JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Published: March 05, 2017
doi:
10.3791/55148
, , ,
1Department of Biosciences and Nutrition,Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health,KTH Royal Institute of Technology

Summary

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

في البحوث الطبية، وتركز الكثير من الاهتمام على بروتينات الغشاء، داخلية كانت أم خارجية، والمشاركة في مجموعة متنوعة من التفاعلات الدهون. العمل مع البروتينات التفاعل الدهون يتضمن إما اختيار بديلا عن الدهون، مثل المنظفات، amphipols 1، أو بروتينات صغيرة 2، أو إيجاد بديل غشاء التي تحافظ على بروتين قابل للذوبان ونشطة. وتشمل بدائل غشاء ليبويك الجسيمات الشحمية وnanodiscs (ND) 3، 4.

Nanodiscs هي منصات غشاء شبه الأم التي وضعتها الهندسة الجزء البروتين، وبرنامج عمل ألماتي-1، من البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL) التي تحدث بشكل طبيعي في الدم. برنامج عمل ألماتي-1 هو سلسلة 243 بقايا طويلة من قصيرة متقابلة الزمر α-اللوالب، ولها التشكل للذوبان خالية من الدهون. في المختبر في وجود الدهون، نسختين من البروتين برنامج عمل ألماتي-1 إعادة ترتيب تلقائيا إلى تطويق HYDRophobic جزء سلسلة أسيل من الدهن طبقة ثنائية التصحيح 5. النسخ المهندسة لبرنامج عمل ألماتي-1 وتسمى عادة بروتينات الغشاء السقالات (MSP)، وعدد متزايد متاح تجاريا باسم البلازميدات أو تنقية البروتينات. التكرار أو الحذف من α-اللوالب في برنامج عمل ألماتي-1 نتيجة في أطول 6 أو أقصر البروتينات السقالات 7 الغشاء. وهذا بدوره يجعل من الممكن لتشكيل أقراص حوالي 6 نانومتر إلى 17 نانومتر 7 8 في قطر. وهناك أنواع مختلفة من التطبيقات لnanodiscs 3 و 9. التطبيق الأكثر شيوعا هو لتوفير بيئة غشاء شبه أصلي لتحقيق الاستقرار في بروتين الغشاء لا يتجزأ 8، سبق استعراضها 3 و 9. واستخدام أقل استكشافها هو لتوفير سطح غشاء النانو لدراسة البروتينات 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17 غشاء الطرفية. المادة 1 من البروتوكول يتصور تحت الإجراء لصنع nanodiscs تتألف من الدهون الفوسفاتية والبروتين غشاء السقالات.

تحضير عينات هو عنق الزجاجة في معظم الطرق. عينات طريقة محددة قد تضيف معلومات معينة، ولكنها أيضا إجراء مقارنات النتائج صعوبة. وبالتالي، فمن أبسط عندما العينات المتعدد الوسائط، ويمكن استخدامها مباشرة في العديد من الطرق المختلفة. ميزة واحدة مع استخدام nanodiscs هي صغر حجم nanodisc بالمقارنة مع الجسيمات الشحمية (على سبيل المثال، وعينات يمكن استخدامها مباشرة لكل من تيم وعدم تغيير طبيعة الكهربائي للهلام، كما هو الحال في هذا البروتوكول).

<p clasالصورة = "jove_content"> وقد استخدمت الحويصلات والجسيمات الشحمية وقتا طويلا لفهم وظيفة من البروتينات التفاعل الغشاء. للدراسات الهيكلية والتصور، ومثال على تقرير الهيكلي للبروتين الغشاء في الجسيمات الشحمية متاح 18. ومع ذلك، فقد تم نشر أية عالية الدقة هيكل 3D من بروتين الغشاء monotopic جزءا لا يتجزأ من على غشاء الحويصلية بعد، بقدر ما نعرف. جزيئات الذهب أو الأجسام المضادة يمكن استخدامها لتصور البروتينات ملزمة لالليبوزومات أو حويصلات باستخدام تيم 19. على الرغم من أن هذه التحقيقات هي محددة للغاية، لأنها قد تتداخل مع البروتينات ملزم الغشاء الحجاب الموقع غشاء ملزم أو عن طريق اخفاء المجالات ذات الاهتمام مع أجزاء مرنة. الذهب المسمى أو ربما يمكن أن تحلل البروتينات المعقد الأجسام المضادة على هلام، ولكن هذا من شأنه أن يزيد من تكلفة التجربة.

على الرغم من الجسيمات الشحمية هي منصة ممتازة، لا يمكن للمرء أن يكون على يقين من أن البوبulation لديها نسبة معينة من البروتين لكل الحويصلية، وهي الميزة التي يمكن استكشافها عن طريق استخدام nanodiscs 20. في الحويصلية، العوامل المساعدة وركائز يمكن محاصرين في الداخل القابلة للذوبان. والمواد التي هي غشاء للذوبان في مشاركة نفس مصير لكلا النوعين من محاكيات الغشاء. على الرغم من ذلك، حيث أن منطقة طبقة ثنائية أصغر في nanodiscs، مطلوب كمية أقل من مادة لتشبع الأغشية nanodisc.

وكانت وظيفة البروتين فهم من خلال تحديد التركيب الذري أساسيا للعديد من مجالات البحث. وتشمل وسائل لتحديد بنية البروتين الأشعة السينية 21؛ الرنين المغناطيسي النووي (NMR) 22، 23؛ وانتقال المجهر الإلكتروني (تيم) 24 في درجات الحرارة المبردة، cryoEM. القرار الذي cryoEM تمت في الآونة الأخيرة قد تحسنت إلى حد كبير، ويرجع ذلك أساسا إلى استخدام المباشر الإلكترون ديtectors 25 و 26. يتم تصوير الجزيئات في رقيقة، زجاجي الجليد 27 في حالة شبه الأصلي. ولكن نظرا لتباين منخفض الجزيئات البيولوجية، فإنها تصبح من الصعب كشف في حجم مجموعة من 100-200 كيلو دالتون. للحصول على عينات بحجم مناسب، وجمع البيانات يمكن أن تكون وسيلة لإعادة الإعمار جسيم واحد يمكن تطبيقها للحصول على هيكل 28.

ومع ذلك، فإن تحديد بنية البروتين عن طريق تيم هو عملية متعددة الخطوات. وعادة ما يبدأ تقييم عينة monodispersity بواسطة وصمة عار السلبية تيم 29 باستخدام أملاح المعادن الثقيلة مثل phosphotungsten (PT) 30 أو اليورانيوم 31. إعادة بناء نموذج منخفضة الدقة من جزيء ملطخة سلبا يتم عادة ويمكن أن تسفر عن معلومات هامة عن التركيب الجزيئي 29. بالتوازي،جمع البيانات باستخدام cryoEM قد تبدأ. ينبغي توخي الحذر عند تقييم البيانات تيم وصمة عار السلبية لتجنب سوء الفهم من تشكيل الحرفية. واحد الحرفية خاص هو تأثير وصمة عار PT على الدهون الفوسفاتية والجسيمات الشحمية 32، مما أدى إلى تشكيل قضبان طويلة تشبه رزمة من النقود ينظر اليها من الجانب 33. وقد لوحظت هذه "رولو" أو "أكوام" (الرمز الآخرة بأنها "أكوام") في وقت مبكر لHDL 34، وبعد ذلك أيضا لnanodiscs 35.

قد يحدث التراص وإعادة تشكيل الأغشية لأسباب عديدة. على سبيل المثال، يمكن أن تحدثها العوامل المشتركة مثل النحاس ويتضح من التصوير تيم في الأمونيوم كربونات صمة عار 36. وجزء من نسبة الدهون في غشاء في الجسيمات الشحمية احتوى على مجموعة حمض رئيس iminodiacetic محاكاة complexation المعدنية بنسبة EDTA، وبالتالي التراص الجسيمات الشحمية بعد إضافة أيونات النحاس <sحتى الطبقة = "XREF"> 36. التراص يمكن أن يكون أيضا نتيجة لتفاعل البروتين البروتين بواسطة بروتين في أو على طبقات ثنائية الدهون (وصمة عار المستخدمة لم يرد ذكرها) 37. وقد لوحظ تشكيل كومة من الدهون الفوسفاتية من قبل حزب العمال في وقت مبكر. ومع ذلك، فقد تركز العمل في وقت لاحق على إزالة أو إلغاء هذا التشكيل قطعة أثرية 38.

هنا، نقترح طريقة للاستفادة من nanodisc يسببها نابت التراص لدراسة البروتينات ملزم الغشاء بواسطة تيم. وباختصار، فإن بروتين ملزمة على nanodiscs منع nanodiscs من التراص. على الرغم من أن أسباب التراص ليست واضحة، اقترح 39 أن هناك تفاعل الكهربائي بين الدهون الفوسفاتية ومجموعة فسفوريل من حزب العمال، مما تسبب في أقراص التمسك بعضها البعض (الشكل 1A). فرضية وراء بروتوكول لدينا هي أنه عندما يتحد بروتين لnanodisc، معظم سطح فوسفورية ليس عن توافر بليه للتفاعل مع حزب العمال بسبب عائق الفراغية من البروتين. وهذا من شأنه منع تشكيل كومة (الشكل 1B). نتيجتين يمكن استخلاصها. أولا، منع التراص يعني أن البروتين من الفائدة وبد أن الغشاء. ثانيا، مجمع البروتين ND يمكن علاجها مع أساليب المعالجة جسيم واحد القياسية 24 و 40 للحصول على التشكل الخام من المجمع. وعلاوة على ذلك، يحلل بأساليب مثل عدم تغيير طبيعة هلام الكهربائي أو ديناميكية تشتت الضوء لا يمكن أن يؤديها.

لإثبات هذه الفرضية، استخدمنا ملزم غشاء البروتين 5 أكسيجيناز شحمية (5LO)، التي تشارك في العديد من الأمراض الالتهابية 41، 42. يتطلب هذا البروتين 78 كيلو دالتون أيونات الكالسيوم إلى ربط الغشاء 43. على الرغم من هذا الارتباط غشاء وقد درس على نطاق واسع باستخدام الجسيمات الشحميةالصورة = "XREF"> 44، 45، 46 و كسور غشاء 47، وهذه لا يمكن استخدامها لتحليل تيم وتقرير الهيكل.

إعداد nanodiscs يبدأ عن طريق خلط MSP مع الدهون معلق في كوليت المنظفات الصوديوم. بعد مرور فترة الحضانة على الجليد لمدة 1 ساعة، وإزالة المنظفات ببطء من خليط إعادة استخدام الراتنج مكثف. في كثير من الأحيان يتم إجراء هذا النوع من المواد من البوليسترين شكل إلى حبات صغيرة. هم مسعور نسبيا ولها تفضيل قوي لالمنظفات ملزمة مقارنة مع الدهون 48. بعد إزالة حبات مسعور وأداء توضيح باستخدام الطرد المركزي، وتنقية nanodiscs بواسطة اللوني حجم الاستبعاد (SEC). يتم خلط nanodiscs تنقيته مع بروتين monotopic غشاء (والعوامل المساعدة الممكنة) في نسبة متساوي المولية (أو عدة نسب لالمعايرة) ويترك إلى react (15 دقيقة). ويتم تحليلها من قبل تيم من خلال تطبيق ميكرولتر كميات من العينة على وشبكات الكربون المغلفة يتوهج تفريغها ومن ثم عن طريق أداء تلطيخ السلبية مع نابت. نفس العينة من عندما طبقت قسامات إلى شبكات تيم يمكن استخدامها لتحليل من قبل غير تغيير طبيعة أو SDS PAGE هلام الكهربائي، فضلا عن أنواع مختلفة من قياسات النشاط، دون أي تغييرات جوهرية.

Protocol

1. إعداد Nanodiscs التعبير وتنقية البروتين الغشاء السقالات 8، 35 تعبير عن MSP1E3D1 صاحب الموسومة في كولاي BL21 (DE3) T1R pRARE2 السلالة في قوارير. إعدا…

Representative Results

طريقة نقترح يعتمد على إعداد nanodiscs لتوفير سطح الغشاء لmonotopic ملزمة غشاء من البروتين. حيث لا يوجد بروتين الغشاء جزءا لا يتجزأ في طبقة ثنائية nanodisc الدهون، وهنا يرمز لnanodiscs باسم "nanodiscs فارغة" (الشكل 2A). هذه لها حساب الوزن الجزيئي 256 كيلو دالتون…

Discussion

يمكن فصل طريقة إلى ثلاثة أجزاء: إعادة تشكيل nanodiscs فارغة، وإعداد المجمعات البروتين nanodisc، وتلطيخ السلبية للتيم من هذه المجمعات. وسيتم تناول كل جزء بشكل منفصل بشأن القيود المفروضة على هذه التقنية، والخطوات الحاسمة، وتعديلات مفيدة.

إ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلفان بالشكر إلى مجلس السويدية بحوث، مجلس مقاطعة ستوكهولم، وصناديق KI لدعمهم. تم إجراء التعبير وتنقية MSP في معهد كارولينسكا / SciLifeLab البروتين مرفق العلوم الأساسية (http://PSF.ki.se). فإن الكتاب أود أيضا أن أشكر الدكتور باسي Purhonen والدكتور ماتيلدا سوبيرغ لتبادل الخبرات الفنية ولما قدموه من مساعدة في الوقت المناسب.

Materials

Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid:POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl Store at 4°C for a week or
Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 BN2001 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250 BN2002 Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer 50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S BN2003 Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer 25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer 0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol Inhouse receipe
Terrific broth Tryptone – 12.0g
Yeast Extract – 24.0g
100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4
Glycerol – 4 mL		 Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., Duzgunes, N. e. j. a. t., et al. . Methods in Enzymology. 464, 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination – the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116 (2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochimie. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochimie. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187 (2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910 (2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Tags

Membrane ProteinsTransmission Electron MicroscopyNanodiscMSP1E3D1POPCSodium CholateProtein-membrane InteractionDrug DevelopmentStructural Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image