anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 281549 | |
| Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane | Sigma Aldrich | 561452 | Highly toxic/ Pyrophoric |
| HCl solution, 2.0 M in Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| T4 lysozyme WT* (L99A) | Addgene | 18476 | |
| T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) | Addgene | 18477 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166 | |
| isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Invitrogen | AM9464 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher | BP329 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher | BP332 | |
| Sodium chloride | Fisher | S642212 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher | BP118 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M4880 | Corrosive |
| Thermo scientific pierce DNaseI | Fisher | PI-90083 | |
| GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris-base | Fisher | BP152-500 | |
| Sodium azide | TCI | S0489 | Highly toxic |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher | ICN806443 | |
| Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators | Fisher | 14-558-501 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| 2-Hydroxyethyl disulfide | Sigma Aldrich | 380474 | |
| N-paratone | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher | 08-667E | |
| CryoLoop | Hampton Research | cryogenic tubing shaped into a loop | |
| CryoTong | Thermo Fisher | cryogenic tong | |
| Coot | Electron density images are generated from the software |
References
- Ducruix, A., Giége, R. . Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , (1992).
- Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
- Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -. Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
- Wang, X. -. Y., Wang, J. -. Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
- Zhou, H. -. B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
- Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
- Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
- Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
- Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
- White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
- Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
- Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -. Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
- Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -. Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
- Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -. Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
- Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -. Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
- Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
- Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
- Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
- Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Biochimie. 34 (27), 8564-8575 (1995).
- Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
- Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -. Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
- Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).
