호중구 Phagosome 이미징 및 세포질은 비례의 pH 표시기를 사용하여

윤리 문 : 모든 동물의 작업은 라이센스 및 영국 홈 오피스의 승인을 실시했다. 이 연구에서 인간의 참여는 인간 연구의 윤리에 공동 UCL / UCLH위원회에 의해 승인되었다. 모든 참가자는 동의를 제공했다. C. 알비 칸스의 제조 1 제조업체의 지침에 따라 같은 YPD 한천 플레이트에 칸디다 디스크 (재료 목록 참조) 성장. 콜로니를 골라 YPD 배지 15 ㎖의에 추가. 발효액은 흐린 (일반적으로 약 2 일, 또는 약 / ㎖ 9 1 × 이상의 농도로)이 될 때까지 30 ° C, 200 rpm에서 진탕 배양기에서 부화. 칸디다 매체를 스핀 다운하고 인산 완충 용액 (PBS) 50 ㎖에 재현 탁을. 10 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기. 두 번이 단계를 반복합니다. 전체의 튜브가되도록 60 ℃로 예열 된 수조에 PBS / 칸디다 배지 50 ㎖를 함유하는 튜브를 배치1 시간 동안 ubmerged. 칸디다는 YPD 한천 플레이트에 열 사망, 행진 샘플이며, 30 ° C에서 하룻밤 배양 있는지 확인합니다. 5-9 열 살해 (HK) 칸디다 농도를 조정 × 108 / ㎖, 칸디다 성장에 따라 C와 냉동고 -20 °에서 1 mL의 분취 액에 저장. 참고 :이 프로토콜의 모든 세포 수는 자동 세포 계수기를 사용하여 수행되었다. 2. S-1 커플 링은 (HK) 칸디다 죽인 열 고급 디메틸 술폭 시드 100 μL (DMSO)로 희석하여 카르복시 S-1 숙신 이미 딜 에스터 (50 μg의)의 분취 량을 준비한다. 소용돌이 잘 혼합한다. 15 ㎖의 튜브에 0.1 M 중탄산 나트륨 (PH 8.3)에 1 × 108 HK 칸디다 1 ㎖를 준비한다. 100 μL 카르복시 S-1 대략 소용돌이에 2,000 RPM (고속 중간)을 혼합하면서 HK 칸디다에 한 번에 한 방울을 추가한다. 알루미늄 FOI 랩상기 튜브의 주위 (L)와 실온에서 1 시간 동안 롤러에 배치. 10 분마다 2,250 XG에서 원심 HK Candida- S-1 (HKC-S-1)를 세 번 세척 하였다. 처음 두 세척 들어, 0.1 M 중탄산 나트륨 (PH 8.3)의 15 mL 중 펠렛을 재현 탁. 세 번째 세척 후에 평형 염액 완충액 1 ㎖에 재현 탁하여 (표 1 참조). 100 μL 씩의 튜브로 HKC-S-1 현탁액을 옮기고 -20 ℃에서 보관. 주 : 가능하면 낮은 표면으로서, 소재 구속력과 이용 튜브 HKC-S-1 입자는 통상 원심 관의 벽에 붙어있다. Opsonize HKC-S-1 인간 호중구를 들어, 해동의 100 μL HKC-S-1에 인간 IgG 혈청의 100 μL를 추가합니다. 마우스 호중구 정상 마우스 혈청 50 μL를 추가 칸디다 마우스 면역 혈청의 50 μL를 5 μL 100 (HK 칸디다 주입 C57B6 생쥐에서 생성)의 HKC-S-1. 37 ℃에서 가열을 진탕 혼합하고 60 내지 90 분 동안 1,100 rpm으로 한 후 2 시간 동안 39 ° C에서의 롤러. 1 분마다 17,200 XG에서 원심 분리하여 BSS 버퍼에 세 번 세척 하였다. BSS 완충액 100 μL에 재현 탁. 호중구 3. 분리 인간 말초 혈액 호중구, 건강한 기증자로부터 정맥 천자하여 혈액 15 mL를 취하여 1000 IU / ㎖ 헤파린 나트륨 용액 (헤파린 60 μL 혈액 / 10 mL)을 90 μL를 함유하는 20 mL의 주사기에 배치. 피펫 팁을 사용하여 주사기에 10 % 덱스 트란 용액 1.5㎖를 주입. 부드럽게 3 번을 반전하고 벤치에 똑바로 서 둡니다. 혈액은 담황색 적혈구를 함유하는 하부층 인 상부 버피 코트 층을 반으로 대략 분할 될 때까지 30 ~ 60 분을 기다린다. 조심스럽게 바늘을 통해 상층을 밀어 또는 피펫 팁으로 제거. 내가 넣어NA 15ml의 튜브. 빨간색 계층을 복용하지 마십시오. 5 mL를 피펫을 사용하여 밀도 구배 매질 3-4 mL를 넣어 두 개의 별개의 층을 수득하는 버피 코트 층 아래에서 튜브의 바닥 (자재 목록 참조). 10 분 동안 913 XG 원심 분리기. 참고 : 사용하여 마우스 호중구 (마우스 호중구 격리를 위해 17 참조 참조) 경우, 대신 골수에서 플러시 된 세포 현탁액을 사용합니다. 빨간 펠렛 남겨두고, 뜨는을 붓고. 부드럽게 소용돌이는 펠렛을 방해합니다. 펠렛에 증류수, 멸균 H 2 O 7의 용액을 첨가하고, 펠렛을 재현 탁 20 초 동안 반전. 배 식염수의 7 mL를 넣고 나머지 적혈구 용혈, 혼합 몇 번 반전. 5 분 동안 300 XG 원심 분리기. 상등액을 붓고 약 4 × 106 / ㎖로 BSS 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 세포의 최적 현미경 1.5-6 × 106 (6) 사이의 세포 현탁액 농도를 계속 참고 </SUP> / ㎖. 프레젠테이션 제 담 8 웰 플레이트 현미경을 사전 처리하고 실온에서 40-60 분 동안 각 웰의 폴리 -L- 라이신 200 μL (0.01 % 용액)과 (자재 목록 참조). 폴리 -L- 리신을 분리 (재사용 될 수있다) 및 증류수 H 2 O. 200 μL로 두 번 웰을 씻어 각 웰에 3.6 단계에서 제조 된 세포 현탁액을 200 μL를 추가한다. 30-60 분 동안 실온에서 인큐베이션. 하나 개의 튜브에 고급 DMSO 100 ㎕를 첨가하여 -5- (및 -6) 카르복시 -1- 아세 S (S-1-AM) 에스테르 (50 μg의)의 분취 량을 준비한다. 소용돌이 믹스합니다. 사용하지 않을 때는, -20 ° C에서 보관. 작은 튜브, 1.7 mL의 BSS 완충액 추가 S-1-AM 20 μL. 소용돌이 믹스합니다. BSS 완충액 200 μL로 두 번 웰을 세척 한 다음, S-1-AM 용액으로 버퍼를 교체한다. 부드럽게 피펫 팅하여 잘 바닥에 부착 세포의 단층을 방해하지 않도록주의하십시오웰의 벽 아래. 적어도 25 분 동안 실온에서 인큐베이션. BSS 완충액 200 μL로 두 번 웰을 세척한다. 억제제를 테스트하려면, BSS 버퍼에서 적절한 약물의 "마스터 믹스"를 구성합니다. 억제제 용액으로 두 번 웰을 세척한다. 참고 : 컨트롤에 약물 비히클 (예를 들어, DMSO 또는 에탄올)의 같은 양을 사용하는 것이 아니라 억제제를 사용 하였다해야합니다. 염화 아연의 효과를 시험하는 경우가 인산 아연 침전물로,합니다 (HEPES 단독 용액을 버퍼링 할 수) KH 2 PO 4 결여 BSS 버퍼를 사용한다. 5 ㎛의 진폭을 약 3 초 동안 옵 소닌 HKC-S-1 (6.2)을 초음파 처리. 각 웰에 10 μL를 추가합니다. 탐식 스냅 묘화 될 셀을 준비하게 탐식 있도록 15-20 분 동안 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. 5. 공 초점 현미경 공 초점 현미경을 사용하여, 일 때문에 레이저 파장을 조절세포에서 555 nm에서 흥분하고 방출은 두개의 채널, 또는 검출기에 의해 검출된다 : 560-600 nm 내지 600 nm를 초과. 참고 : 특정 현미경 매개 변수는 각 현미경 다를 필요는 연구자에 의해 최적화한다. 오일과 63X 렌즈를 사용하여 세포를 볼 수 있습니다. 중앙 타일을 볼 수 연속 설정에 타일 스캔 이미지를 사용합니다. 초점 레이저의 강도 및 두 채널의 이득을 형광 강도 검출기 채널의 이득을 조정 사용하여 이미지를 최적화한다. 두 채널을 볼 수있는 설정을 사용하여 이미지를 분할; 세포질이나 액포 형광 강도에는 채도가없는 것을 확인한다. 채도는 빨간 점으로 표시됩니다. 이 빨간색 점의 최소 숫자가 있지만, 세포와 phagosomes가 명확하게 볼 수있을만큼 밝은이되도록 레이저 강도를 줄입니다. 만족하는 경우, 클릭 "실험을 시작합니다." 9- 타일 스캔 화상이 생성된다. 복잡한 파일을 권장하는 이미지를 저장두 채널 (JPEG 또는 TIFF 생략)의 합성 화상을 포함하는 소프트웨어. 6. 교정 실험 혼자 칸디다와 산도 표준 곡선을 구축합니다. 표 1에 따라, 13.0의 pH 3.0의 완충액을 준비한다. HKC-S-1의 한 부분 표본 (100 μL)를 타고. 17,200 × g으로 1 분간 스핀 내려. 상기 할당 된 버퍼 500 μL에 재현 탁을. 낮은 pH 범위로부터 출발 한 상기 현탁액을 추가한다 (단계 4.2) 또한 전처리. 37 ℃로 설정된 가열 스테이지 상에 공 초점 현미경 슬라이드를 놓는다. 10 분 동안 형광마다 분을 기록합니다. 각 버퍼에 대해 반복합니다. 사포닌 표준 곡선. 1 × 107 인간 호중구 (5)를 분리하고, 낮은 pH 완충 1 ㎖에이를 재현 탁. (P)을 측정 부 (4)에 기재된 방법에 따라호중구의 hagosomal 산도. 20 분 동안 칸디다 현탁 배양 후, 0.3 % 사포닌 부가 (10 % 스톡 15 μL를 한 전처리 () 단계 4.2도)를 접시 후 37 ° C에서 20 분 동안 배양한다. 10 분 동안 이미지를 매 순간을 가져 가라. 각 버퍼에 대해 반복합니다. 기술은 5, 18, 19 + / nigericin 높은 K를 이용하여 세포 내 pH를 표준 곡선. 13.0 pH가 4.0, 표 1에 설명 된 버퍼를 확인합니다. 사전 처리 된 우물 만 호중구를 떠나, 단계 4.1-4.7에 따라 – 각 웰 다른 버퍼를 포함 할 수 있습니다. 37 ° C로 가열 단계로 슬라이드를 추가하고 10 분 동안 형광 분마다 기록한다. 세포질의 pH가 외부 용액으로 안정화하는 것은 약간의 시간이 걸릴 수 있지만,이 시점 이후에 상기 S-1의 비율 값이된다 참고일정한. 각 실험에서 세포 HKC-S-1 측정은 추가 된 억제제는 S-1의 형광 방출을 방해하거나, 버퍼의 pH가 영향을 미치지 않는 것을 확인하는 제어부로서 기능 할 수있다. 7. 이미지 분석 참고 : 여기에, 이미지 분석 (형광의 정량) 자유 소프트웨어 ImageJ에 사용에 대한 지침이 제공된다. ImageJ에 사용하는 것이 좋습니다. 다운로드 및 개발자의 지시에 따라 1.46r> ImageJ에 버전을 설치 (https://imagej.nih.gov/ij/). 라는이 프로토콜에 부착 된 보조 코드 파일 설치 "Phagosomal 측정을." 이미지 열기 J 도구 모음에 분석을 위해 선택한 이미지 파일을로드합니다. 두 채널을 결합하려면, 이미지> 색상> 복합을 확인하십시오. 결과를 저장할 파일을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 도구 모음에서 선 도구를 클릭하고 #을 &하는 폭을 높이기 위해 더블 클릭(34) 2 '. phagosome의 폭을 가로 지르는 선을 그린 다음 "측정 pH를"을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 두 채널의 평균 휘도를 취득하고, 그 비율은 ImageJ에있는 코드 파일에 의해 자동으로 계산된다. 측정을 마친 후, 선택 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 "파일을 저장합니다." phagosome 영역을 측정하기 위해, 지역의 주위에 자유의 손을 그리기 위해 도구 막대를 따라 네 번째 아이콘을 사용합니다. 선택 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 "측정 영역을." 참고 : 결과가 저장되고 로그 파일이 선택한 디렉토리에 생성됩니다. 결과는 스프레드 시트, R 또는 등가 소프트웨어를 사용하여 처리 될 수있다. 산도에 형광 비의 관계는 대략 S 자형이고, 상기 분석 ImageJ에 의해 생성 된 비의 값은 일반적인 로지스틱 또는 시그 모이 드 함수 또는 선형 또는 큐빅 스플라인 보간을 사용하여 pH로 전환시킬 수있다. 세포질에서 선을 그립니다, 세포질을 측정하려면 및에 "측정의 pH를 마우스 오른쪽 단추로 클릭".