Dextran aumenta a eficiência de Lentivirus transdução das células NK primário murino e humano
Summary
O objetivo deste estudo foi a formulação de tecnologias que permitem a transdução de gene bem sucedido na primária natural killer (NK) as células. O dextran-mediada Lentivirus transdução de humanos ou rato primário NK células os resultados, em maior eficiência de expressão do gene. Este método de transdução gene vastamente irá melhorar a manipulação genética de células NK.
Abstract
A transdução eficiente de genes específicos nas células de (NK) assassinos naturais tem sido um grande desafio. Transductions sucesso são fundamentais para definir o papel do gene de interesse no desenvolvimento, diferenciação e função das células NK. Avanços recentes relacionados com os receptores de antígeno Quimérico (carros) em imunoterapia acentuam a necessidade de um método eficiente entregar genes exógenos para linfócitos efetores. As eficiências de transductions gene Lentivirus mediada em humanos primários ou rato NK células permanecem significativamente mais baixas, que é dos principais fatores limitante. Avanços recentes usando polímeros catiônicos, tais como polybrene, mostram uma eficiência de transdução melhorada de gene em células T. No entanto, estes produtos não conseguiram melhorar as eficiências de transdução das células NK. Este trabalho mostra o dextrano, um polissacárido ramificado glucan, melhora significativamente a eficiência de transdução de humanos e células NK primárias de rato. Esta metodologia de transdução altamente reprodutível fornece uma ferramenta competente para transducing humana primária as células NK, que podem melhorar muito clínico gene entrega aplicativos e, portanto, NK baseada em célula imunoterapia.
Introduction
Assassino naturais (NK) células são a população linfocitária principal do sistema imune inato1. Células NK funcionam como os defensores da primeira linha da resposta imune do hospedeiro contra infecções e tumores de3,2,4. Células NK também desempenham um papel central no desenvolvimento da tolerância através da secreção de potentes citocinas e quimiocinas5. Devido à sua potente capacidade para atacar e eliminar as células do tumor, vários ensaios clínicos estão sendo realizados para avaliar derivados de doador humanas células NK como uma adotivos imunoterapia para o câncer6,7. Em contraste com as células T, a biologia do desenvolvimento das células NK ainda tem que ser bem caracterizadas8. Esta falta de conhecimento é parcialmente devido à ausência de técnicas eficientes que entregam os genes de interesse para mouse ou células NK primárias humanas. Por estas razões, a maioria das células NK estudos foram conduzidos em linhas de células, em vez de células primárias. Portanto, a necessidade de um protocolo confiável e eficiente para transduce primárias células NK com genes de interesse é crucial.
O objetivo geral deste estudo foi a formulação de um método consistente e confiável, pelo qual células NK primárias de humano ou murino poderiam ser transfectadas com lenti – ou retrovírus.
Foram efectuados estudos anteriores que tentou resolver este problema, em grande parte, usando a transformação transitória das principais células NK. Isso inclui o plasmídeo transfeccao9,10, vírus de Epstein – Barr (EBV) /11de vetor retroviral híbrido, vaccinia vectores12,13e de quimérico vetores adenovírus Ad5/F3514. Apesar da modesta eficiência destas técnicas, a natureza transitória de transdução torna inadequados para a utilização a longo prazo das células NK geneticamente modificadas. Alguns estudos recentes têm utilizado vetores retrovirais para transduce células NK, que requerem vários ciclos de infecção para alcançar um nível aceitável de gene expressão11,15. Em contraste com vetores retrovirais, vetores de Lentivirus podem usar maquinaria de importação nuclear da célula hospedeira para translocar o complexo pré-integração viral para o núcleo. Este é um importante fator limitante na replicação do vírus em células não-divisão, que incluem primárias células NK.
Interações entre diferentes receptores de superfície e partículas virais permitam absorção viral dentro da célula. Os compromissos iniciais entre as proteínas do envelope viral e seus receptores cognatos anfitrião podem ser limitados devido as cargas negativas potenciais existentes entre estes dois. A lógica por trás de muitas técnicas de transdução é que a adição de polímeros catiônicos, como polybrene (Pb), sulfato de protamina (PS) ou dextrano, poderia dar uma carga positiva para os receptores de superfície e, assim, aumentar a ligação do envelope viral proteínas. Isto aumentará a eficiência de fusão e a absorção de partículas virais em células16. Embora tem sido relatado que Pb ou PS pode melhorar a transferência de genes em células de T17, sua aplicação não teve qualquer efeito na eficiência transdução da primárias células NK. Além disso, uma análise comparativa entre estes reagentes usando primárias células NK não foi realizada. Neste estudo, foram comparadas as eficiências de transdução dos três Polímeros Catiônicos. Os resultados mostram que, entre estes três polímeros catiônicos, apenas dextran aumenta significativamente eficiente transdução viral em rato e em células NK primárias humanas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudo demonstra que o uso de dextran como um agente de polímero catiônico aprimora a eficiência de Lentivirus transdução de murino e humanas primária as células NK. Além disso, outros agentes catiônicos, como Pb ou PS, não tem nenhum efeito discernível sobre a entrega de vetores virais em células primárias humanas de NK. Anteriormente, foi demonstrado que o Pb pode aumentar transdução de gene humano de células T17. Estes resultados, no entanto, sugerem que Pb nem PS têm uma …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Lucia Sammarco e Lemonade Stand do seu Lulu para inspiração, motivação e apoio. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH R01 AI102893 e ICN R01 CA179363 (S.M.); NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); o Alex Lemonade Stand Foundation (S.M.); o programa HRHM do fundo MACC (S.M.; S.R.; MAGALHAES); Fundação da família de Nicholas (S.M.); a família de Gardetto (S.M.); os estudiosos de Hyundai Program (M.S.T.); Hyundai esperança sobre rodas (S.R.); o fundo do MACC (M.S.T. e S.M.); Instituto das crianças de pesquisa, MCW (S.R.); e o prêmio de Kathy Duffey Fogerty (M.J.R.).
Materials
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
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