JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Het ontrafelen van de functie van een bacteriële Effector uit een niet-landbouw Plant Pathogeen Met behulp van een gist two-hybrid screen

Published: January 20, 2017
doi:
10.3791/55150
,
1Department of Molecular Biology – Functional Genomics,Laimburg Research Centre

Summary

Bacteriële effector eiwitten zijn belangrijk voor het vaststellen succesvolle infecties. Dit protocol beschrijft de experimentele identificatie van proteïne bindingspartners van een bacteriële effector eiwit in zijn natuurlijke plantaardige gastheer. Het identificeren van deze effector interacties via gist-twee-hybride-schermen is uitgegroeid tot een belangrijk instrument in het ontrafelen van de moleculaire pathogeniteit strategieën.

Abstract

Het ontrafelen van de moleculaire mechanismen van de ziekte verschijnselen is belangrijk om pathologieën en symptoomcontrole ontwikkeling in plantaardige wetenschap begrijpen. Bacteriën hebben verschillende strategieën ontwikkeld om hun gastheer stofwisseling te manipuleren voor hun eigen voordeel. Deze bacteriële manipulatie gaat vaak gepaard met ernstige symptoom ontwikkeling of de dood van de aangetaste planten. Vaststellen van de specifieke bacteriën die verantwoordelijk zijn voor de gastheer manipulatie heeft belangrijke veld microbiologisch onderzoek. Na de identificatie van deze bacteriële moleculen, genaamd "effectors" is het belangrijk om de functie te helderen. Een eenvoudige benadering bepalen van de functie van een werkzame middel zijn eiwitachtige bindingspartner identificeren zijn natuurlijke gastheer via een gist twee-hybride (Y2H) scherm. Normaliter de gastheer herbergt talrijke potentiële bindingspartners die onvoldoende kunnen worden voorspeld door een in silico algoritme. Het is dus de beste keuze om perform een ​​scherm met de hypothetische effector tegen een hele bibliotheek van tot expressie gastheer eiwitten. Het is vooral een uitdaging als de verwekker is uncultivable als fytoplasma. Dit protocol biedt stap-voor-stap instructies voor het DNA-zuivering uit een phytoplasma besmet houtige waardplant, de versterking van de potentiële effector, en de daaropvolgende identificatie van moleculaire interactie partner van de plant met een Y2H scherm. Hoewel Y2H schermen vaak worden gebruikt, is er een trend om deze techniek te besteden aan biotechbedrijven de Y2H service tegen een kostprijs. Dit protocol bevat instructies over hoe je een Y2H presteren in elk fatsoenlijk uitgerust laboratorium voor moleculaire biologie met behulp van standaard lab technieken.

Introduction

Gist twee-hybride-screening (Y2H) werd ongeveer 27 jaar geleden 1 ontwikkeld en sindsdien grote schaal gebruikt in verschillende gebieden van specifieke eiwit-eiwit interacties 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 bepalen, 11 . De fysieke interactie van een bacteriële effector met samen doeleiwit is vaak de voorwaarde voor de functionele manipulatie van deze doeleiwit. Analyseren van deze interacties is verhuisd naar de focus van veel verschillende sectoren van infectiebiologie 12, 13, 14, 15,"> 16, 17, 18. Het principe van de Y2H scherm is dat de wisselwerking van twee proteïnen leidt tot het herstel van een functionele transcriptiefactor die de expressie van reportergenen aandrijft. De bekende effector (het" lokaas ") wordt translationeel gefuseerd aan het DNA bindend domein (DBD) van de transcriptiefactor, en de potentiële interactiepartners (de "prooi") worden gefuseerd aan het activeringsdomein (AD) van de respectievelijke transcriptiefactor. Aangezien de interactie partner is onbekend, een bibliotheek van potentiële interactors wordt gekloneerd in de zogenaamde "prooi-library." Normaal wordt deze bibliotheek door kloneren cDNA in een geschikte prooi vector expressieplasmide coderend voor het AD die compatibel is met de lokaas-vector gecodeerde DBD is. bij een interactie de gereconstitueerd transcriptiefactoren induceren de expressie van reportergenen, die globaal de groeiselectie gist mogelijk maken. deidentificatie van interactoren wordt verkregen door sequentiebepaling van het prooiplasmide met plasmide-specifieke primers.

Bacteriën hebben verschillende strategieën ontwikkeld om manipuleren en exploiteren metabolisme hun gastheer of afweermechanismen onttrekken en scheiden effectormoleculen via verschillende bacteriële secretie systemen 19, 20, 21. Het bepalen van de bindingspartners van deze bacteriële effectoren is dus de eerste stap het identificeren van de gemanipuleerde route in de gastheer. Dit leidt tot een beter begrip van de specifieke mechanismen pathogeniciteit.

Y2H schermen worden uitgevoerd bacteriële effector interacties te identificeren tijdens phytoplasmoses en vaak Y2H is een cruciale eerste experiment voor verdere karakterisering van moleculaire mechanismen pathogeniteit phytoplasma onderzoek 22, 23. De ontmoetinghod beschrijving in de meeste publicaties is vrij schaars, en deze technieken zijn vaak uitbesteed aan biotechbedrijven. Om de aandacht te vestigen op de haalbaarheid van deze methode, dit protocol biedt stap-voor-stap informatie om de interactie partners van een bacteriële effectormolecuul te identificeren in zijn natuurlijke gastheer.

Ondanks het brede gebruik en de fast forward aanpak van Y2H schermen, moet niet worden vergeten dat bepaalde interacties niet kunnen optreden in de gist systeem. Dit komt door het feit dat de gistcel wordt gebruikt als een soort "in vivo reactievat" met bepaalde biologische beperkingen. Verschillende auteurs hebben de voor- en nadelen van Y2H en zijn derivaten 11, 24, 25, 26, 27 aangepakt. Algemene overwegingen zijn, bijvoorbeeld dat de gistcel niet nuttig zou verschaffengenexpressie, (post-) translationeel of translocational voorwaarden voor de respectievelijke eiwitten worden bestudeerd. Dit kan leiden tot vals-negatieve resultaten in het scherm. Positieve interacties beurt kan artefacten en kunnen niet voorkomen in natuurlijke toestand (dwz bij effectoren in de geschikte gastheer). Het is dus noodzakelijk om de interacties van de heterologe gistexpressiesysteem een ​​onafhankelijke interactie testen bevestigen een verwant biologisch systeem.

In deze studie werden de bindende partners van de effector ATP_00189 uit de niet-landbouw plant-pathogeen Candidatus fytoplasma mali (P. mali) geïdentificeerd. De resultaten geven belangrijke inzichten in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het symptoom ontwikkeling van apple proliferatie 28, een ziekte die hoge economische verliezen in de getroffen-appel groeiende regio's zorgt ervoor dat in Europa 29.

Protocol

1. Het verzamelen van Root en Leaf Monsters van Infected Appelbomen Opmerking: Pathogeen-specifieke DNA kan worden gezuiverd uit wortels of bladeren. Het volgende hoofdstuk geeft een protocol voor de bemonstering van beide. DNA bereiding Monstername en de voorbereiding van de wortels Identificeer besmette bomen met "apple proliferatie"-specifieke symptomen 30, 31 en controle bomen die klachtenvrij zijn. Met schone snoeischaar, gesneden wortel monsters die een diameter hebben van 0,5 – 1 cm en een lengte van ongeveer 5 cm. Cut monsters uit drie verschillende, afgelegen plaatsen van het wortelstelsel, en leg ze in behoren geëtiketteerd plastic zakken. Houd de monsters in een koude ruimte met gekoelde koelelementen en bewaar in de koelkast bij 4 ° C tot verdere verwerking. Opmerking: Root architectuur en structuur kunnen variëren met betrekking tot de fysiologische toestand of de boom. Het is belangrijk monsters op drie verschillende plaatsen en te dunne wortels te nemen. De monsters kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen bij 4 ° C, maar langere opslagtijden verhogen het risico van gieten. Beschimmelde monsters kunnen niet worden gebruikt voor DNA-bereiding. Spoel de wortelmonsters met water om het vuil te verwijderen. Doe ze in een steriele petrischaal en het gebruik van een gesteriliseerde scalpel aan de wortel opperhuid en de cortex te verwijderen. Maak de scalpel met een schone, niet-pluizende tissue af te vegen, doopt het in 70% (v / v) ethanol wateroplossing, en warmte-steriliseren boven een open vuur (bijv bunsenbrander). Kras het floëem met de scalpel, snijd hem in kleine stukjes, en de hoeveelheid 30-100 mg van de gehakte bastweefsel in een steriele 2,0 ml reageerbuis. Bewaar de monsters bij -80 ° C gedurende enkele maanden. Monstername en voorbereiding van bladeren Identificeer een geïnfecteerde en een asymptomatische controle boom, eens beschreven in stap 1.1.1.1, en kies tien ongedeerd bladeren per boom. Één boom per aandoening voldoende. Spoel de bladeren met water en het oppervlak reinigen door 70% (v / v) ethanol oplossing. Doe de bladeren in een steriele petrischaal en ontleden de middennerf (centrale ader) van elk blad met een steriele scalpel. Verwijder de epidermis en de cortex van de hoofdnerf, snijd de hoofdnerf in kleine stukjes en hoeveelheid 100 mg van de hoofdnerf weefsel in een steriele 2,0 ml reactiebuis. Gebruik de monsters onmiddellijk naar DNA bereiding en opslag bij -80 ° C gedurende enkele maanden. Opmerking: Het is handig om het plantenmateriaal aliquot in porties van 100 mg en uiteindelijk bevriezen voor opslag. Elke hoeveelheid kan direct worden gebruikt voor DNA-bereiding. Met een gewicht van diepgevroren plantmateriaal is omslachtig, omdat het bevroren plantmateriaal heeft de neiging om brokken te vormen. 2. cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB) -gebaseerde DNA Bereiding <p class = "jove_content"> Opmerking: DNA kan worden gezuiverd met behulp van elke kolom gebaseerde DNA zuiveringswerkwijze voor plantmateriaal. In deze paragraaf wordt een CTAB-gebaseerde werkwijze voor DNA-zuivering beschreven. DNA zuivering wordt uitgevoerd op basis van een gemodificeerd protocol elders 32 beschreven. Bereid de volgende buffers: CTAB buffer: Los 1% w / v cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB, Mr: 364,45 g / mol), 100 mM trishydroxymethylaminomethane (Tris, Mr: 121,14 g / ml), 1,4 M natriumchloride (NaCl, Mr: 58,44 g / mol) en 20 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur dinatriumzout (NaEDTA, Mr: 372,24 g / mol) in water en stel deze op pH 8,0. N-lauroylsarcosine buffer: Los 10% w / v N-lauroylsarcosine-natriumzout 33 (Mr: 293,38 g / mol), 100 mM Tris en 20 mM NaEDTA in water en breng de pH op 8,0. Tris-EDTA (TE) -buffer: Los 10 mM Tris en 1 mM NaEDTA in water en autoclave de oplossing. Ammoniumacetaatoplossing: Bereid een 5 M ammoniumacetaat (Mr: 77,0825 g / mol) in water en deze autoclaaf bij 120 ° C en 1,2 bar gedurende 20 minuten. Mix 30-100 mg vers of bevroren gehakte plantenmateriaal (stap 1.1.2.2.) Met 300 ul CTAB-buffer, 30 ui N-lauroylsarcosine buffer, 6 pl proteinase K (10 ug / ul) en 12 ui 2-mercaptoethanol 34 (Mr: 78,13 g / mol). Schud gedurende 60 minuten bij 60 ° C. Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur alvorens verder te gaan. Voeg 360 ul van ammoniumacetaatoplossing en meng krachtig. Laat de oplossing gedurende 5 minuten zitten en centrifugeer in bij 15.000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Breng de supernatant een schoon buisje en voeg 720 ul ijskoude isopropanol 35. Precipiteren van het DNA ten minste 30 minuten bij -20 ° C. Centrifugeer het mengsel bij 15.000 xg gedurende 30 min bij 4° C en gooi de supernatant. Was de pellet met 500 ul ijskoude 70% ethanol en spin neer bij 15.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Gooi de ethanol supernatant en onmiddellijk dompel de flacon op een schone papieren handdoek om de resterende druppels te verwijderen. Zorg ervoor dat u zo veel vloeistof te verwijderen mogelijk te maken. Lucht Droog de pellet gedurende 15-20 minuten of gedurende 2-3 minuten in een vacuüm centrifuge concentrator. Niet over-droog de pellet door een teveel aan verwarming of uitgebreid verdamping tijden. Resuspendeer de pellet in 700 ui TE-buffer en uiteindelijk opwarmen tot 37 ° C om oplossen te vergemakkelijken. Voeg 10 ul RNAse (10 ug / ul) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C, onder schudden bij 300 rpm. Voeg 700 ul chloroform: isoamylalcohol 36 24: 1 en meng. Centrifugeer het mengsel bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en breng de bovenste fase van het supernatant naar een nieuwe, schone flacon. Precipiteren van het DNA in het supernatant door het toevoegen700 pl 2-propanol 35 (isopropanol, Mr: 60,1 g / mol) en incuberen gedurende ten minste 30 minuten bij -20 ° C. Centrifugeer het mengsel bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en werp de supernatant. Was de pellet met 500 pl 70% ethanol en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Droog de pellet zoals beschreven in stap 2.5. Oplossen in 50 ui TE. 3. Het opsporen Candidatus fytoplasma mali-specifieke DNA door PCR Verdun het DNA gezuiverd uit het plantmateriaal 01:10 in nuclease-vrij water en uitvoeren van een PCR met pathogeen-specifieke primers 37. Controleer de aanwezigheid van P. mali specifieke DNA in het plantaardige materiaal door middel van een kwantitatieve PCR-protocol met primers en probes specifiek voor P. mali fytoplasma 37. Controleer de afwezigheid van de andere leden 16SrX phytoplasma door dezelfde PCR met de respectieve probes voor Cand. P. prunorum en Cand. P. pyri DNA 37. OPMERKING: DNA van een niet-geïnfecteerde boom moet ook worden getest op de afwezigheid van een pathogeen dit besturingselement bevestigen. Bij deze stap is het belangrijk dat DNA van andere nauw verwante species phytoplasma afwezig is in het monster, aangezien dit het risico van het amplificeren van de effector die niet van P. mali phytoplasma species zou toenemen. Een gemengde infectie met een andere nauw verwante P. mali 16SrX groep phytoplasma wordt uitgesloten door het analyseren van het monster met de respectievelijke sondes. Daar de verwachte resultaten negatief voor andere 16SrX phytoplasma moet zijn, is het belangrijk om de juiste positieve controles die PCR werkzaamheid vermeldt. 4. het versterken van de potentiële effector Gene en subklonering in de Y2H Bait Vector Versterken de phytoplasmal gen atp_00189 (niet bestaande uit de signaalpeptide gedeelte) van P. MALI met behulp van de primers 5-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (voorwaarts) en 5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (achteruit), met restrictie sites voor EcoRI en SalI de 5 'en 3' einden, respectievelijk. Zuiver het PCR product met kolommen gebaseerde DNA zuiveringsmethode. Kloon de amplicon in de Y2H aas vector Plexa-N via EcoRI en Sali ligatie. LET OP: Hier, 100 ng van EcoRI en Sali gelineariseerd Plexa-N vector werd gecombineerd met 15 ng evenzo verteerd atp_00189 PCR amplicon en 1 U T4-ligase. De ligatie werd uitgevoerd in buffer die 40 mM Tris-HCl (pH 7,9 bij 25 ° C), 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreïtol (DTT, Mr: 154,25 g / mol) en 0,5 mM adenosine trifosfaat (ATP, M r: 507,18 g / mol) in een totaal volume van 10,0 pl bij 16 ° C overnacht (14-20 uur). Analyseer de DNA van de niet-geïnfecteerde boom met dezelfde primers uit te sluiten niet-specifieke primer binding aan Malus domestica x </Em> DNA. Transformeren 1 pi van het ligatiemengsel in E. coli elektrocompetente cellen en selecteren op kanamycine-resistente klonen op Luria-Bertani (LB) platen gesupplementeerd met 50 ug / ml kanamycine sulfaat 38. Zuiver het plasmide DNA uit de geselecteerde bacteriële klonen met kolommen gebaseerde plasmide mini preparaat kit volgens de instructies van de fabrikant en controleer de succesvolle integratie en oriëntatie van het inzetstuk 39 door sequentiebepaling. 5. Test voor Self-activering (Auto-activering) van de mogelijke effector Protein Bereid de volgende buffers en groeimedia: OPMERKING: De nomenclatuur voor gist-selectieve platen hyphenates de afkortingen van de ontbrekende aminozuren in de respectievelijke medium met een "-" voor de afkorting. Bijvoorbeeld, SD-TRP-leu-zijn platen bevatten alle aminozuren, maar trp, leu en zijn. 10x uitval mix: Weigh200 mg L-arginine monohydrochloride (Mr: 210,66 g / mol), 300 mg van L-isoleucine (Mr: 131,17 g / mol), 269 mg L-lysine monohydraat (Mr: 164,21 g / mol), 200 mg van L-methionine (Mr: 149,21 g / mol), 500 mg L-fenylalanine (Mr: 165,19 g / mol), 2 g L-threonine (Mr: 119,12 g / mol), 300 mg L-tyrosine (Mr: 181,19 g / mol), 200 mg L-uracil (112,09 g / mol) en 1,5 g L-valine (Mr: 117,15 g / mol). Ontbinden hen in 1 L tweevoudig gedestilleerd water en autoclaaf de oplossing. Bewaar de oplossing bij 4 ° C. LET OP: De respectievelijke uitval mix kan ook gekocht vooraf gemengd. 10x L-adenine supplement: Weeg 100 mg van L-adenine hemisulfaatzout (ade, M r: 184,17 g / mol) en los het op in 50 ml dubbel gedestilleerd water. Filter steriliseren van de oplossing met een 0,22 urn filter poriën. 10x L-histidine supplement: Weeg 100 mg van L-histidinemonohydrochloridemonohydraat (zijn, Mr </sub>: 209,63 g / mol) in 50 ml dubbel gedestilleerd water en filter gesteriliseerd met een 0,22 urn filter poriën. 10x L-leucine supplement: Weeg 500 mg L-leucine (Leu, Mr: 113,17 g / mol) in 50 ml dubbel gedestilleerd water en filter gesteriliseerd met een 0,22 urn filter poriën. 10x L-tryptofaan supplement: Weeg 100 mg L-tryptofaan (trp, Mr: 204,23 g / mol) in 50 ml dubbel gedestilleerd water en filter gesteriliseerd met een 0,22 urn filter poriën. SD-trp-leu-his-ade-medium en platen: Los 0,67% w / v gist-stikstofbase (zonder aminozuren) en 2% w / v D-glucose monohydraat (Mr: 198,17 g / mol) in dubbel- gedestilleerd water en autoclaaf. Voor agarplaten, voeg 2% w / v agar (microbiologische kwaliteit) voorafgaand aan autoclaveren. Selectieve petrischaal, voeg 1x van het aminozuur stockoplossing aan de geautoclaveerde Sd-trp-leu-his-ade medium. Bij de voorbereiding van platen, zorg ervoor dat de agar wordt afgekoeld tot -50 ° C voor het toevoegende aminozuren. Houd de voorraad oplossingen steriel. YPAD medium: Los 1% w / v gistextract, 2% w / v pepton (microbiologische kwaliteit), 0,004% w / v adenine hemisulfaatzout (Mr: 184,17 g / mol) en 2% w / v glucose monohydraat dubbel gedestilleerd water en autoclaaf. Voor YPAD agarplaten, voeg 2% w / v agar voorafgaand aan autoclaveren. Om 2x YPAD bereiden, gebruik tweemaal de concentraties van de bovengenoemde bestanddelen. Opmerking: (optioneel) Door de hoge glucoseconcentratie in het medium, 2x YPAD medium wordt donker bruinachtig na het autoclaveren. Als alternatief kan een 40% (w / v) glucose voorraadoplossing kan worden bereid en gesteriliseerd door deze door een 0,22 urn filter. De filter-gesteriliseerde glucose voorraadoplossing wordt vervolgens onder steriele omstandigheden aan de geautoclaveerde 2x YPAD (weinig glucose) toegevoegd. Om het volume fouten te voorkomen, moet de 2x YPAD worden voorbereid, in gedachten houden dat een 10x glucose oplossing vervolgens wordt toegevoegd. Dat betekent dat, bijvoorbeeld, in plaats van 1 Lof medium, op slechts 900 ml is opgesteld (met daarin alle ingrediënten behalve glucose) en geautoclaveerd, en vervolgens 100 ml glucose voorraad oplossing wordt toegevoegd. Lithiumacetaat-bemiddelde transformatie van gist voor testen zelfactivering Streak de Saccharomyces cerevisiae verslaggever stam NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2: :( LexAOp) 4-HIS3 URA3: :( LexAOp) 8-lacZ ade2: :( LexAOp) 8-ADE2 GAL4) uit een bevroren glycerol voorraad op een YPAD agarplaat en incubeer het voor 48 uur bij 30 ° C. Pick kolonies van deze plaat en het enten van 50 ml YPAD medium. Laat de gist groeien en regelmatig meten van de OD 600 om de groei te volgen. Laat de gist te laten groeien tot een uiteindelijke OD600 van 0,5-0,8. Pellet de cellen door te centrifugeren bij 700 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer ze in 2,5 ml dubbel gedestilleerd, geautoclaveerd water. Bereid zes monsters met 100 ul van gistsuspensie en voeg 240 ul van 50% W / v polyethyleenglycol 4000 (PEG, M r: 3,500-4,000 g / mol), 36 pl 1 M lithium acetaat dihydraat (LiOAc, Mr: 102,02 g / mol) en 25 ui 2% w / v zalmsperma DNA (opgelost). Bereid alle reagentia met tweemaal gedestilleerd, steriel water. Label de zes flesjes die de gistsuspensie van "a" tot "f" en voeg de volgende plasmidevector DNA: negatieve controles: (a) 1,5 ug bait plasmide met de effector (Plexa-N-atp00189 28), (b) 1,5 ug leeg prooiplasmide pGAD-HA 41, (c) 1,5 ug aas lege vector Plexa N-41, en (d) 1,5 ug lege vector Plexa lokaas-N en 1,5 ug leeg prooiplasmide pGAD-HA; positieve controles: (e) 1,5 ug van de positieve controle bait plasmide-DNA Plexa-p53 41 en 1,5 ug positieve prooi plasmide pACT-larget 41; en de zelf-activatie test: (f) 1,5 ug baHet plasmide met de effector (Plexa-N-atp00189) en 1,5 ug lege prooi plasmide pGAD-HA. Meng de reacties krachtig en incubeer ze gedurende 45 minuten bij 42 ° C in een waterbad. Pellet de cellen gedurende 5 min bij 700 xg Verwijder de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de cellen in 250 pl 0,9% (w / v) natriumchlorideoplossing (NaCl, Mr: 48,44 g / mol) en 50 pl uitgespreid op de volgende selectieve platen: SD-trp, leu-Sd, SD-Trp leu, SD-TRP-leu-zijn, en SD-trp-leu-zijn-ade. Incubeer de platen gedurende 3-4 dagen bij 30 ° C. Na de eerste dag van de incubatie, verzegelen de platen met plastic folie paraffine te voorkomen dat de platen uitdroogt. Controleer de gistgroei op de platen. 6. Test de expressie van de effector Test de expressie van de effector door Western blot met een antilichaam 42 tegen de Lex-A label die gekoppeld is aan de N-terminus van de effector bijexpressie van Plexa-N. Opmerking: Bedenk dat het translationeel gefuseerd Lex-A tag voeg ongeveer 24 kDa tot het werkelijke gewicht van het eiwit van belang. Dit is belangrijk bij het identificeren van het eiwit grootte in de Western blot. 7. De Y2H Screen Streak de Plexa-atp00189 (effector) getransformeerde NMY51 op een verse SD-trp bord en laten groeien voor 2-3 dagen bij 30 ° C, totdat rode kolonies verschijnen. Enten 3 ml SD-medium trp in een kleine schudkolf met een rode kolonie van de agarplaat en incubeer overnacht bij 30 ° C met schudden bij 120-150 rpm. Enten 20 ml SD-trp in een schudkolf met 1 ml van de overnacht cultuur en laten groeien van 8 uur. Stel de cultuur OD 600 = 0,2 door toevoeging SD-trp medium en beënt 2x 100 ml schudden in kolven met 10 ml van de startercultuur elk. Kweek gedurende de nacht onder schudden bij 30 ° C. Opmerking: Zorg ervoor dat de gist niet groeien tot OD 600> 0,5 en verdun met verse SD-TRP. Meet de OD 600 en de pellet 120 OD 600 'eenheden'. Als bijvoorbeeld een OD 600 van 1,2 wordt gemeten, het afsluiten 100 ml, gooi het supernatant en resuspendeer de pellet in 800 ml voorverwarmd 2x YPAD in een schudkolf met een magnetische roerstaaf. Spin in een 2-mL, de bovenstaande vloeistof, en resuspendeer de pellet in water. Zorg ervoor dat de OD 600 van de gistsuspensie is tussen 0,15 en 0,2. Zo niet, stel met 2x YPAD of voeg meer gist uit het 's nachts cultuur. Opmerking: 2x YPAD is donkerbruin en kunnen de resultaten van de OD meting beïnvloeden. Derhalve is het noodzakelijk om de gistcellen in water mengen alvorens de OD. Als alternatief kan 2x YPAD worden bereid door steriliseren glucose afzonderlijk, zoals beschreven in de stap 5.1.8 intoetsen die de donkere kleur van het medium voorkomt. Incubeer de resterende gist cultuur in een appropriately formaat schudkolf (800 ml in een 2 L schudkolf of verdeel 2 x 400 ml in twee 1 L schudkolven) en incubeer bij 30 ° C, 120-150 tpm. Meet de OD 600 ongeveer elke 1,5 uur totdat een OD 600 van 0,6 is bereikt (duurt 4-6 uur). In de tussentijd, de voorbereiding van de in de volgende stap beschreven oplossingen. Lithium-acetaat gemedieerde transformatie Los 2% w / v zalmsperma DNA in water en kook 500 uL gedurende 5 minuten in een waterbad bij 100 ° C. Plaats de buis op ijs gedurende 2 minuten en herhaal de verwarming stap. Houd het DNA op ijs tot gebruik. Bereid de volgende mixen: TE / LiOAC mix: Meng 3,08 ml 1 M LiOAC, 3,08 ml 100 mM Tris / 10 mM EDTA (pH: 7,5) en 21,84 ml steriel dubbel gedestilleerd water. PEG / LiOAc mix: Combineer 4,2 ml 1 M LiOAc, 4,2 mL mM Tris / 10 mM EDTA (pH: 7,5) en 33,6 ml 50% (w / v) PEG 4000. Centrifuge de 800-mL gistcultuur (OD 600 = 0,6)bij 700 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 ml steriel dubbel gedestilleerd water. Pellet de cellen opnieuw bij 700 xg gedurende 5 minuten en gooi de supernatant. Opmerking: Zo nodig verdeel de schorsing in meerdere flesjes voor centrifugeren. De vloeistof volumes in 7.7.3. en 7.7.4. Zie de gehele pellet afkomstig van 800 ml suspensie. Resuspendeer het pellet in 16 ml TE / LiOAc mix (zie stap 7.7.1.1); spin down bij 700 xg gedurende 5 minuten en gooi de supernatant. Resuspendeer de pellet in 9,6 ml TE / LiOAC mix. Bereid de volgende reactie mengt in de juiste maat reactie polypropyleen schepen: 12 flacons met 7 ug pGAD-HA-cDNA-bibliotheek vector, 100 ul van 2% zalmsperma DNA (zie stap 7.7) en 2,5 ml PEG / LiOAc mix. Voeg 600 ul gist celsuspensie uit stap 7,10 tot elk van de 12 flesjes en meng krachtig gedurende 1 min. Incubeer het reactiemengsel gedurende 45 minuten bij 30 ° C in een waterbad eend meng krachtig elke 15 min. Voeg 160 ul van DMSO aan elk flesje en meng krachtig. Incubeer het mengsel nog 20 minuten bij 42 ° C. Pellet de cellen bij 700 g gedurende 5 min, gooi het supernatant en resuspendeer elke pellet in 3 ml 2x YPAD. Zwembad alle cellen (in totaal 36 ml van de 12 injectieflacons) in een 100 ml schudkolf en incubeer de gist gedurende 90 minuten bij 30 ° C en 120 rpm. Pellet de cellen gedurende 5 min bij 700 xg Verwijder de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de pellet in 4,5 ml steriele 0,9% (w / v) NaCl en meng door voorzichtig pipetteren en neer met een 10-mL serologische pipet. Trekken 50 ul voorbereiding tienvoudige verdunningen in 0,9% NaCl van 1:10 tot 1: 1000. Plaat 100 ul van elke verdunning op 90 mm platen met SD-trp-leu agar. Verdeel de rest van de onverdunde gist resuspensie op 16- x 150 mm petrischaaltjes met SD-trp-leu-zijn-ade agar. Voeg 3-AT aan het medium zelf-activatie verlagen. Incubeer de SD-TRP-leuplaten gedurende drie dagen en de SD-trp-leu-his-ade platen gedurende vier dagen bij 30 ° C. LET OP: Klonen die op de selectieve platen verschijnen zijn (potentiële) interactie paren en dragen de pGAD-HA-plasmide dat codeert voor het aas interactie partner. Bepaal de transfectie-efficiëntie door het tellen van de kolonies van verschillende seriële verdunningen op de SD-trp-leu selectieplaten. Transfer elke kloon door het plukken en strepen de kolonie met een steriele pipet tip op verse SD-TRP-leu-zijn-ade-selectieve platen. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 30 ° C. Herhaal deze stap elke dag tot een totaal van vijf passages wordt bereikt. 8. Analyse van de Klonen uit de Selective Plates Bereid een steriele 2 ml reactiebuis met 1 ml SD-trp-leu-his-ade voor elke kloon onder een steriele kap. Sla een gat in elke buis met een hete naald en bedek het gat met een stuk van gasdoorlatende sealer. Wordt geënt in elk flesje met verse kolonie mate riaal uit één kloon (stap 7,17; gebruiken klonen na de 5de passage) en incubeer gedurende 24 uur bij 30 ° C, onder schudden bij 150 rpm. Opmerking: Het is belangrijk om klonen te nemen van een nieuwe plaat, omdat gist genomen uit platen bewaard meerdere dagen bij 4 ° C onvoldoende groeien binnen 24 uur in vloeibaar medium. Pellet de gist gedurende 5 min bij 4000 xg en gooi de supernatant. Resuspendeer de pellet in de juiste hersuspensiebuffer (uit het respectieve plasmide-DNA miniprep kit) en overgebracht naar een nieuwe 2,0 ml reactiebuis. Voeg 100 ul van met zuur gewassen glasparels (425- tot 600-um diameter) en meng krachtig gedurende 5 minuten. Voeg de respectievelijke lysis buffer en ga verder met het plasmide zuivering met gebruik van een plasmide preparaat mini kit volgens de instructies van de fabrikant. Elueer het plasmide DNA met 50 pl water. Met het DNA uit stap 8.3 een sequencing reactie met het prooiplasmide-specifieke primer, GAL4ADseqref "> 41 5'ACCACTACAATGGATGATG -3 '. Controleer of de interactie met de novo co-transformatie van 43, 44, het aas en de prooi vector. Selecteer de getransformeerde gist op SD-trp-leu-zijn-ade selectie platen.

Representative Results

Voorafgaand aan de eigenlijke Y2H scherm kan worden uitgevoerd moet het aas worden getest op zelfwerkzaamheid. Dit wordt bereikt door transformatie samen het aas expressievector met de lege vector prooi bibliotheek en controle groei op selectieve platen. Om te analyseren of de phytoplasmal eiwit ATP_00189 is self-activerende, werd de zelf-activatie test uitgevoerd zoals beschreven in hoofdstuk 5. De bait plasmide wordt als aanvulling op de TRP en de prooi plasmide de leu auxotrofie van S. cerevisiae NMY51 40. Een succesvolle co-transformatie wordt dus gekenmerkt door groei op selectieve platen ontbreekt trp en leu. Interactie van het aas en een prooi eiwit leidt tot een complementering van het zijn en ade auxotrofie van NMY51. Als zelfwerkzaamheid door het aas in de afwezigheid van een interactie verschijnt, de gist groeit op selectieve platen ontbreekt zijn en ade. Sterke en zwakke zelf-activatie kan optreden. Sterke zelf-activatie van het aas wordt gekenmerkt door de groei van de gecotransformeerde gist op trp-leu-his-ade uitgeputte selectieplaten. Zwakke zelf-activatie leidt tot groei op trp-leu-his maar niet op trp-leu-his-ade uitgeputte selectieplaten. Proper positieve controles zijn onmisbaar voor de interpretatie van de resultaten van de zelfwerkzaamheid assay. Een samenvatting van de verwachte resultaten van de zelf-activatie assay en de interpretatie daarvan is opgenomen in tabel 1 en weergegeven in figuur 1. Figuur 1: Voorbeeld van Bait Self-activering Tests van een Bait voordat u een Y2H Screen. S. cerevisiae NMY51 werd co-getransformeerd met interactie aas (plex-p53) en prooi (pACT-LARGET) als een positieve controle (linker paneel: ac), een zwak zelfwerkend plus een lege prooi weegschaalry vector (middelste paneel: df) en een niet zelfactiverende aas plus een lege prooi bibliotheek vector (rechter paneel: gi). De gecotransformeerde gist werden gekweekt op SD-platen ontbreekt trp en leu (bovenpaneel: a, d, g), trp, leu en zijn (middenpaneel: b, e, h) en trp, leu, zijn en ade (lagere paneel: c, f, i). Selectie op medium zonder trp en leu is een positieve controle voor een succesvolle co-transformatie, als het aas vector een aanvulling op de TRP auxotrofie en de prooi vector de leu auxotrofie van NMY51 (groei op SD-trp-leu). Bij een interactie tussen aas en prooi of een zelf-activatie van het aas, wordt de reporter expressie van NMY51 ingeschakeld en de aanvulling zijn en ade auxotrofie (groei op SD-trp-leu-his-ade). Een zwakke zelfwerkzaamheid wordt gekenmerkt door groei op een SD-trp-leu-platen zijn (middelste paneel, df). Zwakke zelf-activatie van aas worden verminderd vóór de analyse van de aasin een Y2H scherm, bijvoorbeeld door het toevoegen van 3-AT aan de selectieve media. Aminozuur depleties worden aangegeven met "-" in de respectieve media naam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Plexa-N-atp00189 geen kolonies geen groei geen groei geen groei geen groei geen pGAD-HA geen groei kolonies geen groei geen groei geen groei Plexa-N geen kolonies geen groei geen groei geen groei geen groei Plexa-N pGAD-HA kolonies kolonies <td> kolonies geen groei geen groei Plexa-p53 pACT-larget kolonies kolonies kolonies kolonies kolonies Plexa-N-atp00189 pGAD-HA kolonies kolonies kolonies geen groei geen groei Tabel 1: Verwachte resultaten in een Bait Self-activering Assay. De transformatie van S. cerevisiae NMY51 oplevert in differentiële groei op selectieve media op basis van de kenmerken van gecotransformeerde lokaas en prooi. Groei op selectieve platen werd geëvalueerd na transformatie vector van verschillende combinaties (af) na 72 uur incubatie bij 30 ° C. Zwakke zelfwerkzaamheid wordt gekenmerkt door gist groei op SD-trp-leu-zijn en een sterke zelfwerkzaamheid door de groei op een SD-trp-leu-zijn-ade selectie plates bij afwezigheid van een interactie partner. De Plexa-N gecodeerde phytoplasmal effector ATP_00189 niet vertoont zelf-activatie, die wordt gekenmerkt door het onvermogen van het aas vector getransformeerde NMY51 te groeien in de afwezigheid van zijn en ade. Afhankelijk van het aas, kan een Y2H scherm tal van gist klonen te krijgen groeien op selectieve platen. Alle klonen worden geanalyseerd en gecontroleerd op mogelijke ontslagen. Zelfs als een genormaliseerde cDNA-bibliotheek is gebruikt, is het zeer waarschijnlijk dat een bindingspartner is vertegenwoordigd in vele verschillende klonen. Afhankelijk van de bibliotheek klonen techniek is het ook mogelijk dat alleen fragmenten van het volledige gen in sommige prooi vectoren ingevoegd. Derhalve is het raadzaam om de novo amplificeren (van cDNA) en subkloneren van het gen van volledige lengte van de Interactor en de interactie te testen in een één-op-één Y2H analyse (figuur 2). <img alt = "Figuur 2" src = "/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg" /> Figuur 2: Voorbeeld van een interactie tussen Bait and Prey in een Y2H Experiment. Een scherm Gist twee-hybride (Y2H) werd uitgevoerd en plasmiden uit positieve interactor klonen werden gezuiverd. De prooi vector werd gesequenced en de Malus x domestica gastheer interactie partners MdTCP24 en MdTCP25 werden geïdentificeerd. Als negatieve controle MdTCP34 (waarvoor geen interactor werd geïdentificeerd in het Y2H bibliotheekscherm) werd gesubkloneerd in parallel. De volledige lengte genen werden geamplificeerd uit appel cDNA gesubkloneerd in de prooi vector (co-cistronically expressie het activeringsdomein AD) en de novo co-getransformeerd met het aas vector die de bacteriële effector ATP_00189 gekoppeld met het DNA-bindingsdomein (bd). Dit cijfer is ontleend aan 28. Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur.

Discussion

In het Y2H scherm wordt het potentieel effector eiwit co-expressie gebracht met verschillende hypothetische interagerende eiwitten (stap 7). Elke groeiende gist kloon bevat het aas, maar een (potentieel) verschillende interactor. De interagerende eiwitten worden gecodeerd in een cDNA-bibliotheek die is gekloneerd in plasmiden prooi. Het aas en prooi plasmiden elke co-cistronically code voor een gedeelte van een gisttranscriptiefactor. Bij een fysieke interactie tussen het aas (effector) en een prooi plasmide- gecodeerd interactor, worden de twee delen transcriptiefactor (het DNA-bindingsdomein en het activatiedomein) verenigd en de reportergenexpressie geïnduceerd. De gist kan groeien op histidine- en adenine verarmd SD selectieplaten. Het soort prooi cDNA bibliotheek gescreend afhankelijk van de effector en dienovereenkomstig worden gekozen. De prooi en aas vector, evenals de giststam, moet compatibel zijn. In dit scherm, een LexA DNA-bindend domein en het Gal4 activering Domain werden als verenigbaar gisttranscriptiefactor eenheden. De cDNA-bibliotheek kan afzonderlijk worden vervaardigd, maat of commercieel verkregen. De bereiding van het cDNA prooi bibliotheek maakt geen deel uit van dit protocol. In dit protocol, een zelf gebouwd, genormaliseerde cDNA-bibliotheek van het RNA van Malus x domestica bladeren werd gebruikt en gekloond in pGAD-HA-41. De effector (aas) tot expressie brengen giststam werd getransformeerd met de prooi bibliotheek en klonen werden geselecteerd op histidine- en-adenine uitgeputte SD selectie platen. Om plasmide DNA uit de gistkolonies extraheren, wordt een kolom gebaseerde DNA plasmide mini kit voor bacteriën aanbevolen in combinatie met een mechanische verbreking stap gebruikt glasparels gist lysis (stap 8) te verbeteren. In dit plasmide zuivering wordt het aas en prooi vector gelijktijdig worden gezuiverd in relatief lage concentraties. De hoeveelheid plasmide DNA is genoeg om de interactiepartner identificeren door middel sequencing without voorafgaand plasmide vermeerdering (stap 8.4). Als alternatief kan het DNA gezuiverd stap 8,4 wordt getransformeerd in competente E. coli en geselecteerd met prooi-vector gemedieerde antibioticumresistentie (bijvoorbeeld ampicilline het bij pGAD-HA). De gewenste E. coli kolonies bevatten alleen de pGAD-HA-plasmide bibliotheek en high-yield plasmide zuivering kan worden uitgevoerd met deze klonen.

De succesvolle transformatie van Plexa-N en pGAD-HA-constructen een aanvulling op de tryptofaan en leucine auxotrofie van NMY51. Een interactie tussen het effector en een eiwit (gecodeerd op pGAD-HA) leidt tot de activering van het reporter systeem NMY51 stammen. In het geval van zelf-activatie, NMY51 getransformeerd met de effector tot expressie Plexa-N in combinatie met de lege bibliotheek vector pGAD-HA groeit op selectieve platen ontbreekt trp-leu-his-ade, vanwege de ongewenste activering van het NMY51 reportersysteem 40. De zelf-activatie kan worden weak en kunnen optreden in de afwezigheid van trp-leu-his of de activering sterke en gekenmerkt door groei op trp-leu-his-ade platen 41 zijn. Self-activering kan een enorme achtergrond van vals-positieve klonen in de feitelijke Y2H scherm veroorzaken. Om dit te vermijden, moet een test zelfactivering met het aas worden uitgevoerd, waarbij de effector-tot expressie vector is mede getransformeerd met de lege vector library. In deze experimentele instelling, moet reportergenexpressie niet worden opgewekt. Als zelf-activatie (dat wil zeggen groei op selectieve platen) zichtbaar in de test, kan het medium worden aangevuld met verschillende concentraties van 3-amino-1,2,4-triazool 45 (3-AT). 3-AT is een remmer van imidazoleglycerol-fosfaat dehydratase (HIS3), een enzym van belang tijdens histidine biosynthese 46. Suppletie met 3-AT kan tijdens Y2H schermen 47 de zwakke effecten van zelfwerkzaamheid te verminderen,48. Verschillende concentraties van 3-AT moeten worden getest. In dit protocol, 1 – werden 40 mM 3-AT gebruikt. De laagste concentratie die leidt tot de onderdrukking van zelf-activatie zou vervolgens worden gebruikt in het Y2H scherm. De selectieve platen van de zelf-activatie assay kan alleen worden beoordeeld indien de SD-trp-leu platen van de co-transformatie zijn in voldoende aantal klonen. Ter indicatie ≥ 500 kolonies per 90 mm (diameter) petrischaal voldoende. Om de exacte transfectie efficiëntie te bepalen, wordt aanbevolen seriële verdunningen van de getransformeerde gist-co bereiden en te verspreiden op SD-trp-leu-platen.

Om zelf-activatie te verminderen, kan de effector worden gekloneerd in Plexa-C, aas expressievector die het LexA tag aan de C-terminus van het eiwit zekeringen. De oriëntatie van de Lex-A tag kan zelfwerkzaamheid 24 verzwakken. Het is echter niet mogelijk in alle gevallen te verminderen of opheffen zelf-activatie. De formatie vanrode of roodachtige kolonies duidt op een zwakke of vals-positieve interactie. De ade2 reportergen van NMY51 wordt alleen geactiveerd wanneer het gaat om een eiwit-eiwit interactie, waardoor blokkeert de accumulatie van een rode kleurstof in deze giststam 40. Bij afwezigheid van een interactie, NMY51 roodachtig, terwijl kolonies dragen sterk interactorenen zijn wit. De waarneming van de kolonie kleur op de selectie platen verschaft aldus een verdere belangrijke hint om te beoordelen of de respectievelijke kolonies zijn true-of vals-positieve interactors.

Het is uiteindelijk moet passen of bepaalde assay wijzigen met betrekking tot de aard van het aas en interactiekarakteristieken. Inmiddels hebben een aantal verbeteringen en derivaattechnieken conventionele Y2H vastgesteld, teneinde de analyse van nogal moeilijk eiwit interacties in verschillende gastheersystemen. Een overzicht van Stynen et al. 49 adressen eennd beschrijft verschillende aspecten van Y2H, zijn verbeteringen en aanpassingen, en dus biedt nuttige informatie over hoe u de juiste interactie test te kiezen.

Y2H schermen en afgeleide technieken zijn geworden op grote schaal gebruikt in verschillende onderzoeksgebieden, waar de identificatie van binaire eiwit interacties is vereist. Zelfs als kritische controles worden uitgevoerd, zoals zelf-activeringstests van het aas en één-op-één re-transformaties van de geïdentificeerde interagerende eiwitten, de Y2H is gevoelig voor verkeerde resultaten 26, 50, 51 te produceren. De gist als een model is geschikt voor alle interactie studies. Gist vormt niet noodzakelijk een mobiele omgeving die de juiste post-translationele modificatie en vouwen voor elk eiwit 24 ondersteunt. Verder in de omgeving Y2H de eiwitten tot overexpressie gebracht en de expressie niet controlonder leiding van hun natuurlijke promotor. De Y2H dwingt de eiwitachtige interactiepartners naar de nucleus, wat niet noodzakelijk hun natuurlijke subcellulaire bestemming. De inheemse cellulaire omstandigheden van de interactie kan dus niet worden weerspiegeld door de gist en kan leiden tot vals-negatieve of vals-positieve resultaten. Y2H meeste zijn gebaseerd op gist auxotrofie complementatie als selectieve principe. Deze voeding selectie wordt gekenmerkt door hoge gevoeligheid, maar ten koste van verminderde selectiviteit ten opzichte van andere (bijvoorbeeld chromogene reporter) assays 49. Als unreducible zelfwerkzaamheid (zie boven) of andere beperkingen optreden voor een bepaalde effector, de Y2H geen geschikte test 25. In tabel 1 en figuur 1, zijn de verwachte resultaten van de zelf-activatie test gegeven. De afwezigheid van echte interacties (dat wil zeggen valse negatieven) kan worden veroorzaakt door proteïne toxiciteit, onjuiste translationele eiwitprocessing, sterische hindering van de interactie, ondervertegenwoordigd interactie partners in de prooi bibliotheek, membraan lokalisatie van het aas, of ontbrekende onderdelen die nodig zijn voor de interactie 24.

Het wordt aanbevolen om de novo versterken de full-length gen van de geïdentificeerde interactie eiwit van cDNA, subkloneren van het in pGAD-HA, en het uitvoeren van een een-op-een interactie analyse door het transformeren van de gegenereerde pGAD-HA construct in het aas-expressie NMY51 stam. Dit is nodig omdat de waargenomen interactor in de prooi bibliotheek slechts een fragment van een groter eiwit kan zijn. Echter, de informatie voor de respectieve volledige lengte-gen is alleen toegankelijk als veel van genomics en transcriptomics sequentie gegevens beschikbaar zijn. De transformatie protocol voor de zelf-activatie assay beschreven kunnen worden toegepast voor zulk een één-op-één assay, en de interactie tussen het aas en de interactor moet reproduceerbaar zijn.

<p class = "jove_content"> Interacties geïdentificeerd in een Y2H scherm moet altijd worden bevestigd door andere onafhankelijke techniek. Deze onafhankelijke technieken altijd dichterbij de natuurlijke omgeving van het eigenlijke proteïne-proteïne interactie. Bij de phytoplasmal effector ATP_00189, de interactie met de TCP transcriptiefactoren van Malus domestica geverifieerd in planta met bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) in Nicotiana benthamiana protoplasten 28 (geen onderdeel van dit protocol). De effector eiwit ATP_00189 was afgeleid van de plant pathogeen P. mali. In planta BiFC werd dus gekozen om ATP_00189 interacties met de Malus x domestica transcriptiefactoren controleren eerder geïdentificeerd in de Y2H 28. BiFC is een eiwit-eiwit interactie assay die de subcellulaire translocatie van de interacterende eiwitten naar de kern vereist om het reportersysteem <activerensup class = "xref"> 52. Bovendien is de in planta expressie en modificatie van machines bootst de omgeving van de natuurlijke interactie tussen de plant bacteriële effector in de waardplant. Echter, een wereldwijde scherm met behulp van BiFC is niet haalbaar.

Er zijn verschillende stappen in het protocol dat zorgvuldig moet worden aangepakt. Wanneer het amplificeren van het gen van belang (stap 4), is het belangrijk te sluiten dat primers binden aan planten DNA. Zo mag DNA van niet geïnfecteerde planten worden opgenomen als een negatieve controle. De sequentie van het gen van belang niet de EcoRI en Sali restrictieplaatsen die worden gebruikt voor de gerichte klonering van de ingebrachte sequentie. Indien de sequentie bevat wel deze plaatsen moeten verschillende restrictie-enzymen voor klonering gekozen. Gisttransformatie is centraal in deze methode protocol. Transfectie efficiëntie hangt af van de bekwaamheid van de gistcellen, de levensvatbaarheid, groei toestand en de kwaliteit van de transfectie Reagent 53, 54. Voor het voorgestelde protocol, is het sterk aan te raden om gist uit verse platen niet ouder dan twee weken (bewaard bij 4 ° C) te gebruiken bij het uitvoeren van de transformaties. Vaak is de groei van getransformeerde gist vertraagd wanneer selectieve vloeibare culturen worden geënt met kolonies van oude agarplaten. Het is ook nuttig om een ​​vloeibare startercultuur als een inoculum voor de feitelijke experimenten en niet de gist direct gebruik van de plaat. Lage efficiëntie tijdens transfecteren van de prooien in de aas gist tot expressie kan leiden tot de ondervertegenwoordiging van bepaalde prooi eiwitten (potentiële interactors) en kan dus het hele scherm scheef. In dit protocol, een gist transfectie efficiëntie van ~ 150.000 cfu / ug DNA getransfecteerd in de Y2H werkte goed.

Het kennen van de gebreken en nadelen van de Y2H techniek en interpretatie van de resultaten op een kritische en passende wijze is onmisbaar voor het tekenen van de correct conclusies. Y2H assays en de derivaten zijn gebruikt voor vele jaren hebben vele verbeteringen en aanpassingen ondergaan ten opzichte van de verschillende aas kenmerken, de subcellulaire lokalisatie van de interactie, de verwachte bindingspartners, en andere factoren die voor de interactie nodig kunnen zijn (zie Y3H 55, 56, 57). Onlangs hebben-array gebaseerde Y2H schermen ontwikkeld die het mogelijk maken voor geautomatiseerde, high-throughput analyse van een groot aantal aas tegen miljoenen prooien 58. De toekomst ligt waarschijnlijk in automatisering en high-throughput benaderingen van deze assay om voor de interpretatie van complexe signaalwegen en interactomen in diverse domeinen.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner en Florian Senoner uit de Laimburg Research Centre en Mirelle Borges Dias Schnetzer van Dualsystems Biotech AG voor de technische ondersteuning en Julia Strobl voor proeflezen het manuscript. Dit werk werd uitgevoerd als onderdeel van het APPL2.0 project werd gedeeltelijk gefinancierd door de autonome provincie Bozen / Bolzano, Italië en de Zuid-Tiroolse Apple Consortium.

Materials

Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) Applichem A6284 for DNA preparation
Trishydroxymethylaminomethane (Tris) Applichem A2264 for media and buffer
Sodiumchloride (NaCl) Applichem A2942 for media and buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA) Applichem A2937 for media and buffer
N-Lauroylsarcosin sodium salt Applichem A7402 for DNA preparation
ammonium acetate  Sigma-Aldrich (Fluka) 9688 for DNA preparation
2-mercaptoethanol Applichem A1108 for DNA preparation
Isopropanol (2-Propanol) Applichem A3928 for DNA preparation
Ethanol Sigma-Aldrich (Fluka) 51976 for DNA preparation
RNAse Applichem A2760 for DNA preparation
Chloroform:Isoamyl 24:1 Applichem A1935 for DNA preparation
Proofreading Polymerase (e.g. iProof) Bio-Rad 203433 for PCR
EcoRI Thermo Scientific ER0271 for cloning
SalI Thermo Scientific ER0641 for cloning
Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick) Qiagen 28104 for cloning
Kanamycin Sulfate Applichem A1493 for microbiological selection
3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Sigma-Aldrich A8056 for self-activation assay
L-Arginine Monohydrochloride  Applichem A3680 for yeast culture
L-Isoleucine  Applichem A3642 for yeast culture
L-lysine Monohydrate  Applichem A3448 for yeast culture
L-Methionine  Applichem A3897 for yeast culture
L-Phenylalanine  Applichem A3464 for yeast culture
L-Threonine  Applichem A3946 for yeast culture
L-Tyrosine  Applichem A3401 for yeast culture
L-Uracile Applichem A0667 for yeast culture
L-Valine  Applichem A3406 for yeast culture
L-Adenine Hemisulfate Salt  Applichem A1596 for yeast culture
0.22 µm Pore Filter Sartorius 16541 for sterile filtration
L-Histidine Monohydrochloride Applichem A3719 for yeast culture
L-Leucine  Applichem A3496 for yeast culture
L-Tryptophane  Applichem A3410 for yeast culture
Yeast Nitrogen Base  Sigma-Aldrich 51483 for yeast culture
D-Glucose Monohydrate  Applichem A1349 for yeast culture
Agar Fisher Scientific BP2641-1 for yeast and bacteria culture
Peptone Applichem A2208 for yeast culture
Polyethylene Glycol 4000 (PEG) Applichem A1249 for yeast transformation
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc) Applichem A3478 for yeast transformation
Salmon Sperm DNA  Applichem A2159 for yeast transformation
Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region) Millipore 06-719 for Western blot
Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit) Sigma-Aldrich PLN350 for plasmid purification from yeast and bacteria
Acid Washed Glass Beads Sigma-Aldrich G8772 for plasmid purification from yeast
Ampicillin Sodium Salt Applichem A0839 for microbiological selection
Yeast Extract Applichem A1552 for yeast culture
Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301) Eppendorf Z368245 (Sigma) for DNA preparation
Bait vector (e.g. pLexA-N) Dualsystems P01004 for Y2H
Prey vector (e.g. pGAD-HA) Dualsystems P01004 for Y2H
Control prey vector (e.g. pLexA-p53) Dualsystems P01004 for Y2H
Control bait vector (e.g. pACT-largeT) Dualsystems P01004 for Y2H
Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells) Invitrogen C640003 for cloning
Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51) Dualsystems P01004 for Y2H
Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M) Sigma-Aldrich P7793-1EA for yeast and bacteria culture
Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal) Greiner 676 051 for yeast culture
PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler) Bio-Rad 1861096 for PCR
quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System) Bio-Rad 1855195 for quantitative PCR
Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R) Eppendorf 5417 R general lab equipment
Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R) Eppendorf 5804 R general lab equipment
Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free) 5Prime 2500010 for PCR and DNA works
Scalpell Swann-Morton 0301 for DNA preparation
Sterile filter (0.22 µm; Polyethersulfone)) VWR-International 514-0073 (European Catalogue number) for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 90 mm  Greiner Bio-One 633180 for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 150 mm  Greiner Bio-One 639161 for yeast culture
Photometer (e.g. BioPhotometer) Eppendorf 550507804 for yeast culture
Photometer Cuvettes Brand 759015 for yeast culture
Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7) Memmert WB7 for yeast transformation
Western Blot Equipment Bio-Rad diverse for protein detection
dNTPs 5Prime 2201210 for cloning
Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks) Sigma Aldrich Z232793, Z232858, Z232866 for yeast and bacteria culture
Shaking Incubator (e.g. GFL 3031) GFL 3031 for yeast and bacteria culture
Incubator Binder KB 53 (E3.1) for yeast and bacteria culture
Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825) Omniwash IF 825 general lab equipment
0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene) Eppendorf 0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml) general lab equipment
Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 µl) Eppendorf diverse general lab equipment
Spreader Sigma-Aldrich SPR-L-S01 for yeast and bacteria culture
Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker) IKA 3617000 general lab equipment
T4-Ligase Thermo Fisher EL0011 for cloning
Fridge (4°C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000) Liebherr 81.767.580.4 general lab equipment
Freezer (-20°C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216) Liebherr G5216 general lab equipment
Graduated Cylinder (e.g. Brand) Sigma Aldrich Z327352; Z327417; Z327441   general lab equipment
Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand) Thermo Fisher S55701 for yeast and bacteria culture
Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2) Integra-Biosciences 155000 general lab equipment
Cuvettes for Electroporation (1 mm) Molecular Bio Products 5510-11 for bacteria transformation
Electroporator (e.g. Eporator) Eppendorf 4309000019 for bacteria transformation
Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System) Bio-Rad 1708280 general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml) VWR-International  525-0403 (European Catalogue number) general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml) BD Falcon 352096 general lab equipment
Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M) Thermo Scientific P2325 for ligation
adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM)) Ambion  AM8110G (distributed by Thermo Scientific) for ligation
Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements) Sigma-Aldrich Y2021 Sigma  for yeast culture (ready-made mix)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fields, S., Song, O. -. K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Dombrosky-Ferlan, P. -. M., Corey, S. -. J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
  3. Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
  4. Lee, H. -. J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
  5. Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
  6. Kumar, A., Godwin, J. -. W., Gates, P. -. B., Garza-Garcia, A. -. A., Brockes, J. -. P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
  7. Park, S. -. Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
  9. Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
  10. Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
  11. Young, K. -. H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
  12. Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
  13. Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
  14. McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
  15. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  16. Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22 (2013).
  17. Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
  18. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
  19. Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -. J. -. M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
  20. Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
  21. Tseng, T. -. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
  22. MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835 (2014).
  23. Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
  24. van Criekinge, W., Beyaert, R. Yeast Two-Hybrid: State of the Art. Biol Proced Online. 2 (1), 1-38 (1999).
  25. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  26. Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
  27. Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
  28. Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors – a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
  29. Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
  30. Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
  31. Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
  32. Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423 (2002).
  33. Applichem. . N-Lauroylsarcosine sodium salt. , (2015).
  34. Applichem. . 2-Mercaptoethanol. , (2015).
  35. Applichem. . 2-Propanol. , (2015).
  36. Applichem. . Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , (2015).
  37. Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
  38. Applichem. . Kanamycin sulfate. , (2015).
  39. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
  40. Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , 1917-1952 (2008).
  41. . Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit – Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
  42. Kurien, B. -. T., Scofield, R. -. H. . Protein Blotting and Detection. , (2009).
  43. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  44. . . Yeast Transformation and Cloning. , (2016).
  45. Sigma-Aldrich. . 3-Amino-1,2,4-triazole. , (2016).
  46. Ames, B. -. N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
  47. Joung, J. -. K., Ramm, E. -. I., Pabo, C. -. O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
  48. Brennan, M. -. B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
  49. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
  50. Hengen, P. -. H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
  51. Vidalain, P. -. O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
  52. Pattanaik, S., Werkman, J. -. R., Yuan, L., Yuan, L., Perry, E. S. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 185-193 (2011).
  53. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
  54. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  55. Bernstein, D. -. S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  56. Stumpf, C. -. R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
  57. Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
  58. Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).

Tags

Bacterial EffectorNon-cultivable Plant PathogenYeast Two-hybrid ScreenCandidatus PhytoplasmaMalus DomesticaApple Proliferation DiseaseInfection ResearchDNA IsolationEffector Gene AmplificationBait VectorSelf-activationEffector ExpressionSD-trp PlateSD-trp MediumNMY51

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Janik, K., Schlink, K. Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen. J. Vis. Exp. (119), e55150, doi:10.3791/55150 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image