JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Unravelling функцию Бактериальный эффектора от Non-возделываемых растений Возбудитель Использование дрожжей дигибридная экрана

Published: January 20, 2017
doi:
10.3791/55150
,
1Department of Molecular Biology – Functional Genomics,Laimburg Research Centre

Summary

Бактериальные эффекторные белки имеют важное значение для создания успешных инфекций. Этот протокол описывает экспериментальную идентификацию белковыми связывающих партнеров бактериального эффекторной белка в его естественном растения-хозяина. Выявление этих эффекторных взаимодействий через дрожжей двух гибридных экранов стала важным инструментом в разгадке стратегии молекулярных патогенности.

Abstract

Unravelling молекулярных механизмов проявлений болезни важно понимать патологии и развитие симптомов в растениеводстве науки. Бактерии развивались различные стратегии, чтобы манипулировать их метаболизм хозяина для своей собственной выгоды. Эта бактериальная манипуляция часто в сочетании с тяжелым развитием симптомов или смерти пострадавших растений. Определение специфических бактериальных молекул, ответственных за манипуляции хозяина стала важным полем в микробиологических исследований. После идентификации этих бактериальных молекул, называемых "эффекторы," важно, чтобы выяснить их функцию. Прямолинейный подход к определению функции эффектора, чтобы идентифицировать его белковую связывающего партнера в своем естественном хосту через сито дрожжи дигибридная (Y2H). Обычно хост таит множество потенциальных партнеров по связыванию , которые не могут быть предсказаны достаточно любым в силикомарганца алгоритма. Таким образом, самый лучший выбор для PERFOгт экран с гипотетическим эффектора против целой библиотеки экспрессируемых белков хозяина. Это является особенно сложной задачей, если возбудителем является некультивируемые как фитоплазмы. Этот протокол обеспечивает шаг за шагом инструкции для очистки ДНК из растений фитоплазменных-инфицированных древесно-хозяина, усиления потенциального эффектора и последующего определения партнера молекулярного взаимодействия растения с экраном Y2H. Несмотря на то, что экраны Y2H обычно используются, существует тенденция передать эту технику для биотехнологических компаний, которые предлагают услуги Y2H по цене. Этот протокол содержит инструкции о том, как выполнить Y2H в любой прилично оборудованной лаборатории молекулярной биологии с использованием стандартных методов лаборатории.

Introduction

Дрожжи дигибридная экраны (Y2H) были разработаны около 27 лет назад 1 и с тех пор широко используется в различных областях , чтобы определить специфический белок-белковых взаимодействий , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , Физическое взаимодействие бактериальной эффектора с целевой хост белка часто является предварительным условием для функциональной манипуляции этого белка-мишени. Анализ этих взаимодействий переместилась в центре внимания многих различных секторов инфекции биологии 12, 13, 14, 15,"> 16, 17, 18. Принцип экрана Y2H является то , что взаимодействие двух белков приводит к восстановления функционального фактора транскрипции , который запускает экспрессию репортерных генов. Известное эффектор (далее" приманка ") трансляционно слитый к связывающим доменом ДНК (DBD) фактора транскрипции, и потенциальных партнеров взаимодействия ( «жертва») слиты с доменом активации (AD) соответствующего фактора транскрипции. Поскольку взаимодействие партнер неизвестна, библиотека потенциала interactors клонируют в так называемой "добычи-библиотеки." как правило, эта библиотека сделана путем клонирования кДНК в соответствующий вектор экспрессии плазмиды вектора жертвы, кодирующей AD, который совместим с наживкой-вектором, кодируемого DBD. В случае взаимодействия, восстановленные факторы транскрипции, индуцируют экспрессию репортерных генов, которые в целом позволяют отобрать рост дрожжей.идентификация interactors достигается путем секвенирования добычу плазмиды с плазмидой специфических праймеров.

Бактерии разработали различные стратегии , чтобы манипулировать и использовать метаболизм их хозяина или уклоняться от защитных механизмов и секретируют эффекторные молекулы с помощью различных бактериальных систем секреции 19, 20, 21. Определение связывающих партнеров этих бактериальных эффекторов, таким образом, первым шагом в определении манипулируют пути в хозяине. Это приводит к более глубокому пониманию конкретных механизмов патогенности.

Y2H экраны выполняются для выявления бактериальных эффекторных взаимодействий во время phytoplasmoses, и часто, Y2H является одним из важнейших Первоначальный эксперимент для дальнейшей характеристики механизмов молекулярных патогенности в исследовании фитоплазменных 22, 23. Тем не менее, встретилкорыто описание в большинстве публикаций довольно мало, и эти методы часто переданы биотехнологическими компаниями. Для того, чтобы привлечь внимание к возможности этого метода, этот протокол обеспечивает шаг за шагом информации для идентификации партнеров взаимодействия бактериальной эффекторной молекулы в своем естественном хозяине.

Несмотря на широкое применение и быстрый вперед подход экранов Y2H, не следует забывать, что некоторые взаимодействия не может привести к возникновению в системе дрожжей. Это связано с тем , что дрожжевые клетки используют в качестве своего рода "в естественных условиях реакционный сосуд" с определенными биологическими ограничениями. Некоторые авторы рассмотрели преимущества и недостатки Y2H и его производных 11, 24, 25, 26, 27. Общие соображения, например, что дрожжевая клетка не может обеспечить соответствующийэкспрессии гена, (пост-) поступательная или translocational условия для соответствующих белков изучается. Это может привести к ложно-отрицательных результатов на экране. Положительные взаимодействия могут быть в свою очередь артефактами и не может привести к возникновению в естественной ситуации (то есть в случае эффекторов в соответствующий хост). Таким образом, необходимо для подтверждения взаимодействия с гетерологичной системе экспрессии дрожжей с независимым тестом взаимодействия в более тесно связанной с биологической системой.

В этом исследовании, были определены партнеры для связывания эффекторных ATP_00189 из не-возделываемых растений патогена Candidatus фитоплазменных мали (P. мали). Полученные результаты дают важную информацию о молекулярных механизмах , лежащих в основе развития симптомов яблочного пролиферации 28, болезнь , которая вызывает большие экономические потери в пострадавших яблоневых растущих регионов в Европе 29.

Protocol

1. Сбор корневых листьев и образцы из зараженных деревьев Apple, Примечание: Возбудитель-специфический ДНК может быть очищен из корней или листьев. В следующем разделе приводится протокол для выборки обоих. Для получения препарата ДНК Отбор проб и подготовка из корней Выявление зараженных деревьев с "распространением яблока" Определённые симптомов 30, 31 и контрольных деревьев , которые являются бессимптомно. Использование чистых секатор, вырезать образцы корня, которые имеют диаметр 0,5 – 1 см и длиной около 5 см. Вырезать образцы из трех разных, отдаленных участках корневой системы, и поместить их в адекватно маркированных пластиковых пакетов. Хранить образцы в холодной коробке с охлажденным тепловые упаковки и не хранить их в холодильнике при 4 ° С до дальнейшей обработки. Примечание: Корневая архитектура и структура может изменяться по отношению к физиологическому статус крупногое дерево. Важно, чтобы образец в трех различных местах и ​​не принимать слишком тонкие корешки. Образцы могут быть сохранены в течение нескольких дней при температуре 4 ° С, но более длительное время хранения увеличивают риск формования. Moldy образцы не могут быть использованы для приготовления ДНК. Промыть образцы корневые с водой, чтобы удалить почву. Поместите их в стерильную чашку Петри и использовать стерилизованный скальпель, чтобы удалить корень эпидермис и кору головного мозга. Очистите скальпель с чистой безворсовой ткани протрите, опустите ее в 70% (об / об) раствора этанола вода, и тепло-стерилизовать над открытым пламенем (например, горелка Бунзена). Царапины флоэме скальпелем, нарезать его на мелкие кусочки, и аликвоту 30 – 100 мг измельченной флоэмы в стерильный 2,0 мл реакционной трубки. Храните образцы при -80 ° С в течение нескольких месяцев. Пример сбора и препарат из листьев Определить зараженным и бессимптомное дерево управления,s описано в шаге 1.1.1.1, и выбрать десять сухим из воды листьев на дереве. Одно дерево в состоянии достаточно. Промыть листья с водой и очистить поверхности путем распыления 70% (об / об) раствора этанола. Положите листья в стерильную чашку Петри и рассекают жилки (центральной вены) каждого листа с стерильным скальпелем. Удалить эпидермис и кору головного мозга от жилки, нарезать жилки на мелкие кусочки, и аликвоты по 100 мг спинке ткани в стерильный реакционную пробирку 2,0 мл. Используйте образцы немедленно для получения ДНК или хранить при температуре -80 ° С в течение нескольких месяцев. Примечание: Удобно Аликвотировать растительного материала порциями по 100 мг и в конечном счете, заморозить их для хранения. Каждую аликвоту может быть непосредственно использован для приготовления ДНК. Взвешивание глубокой заморозки растительного материала является громоздким, так как замороженный растительный материал имеет тенденцию к образованию кусков. 2. цетилтриметиламмонийбромид (СТАВ) основе ДНК Приготовление <p class = "jove_content"> Примечание: ДНК может быть очищен с использованием любого столбца на основе метода очистки ДНК для растительного материала. В этом разделе метод СТАВ основе для очистки ДНК описана. Очистка ДНК осуществляется на основе модифицированного протокола , описанного в другом месте 32. Подготовьте следующие буферы: СТАВ буфер: Растворите 1% вес / об цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ, M R: 364,45 г / моль), 100 мМ трисгидроксиметиламинометан (Трис, М г: 121,14 г / мл), 1,4 М хлорида натрия (NaCl, М г: 58,44 г / моль), и 20 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (NaEDTA, M R: 372,24 г / моль) в воде и корректировать их до рН 8,0. N-лауройлсарконине буфер: Растворить 10% вес / об N-лауроилсаркозин натриевую соль 33 (М г: 293,38 г / моль), 100 мМ Трис и 20 мМ NaEDTA в воде и доведения рН до 8,0. Трис-ЭДТА (ТЕ) буфера: Растворить 10 мМ Трис и 1 мМ NaEDTA в воде и autoclпр решение. Аммоний раствор ацетата: Приготовьте 5 М ацетата аммония (M R: 77,0825 г / моль) раствора в воде и автоклаве при 120 ° C и 1,2 бар в течение 20 мин. Смешайте 30 – 100 мг свежей или замороженной нарезанной растительного материала (этап 1.1.2.2.) С 300 мкл буферного раствора СТАВ, 30 мкл буфера Н-лауройлсарконине, 6 мкл протеиназы К (10 мкг / мкл), и 12 мкл 2-меркаптоэтанол 34 (M R: 78,13 г / моль). Встряхивают в течение 60 мин при 60 ° С. Пусть смесь остынет до комнатной температуры, прежде чем продолжить. Добавьте 360 мкл раствора ацетата аммония и энергично перемешать. Пусть решение сидеть в течение 5 мин, а затем центрифугировать ее при 15000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Передача супернатант в чистую пробирку и добавляют 720 мкл охлажденного на льду изопропанола 35. Осадить ДНК в течение по крайней мере 30 мин при -20 ° С. Центрифуга смесь при 15000 х г в течение 30 мин при 4° С и отбросить супернатант. Промывают осадок 500 мкл охлажденного льдом 70% этанола и спина его вниз при 15000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант этанол и немедленно погрузить флакон на бумажное полотенце чистой, чтобы удалить остатки жидкости. Убедитесь в том, чтобы удалить как можно больше жидкости, как это возможно. Высушите осадок в течение 15-20 мин или в течение 2-3 мин в вакуумном концентраторе центрифуге. Не пересушивайте осадок избыточным нагреванием или продленного времени испарения. Ресуспендируют осадок в 700 мкл ТЕ-буфера и в конце концов он нагрелся до 37 ° С для облегчения растворения. Добавьте 10 мкл РНКазы (10 мкг / мкл) и инкубируют в течение 15 мин при 37 ° С, встряхивая при 300 оборотах в минуту. Добавить 700 мкл хлороформа: изоамилового спирта 36 24: 1 и хорошо перемешать. Центрифуга смесь при 20000 х г в течение 10 мин при 4 ° С и переносят верхнюю фазу супернатанта в новую, чистую пробирку. Осадить ДНК в надосадочной жидкости путем добавления700 мкл 2-пропанола 35 (изопропиловый спирт, М г: 60,1 г / моль) , и инкубирование в течение не менее 30 мин при -20 ° С. Центрифуга смесь при 12000 х г в течение 30 мин при 4 ° С и отбросить супернатант. Промывают осадок 500 мкл 70% -ного этанола и центрифуге при 12000 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Сушат гранулы, как описано в шаге 2.5. Растворите его в 50 мкл ТЕ. 3. Обнаружение Candidatus фитоплазменных Mali-специфической ДНК с помощью ПЦР Развести ДНК очищают из растительного материала 1:10 в нуклеазы без воды и запустить ПЦР с патогеном специфических праймеров 37. Проверьте наличие P. Mali-специфической ДНК в растительном материале с использованием количественного протокола ПЦР с использованием праймеров и специфических зондов для P. Mali фитоплазмы 37. Проверьте отсутствие других членов фитоплазменных 16SrX путем выполнения той же самой ПЦР с соответствующими зондами для Сабез обозначения даты П. prunorum и канд. П. pyri ДНК 37. Примечание: ДНК из не-инфицированной дерева должны быть проверены, а также для подтверждения отсутствия возбудителя в этом элементе управления. На этом этапе важно, что ДНК от других близкородственных видов фитоплазменных отсутствует в образце, так как это приведет к увеличению риска усиления эффектор от А кроме P. Mali фитоплазменных видов. Смешанная инфекция с другим тесно связанной P. Mali группы фитоплазмы 16SrX исключается путем анализа образца с соответствующими датчиками. Поскольку ожидаемые результаты должны быть отрицательными для других 16SrX фитоплазмы, важно, чтобы включить соответствующие положительные контроли, которые указывают на PCR эффективность. 4. Усиливая Потенциал эффекторных генов и Субклонирование в Y2H Bait Вектор Амплификации гена phytoplasmal atp_00189 (не включающего сигнальный пептид часть) P. Mali с использованием праймеров 5-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (вперед) и 5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (обратный), с сайтами рестрикции для EcoRI и SalI на 5 'и 3' – концах соответственно. Очищают продукт ПЦР с методом очистки ДНК колонке основе. Клонирование ампликона в Y2H приманки вектор pLexA-N с помощью EcoRI и SalI перевязки. Примечание: Здесь, 100 нг EcoRI и SalI линеаризуется pLexA-N вектор в сочетании с 15 нг аналогичным образом расщепляли atp_00189 PCR ампликона и 1 U T4-лигазы. Лигирование проводили в буфере , содержащем 40 мМ Трис-HCl (рН 7,9 при 25 & deg ; C), 10 мМ MgCl 2, 10 мМ дитиотреитола (ДТТ, M R: 154,25 г / моль) и 0,5 мМ аденозинтрифосфата (АТФ, М г: 507,18 г / моль) , в общем объеме 10,0 мкл при 16 ° с в течение ночи (14-20 ч). Анализ ДНК из неинфицированных дерева с теми же праймерами , чтобы исключить неспецифическое связывание праймера Malus Domestica х </EM> ДНК. Transform 1 мкл смеси для лигирования в E.coli Электрокомпетентные клетки и выбрать для устойчивых к канамицину клонов на Лурии-Бертани (LB) пластины с добавлением 50 мкг / мл канамицина сульфата 38. Очищают плазмидной ДНК из отобранных бактериальных клонов с колонной на основе плазмиды мини – комплектом подготовки , следуя инструкциям изготовителя, и проверить успешную интеграцию и ориентацию вставки путем секвенирования 39. 5. Тест на самоактивацию (Auto-активации) потенциала Эффектор белка Подготовьте следующие буферы и средства массовой информации роста: ПРИМЕЧАНИЕ: Номенклатура для дрожжей-селективных пластин переносит аббревиатуры из недостающих аминокислот в соответствующей среде с "-" до аббревиатуры. Например, SD-Trp-Leu-его пластины содержат все аминокислоты, но ГТО, Leu и его. 10x отсев смесь: Взвесить200 мг L-аргинина моногидрохлорида (M г: 210,66 г / моль), 300 мг L-изолейцин (M г: 131,17 г / моль), 269 мг L-лизина моногидрата (M г: 164,21 г / моль), 200 мг L-метионин (M г: 149,21 г / моль), 500 мг L-фенилаланина (М г: 165,19 г / моль), 2 г L-треонин (M г: 119,12 г / моль), 300 мг из L-тирозина (Mr: 181,19 г / моль), 200 мг L-урацил (112,09 г / моль), и 1,5 г L-валин (М г: 117,15 г / моль). Растворить их в 1 л дважды дистиллированной воды и автоклав раствора. Хранить раствор при температуре 4 ° С. Примечание: Соответствующая отсев смесь может быть также приобретены с предварительным смешиванием. 10x L-аденин добавка: Взвесьте 100 мг L-аденин полусульфат соли (ADE, М г: 184,17 г / моль) и растворяют его в 50 мл дважды дистиллированной воды. Фильтр стерилизовать раствор с порами фильтр 0,22 мкм. 10x L-гистидин добавки: Взвесьте 100 мг моногидрата L-гистидин моногидрохлорида (его, M г </suб>: 209,63 г / моль) в 50 мл бидистиллированной воды и фильтр стерилизовать с порами фильтр 0,22 мкм. 10x L-лейцин добавка: Взвесьте 500 мг L-лейцин (Leu, M г: 113,17 г / моль) в 50 мл дважды дистиллированной воды и фильтр стерилизовать с порами фильтр 0,22 мкм. 10x L-триптофан добавка: Взвешивают 100 мг L-триптофан (Trp, М г: 204,23 г / моль) в 50 мл бидистиллированной воды и фильтр стерилизовать с порами фильтр 0,22 мкм. SD-Trp-Leu-His-ADE-носитель и планшеты: Растворить 0,67% вес / об азотистого основания дрожжей (без аминокислот) и 2% вес / моногидрат D-глюкоза V (M г: 198,17 г / моль) в двух- дистиллированной воды и автоклав. Для чашек с агаром, добавляют 2% вес / об агар (микробиологические класс) перед автоклавированием. Для приготовления селективных тарелки, добавить 1x исходного раствора аминокислоты с автоклавного Сд-Trp-Leu-His-АДЭ среде. При подготовке пластин, убедитесь, что агар охлаждают до ~ 50 ° C перед добавлениемаминокислоты. Храните растворы стерильны. YPAD среда: Растворите 1% вес / объем дрожжевого экстракта, 2% вес / об пептон (микробиологические класс), 0,004% вес / об аденин полусульфат соль (М г: 184,17 г / моль) и 2% мас моногидрата / об глюкозы в дважды дистиллированной воды и автоклав. Для чашках с агаром YPAD, добавляют 2% вес / об агар перед автоклавированием. Для приготовления 2х YPAD, потребляют в два раза концентрации ингредиентов, упомянутых выше. Примечание: (Необязательно) Из-за высокой концентрации глюкозы в среде, 2x YPAD среда становится темно-коричневую после автоклавирования. В качестве альтернативы, 40% (вес / объем) глюкозы раствор можно приготовить и стерилизовать путем пропускания его через фильтр с размером 0,22 мкм. Фильтр-стерилизовать глюкозы раствор затем добавляют к автоклавного 2x YPAD (отсутствие глюкозы) в стерильных условиях. Во избежание ошибок с томами, 2x YPAD должны быть готовы, имея в виду, что раствор глюкозы 10x затем добавляют. Это означает, что, например, вместо 1 л ое среда, только 900 мл, получают (содержащий все ингредиенты, кроме глюкозы) и выдерживают в автоклаве, а затем 100 мл раствора глюкозы добавляют. Литий-ацетат-опосредованной трансформации дрожжей для тестирования самостоятельной активации Серия штамм Saccharomyces CEREVISIAE репортер NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ADE2 Lys2: :( lexAop) 4-HIS3 URA3: :( lexAop) 8-LacZ ADE2: :( lexAop) 8-ADE2 GAL4) от А замороженный глицерине на агаровой пластине YPAD и инкубировать ее в течение 48 ч при 30 ° с. Выбор колоний из этой пластины и инокуляции 50 мл YPAD среды. Пусть дрожжи растут и измеряют OD 600 регулярно контролировать рост. Пусть дрожжи растут до конечной OD 600 0,5-0,8. Гранул клетки центрифугированием их при 700 х г в течение 5 мин и ресуспендируют их в 2,5 мл дважды дистиллированной, автоклавного воды. Готовят шесть аликвоты 100 мкл суспензии дрожжей и добавляют 240 мкл 50% Вес / объем полиэтиленгликоль 4000 (ПЭГ, M R: 3500-4000 г / моль), 36 мкл 1 М дигидрата ацетата лития (LiOAc, М г: 102,02 г / моль), и 25 мкл 2% вес / об ДНК спермы лосося (растворенный). Подготовьте все реагенты с дважды дистиллированной стерильной водой. Добавьте шесть ампул , содержащих дрожжевой суспензии от "а" до "F" и добавьте следующую плазмиду векторной ДНК: отрицательный контроль: (а) 1,5 мкг приманки плазмиды с помощью эффектора (pLexA-N-atp00189 28), (б) 1,5 мкг плазмиды пустой добычи pGAD-HA 41, (с) 1,5 мкг пустого вектора приманки pLexA-N 41, и (d) 1,5 мкг пустого вектора приманки pLexA-N и 1,5 мкг плазмиды пустой добычей pGAD-HA; Положительный контроль: (е) 1,5 мкг положительного контроля приманки плазмидной ДНК pLexA-p53 41 и 1,5 мкг положительной добычи плазмиду Pact-largeT 41; и тест самоактивацию: (F) 1,5 мкг баона плазмиды с помощью эффектора (pLexA-N-atp00189) и 1,5 мкг плазмиды пустой добычей pGAD-HA. Смешать реакции энергично и инкубируют их в течение 45 мин при 42 ° С в водяной бане. Гранул клеток в течение 5 мин при 700 мкг и отбросить супернатант. Ресуспендируют клеток в 250 мкл 0,9% (вес / объем) раствора хлорида натрия (NaCl, M R: 48,44 г / моль) и распространить по 50 мкл на следующих селективных пластин: SD-Trp, SD-Leu, SD-trp- лей, SD-Trp-Leu-его, и SD-Trp-Leu-его-ADE. Инкубируйте пластин в течение 3 – 4 дней при 30 ° C. После первого дня инкубации, печать пластин с пластиковой парафиновой пленки, чтобы предотвратить пластины от высыхания. Проверьте рост дрожжей на пластинках. 6. Испытание экспрессии эффектора Испытание на экспрессию эффекторных путем Вестерн – блот – 42 с антителом против Lex-тег , который соединен на N-конце эффектора когда этоэкспрессируется из pLexA-N. Примечание: Учтите, что трансляционно слитый Lex-Тег добавляет около 24 кДа до фактического веса белка, представляющего интерес. Это важно при определении размера белка в Вестерн-блоттинга. 7. Y2H экран Streak pLexA-atp00189 (эффектор) -transformed NMY51 на свежую SD-Trp пластины и дайте ему расти в течение 2 – 3 суток при температуре 30 ° C, пока не появятся красные колонии. Инокулируйте 3 мл SD-Trp среды в небольшом встряхивании колбу с красной колонии из чашки с агаром и инкубировать в течение ночи при 30 ° C при встряхивании со скоростью 120 – 150 оборотов в минуту. Инокулируйте 20 мл SD-Trp в качалке колбу с 1 мл ночной культуры и пусть растут в течение 8 часов. Отрегулировать культуру до OD 600 = 0,2 путем добавления SD-Trp среды и инокуляции 2 × 100 мл в встряхивания колб 10 мл закваски каждого. Расти в течение ночи при встряхивании при 30 ° C. Примечание: Убедитесь , что дрожжи не вырастет до OD 600> 0,5 и разбавляют свежей SD-Trp. Измерьте OD 600 и гранулы 120 OD 600 "единиц" . Например, если OD 600 1,2 измеряется, спином вниз на 100 мл, отбросить супернатант, и ресуспендируют осадок в 800 мл предварительно подогретого 2x YPAD в шейкер колбу с магнитной мешалкой. Спин вниз 2-мл аликвоту, удалить супернатант, и ресуспендируют осадок в воде. Убедитесь в том, что OD 600 дрожжей суспензии составляет от 0,15 до 0,2. Если нет, то отрегулируйте с 2x YPAD или добавить больше дрожжей из ночной культуры. Примечание: 2x YPAD темно-коричневого цвета и может повлиять на результаты измерения OD. Таким образом, необходимо, чтобы ресуспендирования клеток дрожжей в воде перед определением оптической плотности. В качестве альтернативы, 2x YPAD могут быть получены с помощью стерилизующего глюкозы отдельно, как описано на стадии 5.1.8 ноте, что предотвращает темную окраску среды. Инкубируйте остальные культуры дрожжей в приложенииropriately размером шейкер колбу (800 мл в 2 л колбу шейкера или разделить 2 х 400 мл на две 1 л шейкер колбах) и инкубируют при температуре 30 ° C, 120 – 150 оборотов в минуту. Не Измерить OD 600 примерно через каждые 1,5 ч до достижения OD 600 0,6 достигается (занимает 4 – 6 ч). В то же время, подготовить решения, описанные в следующем шаге. Литий-ацетат-опосредованной трансформацией Растворить 2% вес / об ДНК спермы лосося в воде и кипятят в 500 мкл в течение 5 мин на водяной бане при 100 ° С. Поместите пробирку на льду в течение 2 мин и повторить операцию нагрева. Держите ДНК на льду до дальнейшего использования. Подготовьте следующие смеси: TE / LiOAc смесь: Смешать 3,08 мл 1 М LiOAc, 3,08 мл 100 мМ Трис / 10 мМ ЭДТА (рН 7,5), и 21,84 мл стерильной бидистиллированной воды. ПЭГ / LiOAc смесь: зерноуборочный 4,2 мл 1 М LiOAc, 4,2 мл мМ Трис / 10 мМ ЭДТА (рН 7,5) и 33,6 мл 50% (вес / объем) ПЭГ 4000. Центрифуга 800 мл дрожжевой культуры (OD 600 = 0,6)при 700 х г в течение 5 мин для осаждения клеток. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мл стерильной бидистиллированной воды. Гранул клетки снова при 700 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант. Примечание: При необходимости разделить суспензию на несколько флаконов для центрифугирования. Жидкие объемы в 7.7.3. и 7.7.4. относятся ко всему осадку, полученного из 800 мл суспензии. Ресуспендируют осадок в 16 мл ТЕ / LiOAc смеси (этап 7.7.1.1); спином вниз со скоростью 700 мкг в течение 5 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок в 9,6 мл ТЕ / LiOAc смеси. Подготовьте следующую реакцию смеси в реакцию соответствующего размера полипропиленовые сосуды: 12 ампул с 7 мкг pGAD-HA-библиотеки кДНК вектор, 100 мкл 2% ДНК спермы лосося (см шаг 7.7), и 2,5 мл ПЭГ / LiOAc смеси. Добавьте 600 мкл суспензии клеток дрожжей с шага 7.10 до каждого из 12 флаконов и энергично перемешивают в течение 1 мин. Инкубируют реакционную смесь в течение 45 мин при 30 ° С на водяной банеd смешать энергично каждые 15 мин. Добавьте 160 мкл ДМСО для каждого флакона и энергично перемешать. Выдержите смесь в течение еще 20 мин при 42 ° С. Гранул клетки при 700 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант, и ресуспендируют каждую гранулу в 3 мл 2 раза YPAD. Бассейн все клетки (в общей сложности 36 мл из 12 флаконов) в шейкере колбу объемом 100 мл и инкубировать дрожжей в течение 90 мин при температуре 30 ° C и 120 оборотов в минуту. Гранул клеток в течение 5 мин при 700 мкг и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок в 4,5 мл стерильного 0,9% (вес / объем) NaCl и хорошо перемешать, осторожно пипеткой вверх и вниз с помощью серологической пипеткой 10 мл. Вывод 50 мкл и готовят в десять раз разведений в 0,9% NaCl от 1:10 до 1: 1000. Пластина 100 мкл каждого разведения на 90-мм чашки Петри, содержащие SD-Trp-Leu-агар. Spread остальную часть неразбавленного дрожжей взмучивания на 16- х 150-мм чашках Петри с диаметром SD-Trp-Leu-His-Ade агар. Добавьте 3-АТ к среде, чтобы уменьшить самоактивацию. Выдержите SD-Trp-LeuПланшеты в течение трех дней и SD-Trp-Leu-His-ADE пластины в течение четырех дней при 30 ° C. Примечание: Клоны, которые появляются на селективных пластинах (потенциальных) взаимодействующих пар и нести плазмиду, кодирующую pGAD-HA для приманки взаимодействующих партнеров. Определить эффективность трансфекции путем подсчета колоний различных серийных разведений на пластинах выбора SD-Trp-Leu. Передача каждого клона путем сбора и полосатость колонии с помощью стерильной пипетки на свежие SD-Trp-Leu-его-ADE-селективных пластин. Инкубируйте пластин в течение 24 ч при 30 ° С. Повторите этот шаг каждый день до тех пор, в общей сложности пять проходов не будет достигнуто. 8. Анализ клонов из селективных пластин Подготовьте один стерильный 2 мл реакционной трубки 1 мл SD-Trp-Leu-His-ADE для каждого клона под стерильным колпаком. Удар отверстие в каждую пробирку с горячей иглой и закройте отверстие куском газопроницаемых герметиком. Привить каждый флакон с мате свежей колонии риала из одного клона (этап 7.17, использование клонов после 5 – го прохода) и инкубировать в течение 24 ч при 30 ° С, встряхивая при 150 оборотах в минуту. Примечание: Важно, чтобы принимать клоны из свежей пластинки, так как дрожжи взяты из пластин, хранившихся в течение нескольких дней при температуре 4 ° С не растут достаточно в течение 24 ч в жидкой среде. Гранул дрожжи в течение 5 мин при 4000 х г и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок в соответствующем буфере для ресуспендирования (из соответствующего набора Минипрепарат плазмидной ДНК) и передать его в свежую реакционную пробирку 2,0 мл. Добавьте 100 мкл кислоты вымытые стеклянные шарики (425- 600 мкм диаметра) и энергично перемешивают в течение 5 мин. Добавьте соответствующий буфер для лизиса и приступить к очистке плазмиды с использованием препарата плазмидной мини-набор в соответствии с инструкциями изготовителя. Элюции плазмидной ДНК с 50 мкл воды. С помощью ДНК из стадии 8.3 для реакции секвенирования с добычей плазмиды-специфического праймера, GAL4ADseqисх "> 41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3 '. Проверьте взаимодействие с помощью De Novo совместно преобразования 43, 44 и приманка вектор добычи. Выберите трансформированных дрожжей на SD-Trp-Leu-его-ADE пластин отбора.

Representative Results

Перед тем как фактический экран Y2H может быть выполнена приманка должна быть испытана для самостоятельной активации. Это достигается путем преобразования вектора экспрессии приманку вместе с пустым вектором библиотечной добычей и проверка роста на селективных планшетах. Для анализа phytoplasmal белок ATP_00189 является ли самоактивирующимися, тест самоактивацию проводили , как описано в разделе 5. Плазмиду приманка дополняет ГТО и добычей плазмиде лея ауксотрофию S. CEREVISIAE NMY51 40. Успешное сотрудничество преобразование, таким образом, характеризуется ростом на селективные пластин, не имеющих TRP и Leu. Взаимодействие приманки и добычей белка приводит к комплементации его и АДЭ ауксотрофию NMY51. При появлении самостоятельной активации с помощью приманки в отсутствие взаимодействия, дрожжи растут на селективных пластин, не имеющих его и АДЭ. Сильные и слабые само-активация может происходить. Сильное самоактивацию приманки характеризуется ростом котрансформированы дрожжей на Trp-Leu-His-Ade обедненный пластин селекции. Слабая самоактивацию приводит к росту на Trp-Leu-его, но не на Trp-Leu-его-ADE истощены пластин отбора. Надлежащие положительного контроля необходимы для интерпретации результатов анализа самостоятельной активации. Краткое описание ожидаемых результатов анализа самоактивацию и их интерпретация представлены в таблице 1 и визуализированы на рисунке 1. Рисунок 1: Пример Bait самоактивацию Испытания приманку Перед выполнением Y2H экрана. S.cerevisiae , NMY51 был котрансформируют с взаимодействующими приманку (PLEX-p53) и добычей (ПАКТ-largeT) в качестве положительного контроля (левая панель: переменный ток), слабо активирующего себе плюс пустая жертва Весахчень вектор (средняя панель: ДФ) и не самоактивирующимися приманки плюс пустой вектор библиотека жертва (правая панель: ГИ). Котрансформируют дрожжи культивировали на SD пластин , не имеющих TRP и Leu (верхняя панель: а, д, г), Trp, Leu и его (средняя панель: б, д, з) и Trp, Leu, его и АДЭ (низший панель: C, F, I). Выбор на среде, не содержащей ГТО и лея является положительный контроль для успешного сотрудничества трансформации, так как вектор приманка дополняет ГТО ауксотрофию и добычу вектор лея ауксотрофию NMY51 (рост на SD-Trp-Leu). В случае взаимодействия между приманкой и добычу или самоактивацию приманки, выражение репортер NMY51 включается и дополняет его и АДЭ ауксотрофию (рост на SD-Trp-Leu-His-ADE). Слабая самоактивацию характеризуется ростом на SD-Trp-Leu-его пластин (средняя панель, ДФ). Слабая самоактивацию приманки должна быть уменьшена до анализа приманкув экране Y2H, например , путем добавления 3-АТ к селективной среде. истощение аминокислот обозначены "-" в соответствующем имени носителя. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. pLexA-N-atp00189 никто колонии нет никакого роста нет никакого роста нет никакого роста нет никакого роста никто pGAD-HA нет никакого роста колонии нет никакого роста нет никакого роста нет никакого роста pLexA-N никто колонии нет никакого роста нет никакого роста нет никакого роста нет никакого роста pLexA-N pGAD-HA колонии колонии <td> колонии нет никакого роста нет никакого роста pLexA-p53 рАСТ-largeT колонии колонии колонии колонии колонии pLexA-N-atp00189 pGAD-HA колонии колонии колонии нет никакого роста нет никакого роста Таблица 1: Ожидаемые результаты в приманку самоактивацию анализа. Превращение С. CEREVISIAE NMY51 дает в дифференциальный рост на селективных средах , основанных на характеристиках котрансформируют приманку и добычу. Рост на селективных планшетах оценивали при трансформации различных комбинаций вектор (AF) после 72 ч инкубации при 30 ° С. Слабая самоактивацию характеризуется ростом дрожжей на SD-Trp-Leu-His и сильной самостоятельной активации роста на SD-Trp-Leu-его-ADE выбора Platэс в отсутствии партнера взаимодействия. PLexA-N кодируются phytoplasmal эффектор ATP_00189 не проявляет самоактивацию, которое характеризуется неспособностью вектора приманки преобразованного NMY51 расти в отсутствие его и АДЭ. В зависимости от приманки, экран Y2H может получить множество клонов дрожжей, растущих на селективных планшетах. Все клоны должны быть проанализированы и проверены на предмет возможных сокращений. Даже если использовалась нормализованная библиотека кДНК, весьма вероятно, что Interactor представлена ​​во многих различных клонов. В зависимости от библиотечной техники клонирования, также возможно, что только фрагменты полноразмерного гена вставляются в некоторых векторов добычи. Таким образом , целесообразно De Novo усиливать (из кДНК) и субклонирования полный ген длины интерактора и проверить взаимодействие в анализе Y2H один-к-одному (рис 2). <img aл = "Рисунок 2" src = "/ файлы / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg" /> Рисунок 2: Пример взаимодействия между приманку и Prey в Y2H эксперименте. Экран с двумя гибридами дрожжей (Y2H) проводили и плазмиды из положительных клонов Interactor были очищены. Вектор добычу секвенировали и были определены Malus х Доместикой партнеров взаимодействия хост MdTCP24 и MdTCP25. В качестве отрицательного контроля MdTCP34 (для которых нет Interactor не был идентифицирован в библиотеке экране Y2H), субклонировали параллельно. Гены полной длины амплифицировали из кДНК яблока, субклонировали в вектор добычи (со-cistronically , выражающей активации домена AD) и заново котрансформируют с приманкой вектором , экспрессирующим бактериальной эффекторной ATP_00189 в сочетании с доменом связывания ДНК (BD). Эта цифра взята из 28. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличеннуюверсия этой фигуры.

Discussion

На экране Y2H, потенциал эффектор белок экспрессируется совместно с различными гипотетическими взаимодействующих белков (этап 7). Каждый растущий клон дрожжей содержит приманку, но (потенциально) различных Interactor. Взаимодействующие белки кодируются в библиотеке кДНК, которая клонирована в добычу плазмид. Приманки и добычей плазмид каждого кода со-cistronically для части фактора транскрипции дрожжей. В случае физического взаимодействия между приманкой (эффекторной) и добычей плазмиды с кодировкой интерактора, две части фактора транскрипции (ДНК-связывающий домен и домен активации) объединяются, и выражение гена-репортера индуцируется. Дрожжи способны расти на histidine- и аденина обедненного пластин выбора SD. Вид добычи библиотеки кДНК зависит от экранированного эффектора и должны быть выбраны соответствующим образом. Вектор добычи и приманки, а также штамм дрожжей, должны быть совместимы. На этом экране, ДНК-связывающий домен LexA и активации domai Gal4п были использованы в качестве совместимых единиц фактора дрожжей транскрипции. Библиотека кДНК может быть индивидуально построены, выполненное на заказ, или коммерчески получены. Получение добычи библиотеки кДНК не является частью данного протокола. В этом протоколе использовали возведенных, нормализованное библиотеки кДНК из РНК Malus х листьев Доместикой и клонировали в pGAD-HA 41. Эффектор (приманка) -expressing штамм дрожжей трансформировали в библиотеку добычи, и клоны отбирали на histidine- и аденина обедненного пластин выбора SD. Для извлечения плазмиды ДНК из колоний дрожжей, колонну на основе плазмидной ДНК мини-набор для бактерий рекомендуется использовать в сочетании с механической стадии разрыва с использованием стеклянных бусин для улучшения дрожжей лизис (этап 8). В этой очистки плазмидной, наживка и вектор добычи будет очищен одновременно в относительно низких концентрациях. Тем не менее, количество плазмидной ДНК достаточно для идентификации партнера взаимодействия с помощью секвенирования остроумиядо размножения плазмиды Хут (шаг 8.4). В качестве альтернативы, ДНК очищают на стадии 8.4 , могут быть преобразованы в компетентные клетки Е.coli и выбраны с добычей сопротивлением вектор-опосредованной антибиотика (например, ампициллин в случае pGAD-HA). Выбранное E.coli колоний , несут только библиотеку плазмиды pGAD-HA, и очистки плазмидной высокопродуктивный могут быть выполнены с этими клонами.

Успешная трансформация pLexA-N и pGAD-HA конструкций дополняет триптофана и лейцина ауксотрофию NMY51. Взаимодействие между эффектора и белком (кодируются на pGAD-HA), приводит к активации системы репортером в NMY51 штаммов. В случае самостоятельной активации, NMY51 трансформировали эффектора, выражающей pLexA-N в сочетании с пустым вектором библиотеки pGAD-HA растет на селективной пластин, не имеющих Trp-Leu-His-ADE, из-за нежелательной активации системы репортер NMY51 40. Самоактивацию может быть шEAK и может происходить в отсутствие Trp-Leu-His, или активация может быть сильной и характеризуется ростом на Trp-Leu-His-ADE пластин 41. Self-активация может вызвать массовый фон ложноположительных клонов в фактическом экране Y2H. Чтобы избежать этого, тест самоактивацию с приманкой должна быть проведена, в котором эффекторные экспрессирующих вектор является котрансформированы пустым вектором библиотеки. В этой экспериментальной установке, экспрессия гена-репортера, не должен быть вызван. В случае успешного завершения активации (т.е. роста на селективных планшетах) видна в тесте, среда может быть дополнена различными концентрациями 3-амино-1,2,4-триазола 45 (3-АТ). 3-АТ является ингибитором imidazoleglycerol-фосфатного дегидратазе (HIS3), фермента , важного в процессе биосинтеза гистидина 46. Обогащение с 3-АТ может уменьшить слабый эффект самостоятельной активации во время Y2H экранов 47,48. Различные концентрации 3-АТ должны быть проверены. В этом протоколе, 1 – использовали 40 мМ 3-АТ. Самая низкая концентрация, которая приводит к репрессии самостоятельной активации впоследствии следует использовать на экране Y2H. Селективные пластины анализа самоактивацию может быть оценена только если SD-Trp-Leu пластины котрансформации содержат достаточное количество клонов. В качестве ≥ индикации 500 колоний на 90-мм (диаметр) Петри достаточны. Для точного определения эффективности трансфекции, рекомендуется подготовить серийных разведений котрансформированы дрожжей и распространить их на SD-Trp-Leu пластин.

Для уменьшения самоактивацию эффектор может быть клонирована в pLexA-C, вектора экспрессии наживки, который плавит тег LeXa к С-концу белка. Ориентация Lex-A тега может ослабить самоактивацию 24. Тем не менее, это не возможно в каждом случае, чтобы уменьшить или отменить самоактивацию. Формированиекрасные или красноватые колонии указывает на слабую или ложноположительные взаимодействие. ADE2 ген репортер NMY51 активируется только тогда , когда речь идет о взаимодействии белок-белок, который , в свою очередь , блокирует накопление красного красителя в этом штамм дрожжей 40. В отсутствие взаимодействия, NMY51 красноватые, в то время как колонии, несущие сильные interactors белые. Наблюдение цвета колонии по отбору пластин, таким образом, обеспечивает еще один важный намек судить, если соответствующие колонии true- или ложно-положительных interactors.

Это в конечном счете необходимо адаптировать или изменить определенные параметры анализа с учетом характера приманки и характеристик взаимодействия. К настоящему времени, ряд усовершенствований и производных методов общей Y2H были установлены для обеспечения анализа достаточно сложных белковых взаимодействий в различных узлах. В обзоре Stynen и др. 49 обращается кй описывает различные аспекты Y2H, его улучшения и адаптации, и, таким образом, содержит полезную информацию о том, как выбрать соответствующий анализ взаимодействия.

Y2H экраны и производные методы стали широко использоваться в различных областях исследований, где требуется идентификация бинарных белковых взаимодействий. Даже если критические элементы управления выполняются, например, самоактивацию испытаний приманки и один на один повторных преобразований , определенных взаимодействующих белков, то Y2H склонен к ложным результатам 26, 50, 51. Дрожжи как модель не подходит для всех исследований взаимодействия. Дрожжи не обязательно представляет собой клеточную среду , которая поддерживает соответствующий пост-трансляционной модификации и откидные для каждого белка 24. Кроме того, в установке Y2H, белки сверхвыражен, и их экспрессия не контрольво главе с их естественной промоутера. Y2H заставляет партнеров протеиновые взаимодействия с ядром, которое не обязательно их естественной субклеточная назначения. Местные клеточные условия взаимодействия, таким образом, не может быть отражено дрожжей и может привести к ложно-отрицательных или ложно-положительных результатов. Большинство Y2H основаны на дрожжи ауксотрофию комплементации в качестве селективного принципа. Этот питательный выбор характеризуется высокой чувствительностью, но за счет сниженного селективности по сравнению с другими (например, хромогенного репортер) анализы , 49. Если unreducible самоактивацию (смотри выше) или другие ограничения возникают в течение определенного эффектора, то Y2H не является подходящим для анализа 25. В таблице 1 и на рисунке 1, ожидаемые результаты теста самоактивацию приведены. Отсутствие реальных взаимодействий (т.е. ложноотрицательных результатов) могут быть вызваны белковой токсичности, неправильная поступательная белкаобработка, стерических препятствий взаимодействия, недопредставленными партнеры взаимодействия в библиотеке добычи, локализации мембраны приманки, или отсутствующие компоненты , необходимые для взаимодействия 24.

Рекомендуется заново амплификации гена полнометражного идентифицированного взаимодействующего белка из кДНК, субклонирования его в pGAD-HA, а также выполнять анализ взаимодействия один-к-одному путем преобразования сгенерированный pGAD-HA построить в приманку , экспрессирующие NMY51 штамм. Это необходимо, поскольку наблюдаемая Interactor присутствует в библиотеке добычи может быть лишь фрагмент более крупного белка. Тем не менее, информация для соответствующего гена полной длины только доступна, если значительная геномных и транскриптомных данных последовательность доступна. Протокол преобразования для анализа самоактивацию описанного здесь может быть применен для такого анализа на один-к-одному, а взаимодействие между приманкой и интерактора должны быть воспроизводимы.

<p clпопка = "jove_content"> Взаимодействия, идентифицированные в экране Y2H всегда должен быть подтвержден другим независимым методом. Этот независимый метод должен быть ближе к естественной обстановке фактического взаимодействия белок-белок. В случае phytoplasmal эффекторной ATP_00189, взаимодействие с TCP транскрипционных факторов Malus х Доместикой была проверена в Планта с бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) в Nicotiana benthamiana протопластов 28 (не является частью данного протокола). Эффектор белок ATP_00189 был получен из растений патогена P. Mali. В Планта BiFC , таким образом , был выбран для проверки ATP_00189 взаимодействия с Malus х Доместикой факторов транскрипции ранее были определены в Y2H 28. BiFC представляет собой анализ белок-белкового взаимодействия, который не требует внутриклеточную транслокацию белков, взаимодействующих в ядре, чтобы активировать репортер системы <вир класс = "Xref"> 52. Кроме того, в Planta экспрессии и модификации машин подражает среды естественного взаимодействия растений бактериальной эффектора в его растения – хозяина. Тем не менее, глобальный экран с помощью BiFC не представляется возможным.

Есть несколько шагов в протоколе, который должен быть тщательно рассмотрены. При амплификации представляющего интерес гена (этап 4), важно, чтобы исключить, что праймеры связываются с ДНК растений. Таким образом, ДНК из неинфицированных растений должны быть включены в качестве отрицательного контроля. Последовательность гена, не должны содержать сайты рестрикции EcoRI и SalI, которые используются для направленного клонирования вставки. Если последовательность действительно содержит эти участки, различные ферменты рестрикции для клонирования должны быть выбраны. Трансформацию дрожжей является центральным методом в течение этого протокола. Эффективность трансфекции зависит от компетентности дрожжевых клеток, их жизнеспособность, состояние роста, а также от качества трансфекции КГНлор 53, 54. Для предлагаемого протокола, настоятельно рекомендуется использовать дрожжи из свежих пластин не старше двух недель (хранить при температуре 4 ° С) при выполнении преобразований. Часто, рост трансформированных дрожжей задерживается при селективных жидких культур засевают колоний от старых чашках с агаром. Кроме того, полезно использовать жидкую закваску в качестве посевного материала для реальных экспериментов, а не использовать дрожжи непосредственно из пластины. Низкая эффективность при трансфекцию добычу в приманке, экспрессирующих дрожжей может привести к недопредставленностью некоторых белков добычи (потенциальных interactors) и таким образом может исказить весь экран. В этом протоколе, дрожжевая эффективность трансфекции ~ 150000 КОЕ / мкг, трансфицированных ДНК в Y2H работал хорошо.

Зная недостатки и недостатки метода Y2H и интерпретации результатов в критическом и надлежащим образом является необходимым условием для составления корбанкаЭСТ выводы. Y2H анализы и производные были использованы в течение многих лет и претерпели множество улучшений и адаптации по отношению к различным характеристикам наживки, субклеточная локализация взаимодействия, ожидаемые связывающие партнеры, а также другие факторы, которые могут потребоваться для взаимодействия (см Y3H 55, 56, 57). В последнее время на основе массивов экраны Y2H были разработаны , которые позволяют автоматизировать, с высокой пропускной способностью анализа многочисленных приманок против миллионов охотится 58. Будущее, скорее всего, заключается в автоматизации и высокой пропускной способности подходов к данного анализа, чтобы позволить выяснению сложных сигнальных путей и интерактомов в различных областях исследований.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Кристин Kerschbamer, Томас Letschka, Sabine Oettl, Маргот Raffeiner и Флориан Senoner из научно-исследовательского центра Laimburg и Мирель Borges Dias Schnetzer от Dualsystems Biotech AG за техническую поддержку и Юлии Штробле за вычитку рукописи. Эта работа была выполнена в рамках проекта APPL2.0 и частично финансируется за счет автономной провинции Больцано / Больцано, Италия и консорциум Южного Тироля Apple.

Materials

Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) Applichem A6284 for DNA preparation
Trishydroxymethylaminomethane (Tris) Applichem A2264 for media and buffer
Sodiumchloride (NaCl) Applichem A2942 for media and buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA) Applichem A2937 for media and buffer
N-Lauroylsarcosin sodium salt Applichem A7402 for DNA preparation
ammonium acetate  Sigma-Aldrich (Fluka) 9688 for DNA preparation
2-mercaptoethanol Applichem A1108 for DNA preparation
Isopropanol (2-Propanol) Applichem A3928 for DNA preparation
Ethanol Sigma-Aldrich (Fluka) 51976 for DNA preparation
RNAse Applichem A2760 for DNA preparation
Chloroform:Isoamyl 24:1 Applichem A1935 for DNA preparation
Proofreading Polymerase (e.g. iProof) Bio-Rad 203433 for PCR
EcoRI Thermo Scientific ER0271 for cloning
SalI Thermo Scientific ER0641 for cloning
Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick) Qiagen 28104 for cloning
Kanamycin Sulfate Applichem A1493 for microbiological selection
3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT) Sigma-Aldrich A8056 for self-activation assay
L-Arginine Monohydrochloride  Applichem A3680 for yeast culture
L-Isoleucine  Applichem A3642 for yeast culture
L-lysine Monohydrate  Applichem A3448 for yeast culture
L-Methionine  Applichem A3897 for yeast culture
L-Phenylalanine  Applichem A3464 for yeast culture
L-Threonine  Applichem A3946 for yeast culture
L-Tyrosine  Applichem A3401 for yeast culture
L-Uracile Applichem A0667 for yeast culture
L-Valine  Applichem A3406 for yeast culture
L-Adenine Hemisulfate Salt  Applichem A1596 for yeast culture
0.22 µm Pore Filter Sartorius 16541 for sterile filtration
L-Histidine Monohydrochloride Applichem A3719 for yeast culture
L-Leucine  Applichem A3496 for yeast culture
L-Tryptophane  Applichem A3410 for yeast culture
Yeast Nitrogen Base  Sigma-Aldrich 51483 for yeast culture
D-Glucose Monohydrate  Applichem A1349 for yeast culture
Agar Fisher Scientific BP2641-1 for yeast and bacteria culture
Peptone Applichem A2208 for yeast culture
Polyethylene Glycol 4000 (PEG) Applichem A1249 for yeast transformation
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc) Applichem A3478 for yeast transformation
Salmon Sperm DNA  Applichem A2159 for yeast transformation
Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region) Millipore 06-719 for Western blot
Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit) Sigma-Aldrich PLN350 for plasmid purification from yeast and bacteria
Acid Washed Glass Beads Sigma-Aldrich G8772 for plasmid purification from yeast
Ampicillin Sodium Salt Applichem A0839 for microbiological selection
Yeast Extract Applichem A1552 for yeast culture
Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301) Eppendorf Z368245 (Sigma) for DNA preparation
Bait vector (e.g. pLexA-N) Dualsystems P01004 for Y2H
Prey vector (e.g. pGAD-HA) Dualsystems P01004 for Y2H
Control prey vector (e.g. pLexA-p53) Dualsystems P01004 for Y2H
Control bait vector (e.g. pACT-largeT) Dualsystems P01004 for Y2H
Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells) Invitrogen C640003 for cloning
Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51) Dualsystems P01004 for Y2H
Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M) Sigma-Aldrich P7793-1EA for yeast and bacteria culture
Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal) Greiner 676 051 for yeast culture
PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler) Bio-Rad 1861096 for PCR
quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System) Bio-Rad 1855195 for quantitative PCR
Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R) Eppendorf 5417 R general lab equipment
Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R) Eppendorf 5804 R general lab equipment
Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free) 5Prime 2500010 for PCR and DNA works
Scalpell Swann-Morton 0301 for DNA preparation
Sterile filter (0.22 µm; Polyethersulfone)) VWR-International 514-0073 (European Catalogue number) for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 90 mm  Greiner Bio-One 633180 for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 150 mm  Greiner Bio-One 639161 for yeast culture
Photometer (e.g. BioPhotometer) Eppendorf 550507804 for yeast culture
Photometer Cuvettes Brand 759015 for yeast culture
Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7) Memmert WB7 for yeast transformation
Western Blot Equipment Bio-Rad diverse for protein detection
dNTPs 5Prime 2201210 for cloning
Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks) Sigma Aldrich Z232793, Z232858, Z232866 for yeast and bacteria culture
Shaking Incubator (e.g. GFL 3031) GFL 3031 for yeast and bacteria culture
Incubator Binder KB 53 (E3.1) for yeast and bacteria culture
Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825) Omniwash IF 825 general lab equipment
0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene) Eppendorf 0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml) general lab equipment
Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 µl) Eppendorf diverse general lab equipment
Spreader Sigma-Aldrich SPR-L-S01 for yeast and bacteria culture
Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker) IKA 3617000 general lab equipment
T4-Ligase Thermo Fisher EL0011 for cloning
Fridge (4°C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000) Liebherr 81.767.580.4 general lab equipment
Freezer (-20°C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216) Liebherr G5216 general lab equipment
Graduated Cylinder (e.g. Brand) Sigma Aldrich Z327352; Z327417; Z327441   general lab equipment
Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand) Thermo Fisher S55701 for yeast and bacteria culture
Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2) Integra-Biosciences 155000 general lab equipment
Cuvettes for Electroporation (1 mm) Molecular Bio Products 5510-11 for bacteria transformation
Electroporator (e.g. Eporator) Eppendorf 4309000019 for bacteria transformation
Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System) Bio-Rad 1708280 general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml) VWR-International  525-0403 (European Catalogue number) general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml) BD Falcon 352096 general lab equipment
Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M) Thermo Scientific P2325 for ligation
adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM)) Ambion  AM8110G (distributed by Thermo Scientific) for ligation
Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements) Sigma-Aldrich Y2021 Sigma  for yeast culture (ready-made mix)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fields, S., Song, O. -. K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Dombrosky-Ferlan, P. -. M., Corey, S. -. J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
  3. Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
  4. Lee, H. -. J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
  5. Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
  6. Kumar, A., Godwin, J. -. W., Gates, P. -. B., Garza-Garcia, A. -. A., Brockes, J. -. P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
  7. Park, S. -. Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
  9. Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
  10. Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
  11. Young, K. -. H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
  12. Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
  13. Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
  14. McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
  15. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  16. Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22 (2013).
  17. Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
  18. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
  19. Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -. J. -. M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
  20. Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
  21. Tseng, T. -. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
  22. MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835 (2014).
  23. Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
  24. van Criekinge, W., Beyaert, R. Yeast Two-Hybrid: State of the Art. Biol Proced Online. 2 (1), 1-38 (1999).
  25. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  26. Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
  27. Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
  28. Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors – a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
  29. Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
  30. Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
  31. Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
  32. Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423 (2002).
  33. Applichem. . N-Lauroylsarcosine sodium salt. , (2015).
  34. Applichem. . 2-Mercaptoethanol. , (2015).
  35. Applichem. . 2-Propanol. , (2015).
  36. Applichem. . Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , (2015).
  37. Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
  38. Applichem. . Kanamycin sulfate. , (2015).
  39. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
  40. Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , 1917-1952 (2008).
  41. . Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit – Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
  42. Kurien, B. -. T., Scofield, R. -. H. . Protein Blotting and Detection. , (2009).
  43. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  44. . . Yeast Transformation and Cloning. , (2016).
  45. Sigma-Aldrich. . 3-Amino-1,2,4-triazole. , (2016).
  46. Ames, B. -. N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
  47. Joung, J. -. K., Ramm, E. -. I., Pabo, C. -. O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
  48. Brennan, M. -. B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
  49. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
  50. Hengen, P. -. H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
  51. Vidalain, P. -. O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
  52. Pattanaik, S., Werkman, J. -. R., Yuan, L., Yuan, L., Perry, E. S. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 185-193 (2011).
  53. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
  54. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  55. Bernstein, D. -. S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  56. Stumpf, C. -. R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
  57. Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
  58. Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).

Tags

Bacterial EffectorNon-cultivable Plant PathogenYeast Two-hybrid ScreenCandidatus PhytoplasmaMalus DomesticaApple Proliferation DiseaseInfection ResearchDNA IsolationEffector Gene AmplificationBait VectorSelf-activationEffector ExpressionSD-trp PlateSD-trp MediumNMY51

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Janik, K., Schlink, K. Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen. J. Vis. Exp. (119), e55150, doi:10.3791/55150 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image