Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells
Summary
We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.
Abstract
El tracto reproductivo (FRT) del sistema inmune de la mucosa femenina sirve como la primera línea de defensa. Un mejor conocimiento de la mucosa genital tanto, es esencial para la comprensión de la patogenicidad de diferentes patógenos, incluyendo el VIH. Gamma delta células (GD) T son el prototipo de células T "no convencionales" y representan un grupo relativamente pequeño subconjunto de células T definidas por su expresión de receptores de células T (TCR) heterodiméricas compuestas de cadenas gamma y delta. Esto los diferencia de las células T clásicos y mucho mejor conocidos CD4 + helper y células T citotóxicas CD8 + que están definidas por los TCR alfa-beta. GD células T a menudo muestran la localización específica de tejido y se enriquecen en el epitelio. células T GD orquestan la respuesta inmune en la inflamación, la vigilancia de tumores, enfermedades infecciosas, y la autoinmunidad.
A continuación, presentamos un método para aislar y analizar los linfocitos intraepiteliales endocervicales humanos GD T reproducible. nos hacinco muestras endocervicales cytobrush utilizados de mujeres que participan en el Estudio de la Infección por VIH Interinstitucional de la Mujer (WIHS). El conocimiento acerca de GD células T interacciones durante las condiciones en las que hay un insulto a la mucosa vaginal se podría aplicar a cualquier estudio clínico en el que se dirige la vulnerabilidad de la mucosa, incluyendo el desarrollo de la adición microbicides.In vaginal, el conocimiento de las respuestas de células de la mucosa GD T tiene potencial para la aplicación de la terapia inmune basada en células T GD en el tratamiento de enfermedades infecciosas.
Introduction
Desarrollamos metodología de la utilización de muestras de cepillo endocervical para evaluar las células T intraepiteliales GD. El canal cervical está recubierto por una sola capa de epitelio columnar. Linfocitos intraepiteliales representan linfocitos de primera línea que residen dentro de la capa epitelial que rápidamente pueden iniciar la respuesta inmune al encontrarse con microbios patógenos 7, 8. La comprensión de los eventos inmunológicos del compartimiento intraepitelial endocervical es importante para el diseño de estrategias eficaces para prevenir las infecciones, incluido el VIH.
Nuestro método se puede aplicar para muestras endocervicales humanas recién recogidos, así como células endocervicales congelados para explorar aún más el papel de las células T GD intraepiteliales en mujeres con infección por VIH o en riesgo de infección por el VIH. El principal objetivo de este protocolo es descubrir nuevos eventos inmunológicos en el compartimiento intraepitelial endocervical y para evaluatlas respuestas de células T e GD como un marcador de la vulnerabilidad de la mucosa en mujeres con infección por VIH.
Las lagunas en el conocimiento en torno a la inmunidad FGT se deben en parte a la dificultad en la recolección y procesamiento de muestras de mucosa con éxito. Por otra parte, el complejo de la heterogeneidad de las células inmunológicas de las mucosas, y su interconexión con otros, son los principales retos para la identificación de medidas clínicamente relevantes que reflejan el estado y la capacidad del sistema inmunológico. Hemos desarrollado un método para obtener células T intraepiteliales GD altamente purificadas que pueden ser analizados utilizando tecnologías altamente multiplexados, unicelulares que pueden ser críticos para la identificación de los mecanismos subyacentes de la inmunidad FRT más.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evaluación de la vulnerabilidad de la mucosa del tracto genital inferior femenino es un componente esencial de los estudios clínicos que abordaron riesgo de adquisición y transmisión del VIH. Típicamente FGT vulnerabilidad a la infección del VIH se evalúa midiendo moduladores inmunes solubles en las secreciones genitales (citoquinas, quimioquinas y péptidos antimicrobianos) 12, 13. Sin embargo, estos biomarcadores son sólo indicativos de inflamación va…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los participantes en el estudio Miami WIHS por su disposición a participar en este trabajo. Los datos en este manuscrito fueron recogidos por el Estudio Interinstitucional VIH en Mujeres Miami (WIHS). Los contenidos de esta publicación son de la exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas y el Estudio de la Infección Interagencial del VIH de la Mujer (WIHS) [beca número U01 AI103397], Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud [número de concesión P30AI073961], Centro Nacional para el Avance Ciencias de transferencia y el Instituto Nacional de Salud para Minorías y disparidades de Salud, Instituto Nacional de Salud [número de concesión UL1TR000460 y 1KL2TR000461], y el Instituto Nacional de Salud infantil y Desarrollo humano, Instituto Nacional de Salud [número de concesión K23HD074489].
Materials
| Cytobrush Plus GT | (CareFusion, San Diego, CA, USA | ||
| IMDM,Iscove's Modified Dulbecco's Medium | ThermoFisher Scientific | 12440061 | |
| Beckman Coulter automated cell counter (The Vi-CELL Series Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter | 496178 | |
| DMSO, Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | |
| FBS, Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Gibco | 26140-079 | |
| PBS | Invitrogen, Gibco | 10010023 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A-9647 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies, | L349S9 | |
| 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich | Sigma Aldrich | D6148 | |
| Fortessa flow cytometer | Becton Dickinson | ||
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) | Life Technologies | A10346 | |
| anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit | Milteny Miltenyi Biotec Inc. | 130-050-701 | |
| MS column | 103-042-201 | ||
| MACS separator | 4124 |
References
- Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
- Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
- Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
- Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
- Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687 (2014).
- Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
- Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
- Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
- Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045 (2016).
- Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
- Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
- Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675 (2014).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).
