זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית
Summary
Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.
Abstract
Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.
Introduction
תאים באורגניזמים רבים-תאיים יש הרבה תכונות בודדות שעשויה להיות או ייחודי עבור תא מסוים או לפחות שייכות לקבוצות ייחודיות של תאים. גם תאים משובטים בתרבית להראות מאפיינים אישיים כפי שמעידים המורפולוגיה המגוונת שלהם. כמו כן, האינדיבידואליות של תא משתקפת המוצרים שהיא מפרישה. במקרה של זיהום ויראלי, חלקיקים נגיפיים יכולים לשאת חלבונים מהתאיים שיצר אותם. לדוגמא, ל- HIV רבי חלבוני תא מארח מוטבעי המעטפת הנגיפית וירוסים המופקים על ידי תאים שונים עשויים לשאת חלבונים האופייניים אלה 1, 2 או "חתימות תא".
גם בלי זיהום, תאים לשחרר לתוך שלפוחית תאיים הקטנה המקיפה תקשורת (EVS). Biogenesis של שלפוחית אלה והמבנה שלהם במקרים רבים דומה לזו של וירוסים, במיוחד רטרווירוסים. בשנים האחרונות זה הפך להיות ברורמכוניות חשמליות כי, אשר נחשבו בתחילה להיות "אבק טסיות" 3, מהוות מערכת פיזיולוגית חשובה של תקשורת בין תאים. יחד עם שתי מערכות אחרות של תקשורת בין תאית, כלומר אינטראקציות מגע תאי תאים ומולקולות מסיסות שוחררו, EVS לתאם פיזיולוגיה נורמלית משתנית שונות פתולוגיות 4, 5 כולל זיהומים נגיפיים 6, 7.
למרות ששני חלקיקים נגיפיים שוחרר שלפוחית תאיים הם מאוד מגוונים, הם מאופיינים בעיקר על ידי ניתוח בתפזורת שבו המאפיינים האישיים שלהם הם איבדו. שיטה דומה cytometry זרימה, אשר פנוטיפים תאים בהתבסס על אנטיגנים השונים על פני השטח שלהם, יש צורך לאפיין חלקיקים נגיפיים פרט ויראלי דמוי. למרבה הצער, EVS או virions קטן לא ניתן לנתח באמצעות ציטומגלווירוס זרימת תקןשיטות מטריה כי הם קטנים מדי כדי ליצור את האות-פיזור אור על אשר רוב cytometers להסתמך מפעילה. כדי לעקוף מגבלה זו, קרינה ניתן ליישם מפעילה. עם זאת, אם כלי רכב חשמליים או virions מגואלות נוגדני ניאון קשה להבדיל ביניהם לבין נוגדנים בחינם אגרגטים שלהם בגלל הקרינה שלהם הדומה וגדלים דומים.
לאחרונה, פיתחנו שיטה תפוקה גבוהה המבוסס על ננוטכנולוגיה המאפשרת אפיון של אנטיגנים על חלקיקים קטנים בודדים באמצעות cytometers תזרים קבוע 8, 9. אנו מעסיקים MNPs לחלקיקי immunocapture של עניין, כפי שתואר על ידי קבוצות אחרות ליישומים מגוונים 10, 11, 12, 13; עם זאת, השיטה החדשנית שלנו מאפשרת בתמורה ללכידתו של במפרט פרטמטרות FIC ואחריו phenotyping של שנתפסו חלקיקים אלה על ידי cytometry זרימה באמצעות קרינה מפעילה ולא פיזור אור, בלי התערבות נוגדנים צפו חינם. לשיטה זו יש יישומים רחבים וניתן להשתמש בו כדי לאפיין את הרכב אנטיגני של כל חלקיק קטן viral- והלא-ויראלי שנוצר על ידי תאי in vivo ו במבחנה ספקה את הזמינות של נוגדני ניאון ספציפיים נגד אנטיגנים פני שטח. כבר יש לנו ליישם את הטכניקה הזו כדי ללמוד כמה בעיות ביולוגיות.
בפרט, אנו הערכנו את חלוקת תא סמנים מארחים חלקיקי HIV-1 אדם 9, חקרנו את ההבשלה של וירוסים דנגי פרט (DENV) בהתבסס על ניתוח של חלבוני פני השטח שלהם 14 וחקרתי כלי רכב חשמליים משתחררים לתוך מחזור הדם של מתנדבים בריאים וחולה עם תסמונת כלילית חריפה (ACS). למרות מבוסס על עיקרון דומה,יישום של הטכניקה החדשה חייב פיתוח פרוטוקולים ספציפיים המתוארות להלן.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytometers תזרים קונבנציונלי להישאר הכלי העיקרי לניתוח תאים בהתבסס על מאפיינים פיזיים וכימיים שלהם ברמת הפרט 18. העקרונות הבסיסיים של זרימת cytometry לא שונו מאז הפיתוח שלה: תא שעובר דרך קרן הליזר ומפזר אור מהווה אירוע שמפעיל את ההקלטה של ספקטרום הניאון הנפלטת נוגדני ניאון כלוא. קטנים חלקיקים מתחת ל -300 ננומטר לא ניתן לאתר על ידי פיזור צד של cytometer כפי שהן מפזרות יותר אור תחת זוויות גדולות שבו רוב לזרום cytometer לא אוספים אור 18. הטכניקה המתוארת כאן, מאפשרת זיהוי והניתוח של אנטיגנים מרובים על וירוסים או מכוניות חשמליות אישיים רבים על ידי cytometers תזרים הקונבנציונלי עם קרינה מפעיל.
השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול הם הצימוד של נוגדני MNPs. הניסויים שלנו היו perforMed באמצעות 15 חלקיקי תחמוצת ברזל ננומטר עם חומצה קרבוקסילית כקבוצה תגובתי כפי שתואר לעיל 9. לדברי היצרן, כל 15 MNP ננומטר יכול להיקשר לכל היותר 20 נוגדנים; אנו לאגד כ 10 נוגדנים לכל 15 ננומטר MNP. הערכה זו מבוססת על כמות הנוגדנים לפני ואחרי צימוד ומספר חרוזים / מ"ל, כפי שהיא נמדדת על ידי אפיון nanoparticle ומכשור אומדת. באופן עקרוני, צימוד עלול לגרום צבירה של חלקיקים ואף אינו רצוי. כדי לבדוק צבירה זה לא קורית עם הפרוטוקול שלנו, אנו מאמתים את זה עם אפיון nanoparticle ומכשור אומד. מכשיר זה מודד את הקוטר הידרודינמית עבור החלקיקים, הכולל את שכבות ציפוי נוגדנים ולא ליבת 15 ננומטר בלבד. מצאנו כי הרוב המכריע של חרוזים בשילוב נמצאים בשיאם יחיד (ממוצע השיא ב 64.7 ± 4.2 ננומטר עם 90% מכלל האירועים להלן 73 ± 7.3 ננומטר). הערבוב של שיתוף Ab-MNPmplexes עם virions או מכוניות חשמליות בפרופורציה הנכונה חשוב, כך MNPs נמצא הריכוז של כמה הזמנות גבוהות יותר מאשר כלי הרכב חשמלי / virions. דבר זה הוא קריטי על מנת להבטיח כי יחיד כלי רכב חשמליים / virions מנותחים. הימנע צירופי מקרים של אירועים על ידי הפעלת cytometer ב זרימה נמוכה. ודא כדי לעורר את הרכישה על קרינה ולהשתמש שולטת נפח למדוד את הריכוז של הגופים שנתפסו.
עם זאת, MNPs יכול לצבור כלי רכב חשמליים או virions ידי crosslinking או על ידי קשירה של שניים או יותר virions לאותו ננו-חלקיקים. כדי לבדוק זאת, מבחן עבור צבירה כמתואר באיור 4 צריך להתבצע. אפילו ברמת הפרט נתפס virions או מכוניות חשמליות רשאי להיכנס קרן הלייזר בו זמנית של זרימת cytometer. בכך ייווצר-חיוביות כוזבות עבור שני אנטיגנים שונים. כדי להימנע מכך, cytometer הזרימה צריך להיות מוגדר כמתואר וההכנות צריכות להיות מדוללות. אפשר לבדוק אם זה מקרה שקורה באמצעות אותוהאסטרטגיה כמתואר לנקודה הקודמת. כמו כן, חוסר מקרה יכול להיות מאומת על ידי ניתוח דילולים סדרתי של הכנה להוכיח כי מספר האירועים פוחתת באופן ליניארי עם דילול בעוד עוצמת הקרינה הממוצעת של אנטיגן fluorescently מוכתם נשאר קבוע בכל דילולים (איור 5). בעיה נוספת היא שמעט מדי וירוסים / כלי רכב חשמליים יכולים להיות בשבי. זה יכול להיות בגלל המחסור האמיתי של וירוסים / כלי רכב חשמליים שנושאים אנטיגנים שדרכו הם נלכדים על ידי ספציפי MNPs. לחלופין, את היעילות של לכידה נמוכה בשל סיבות שונות (למשל, צימוד יעיל של נוגדני MNPs, הסטייה היחסית של MNPs כדי virions / כלי רכב חשמליים שפותח עבור פרוטוקול זה, וכו '). כדי למנוע את האפשרות האחרונה, את היעילות של לכידה יש להעריך במיוחד. בדרך כלל, את היעילות צריכה להיות בערך 90% כמו באיור 6.
נוגדנים שונים יכולים להתערב בשלהפרעה סטרית אחד עם השני או עם הנוגדנים מצמידים את MNPs. כדי לוודא שזה לא קרה פרוטוקול ללכוד הפוך חייב להיבדק (כמתואר בסעיף 7. בקצרה, virions או מכוניות חשמליות צריכים להיות מוכתם ראשון עם ABS איתור פלורסנט ואז נתפס על ידי מתחמי Ab-MNP עם פרדה עוקבת משב"א שתרחף על עמודות מגנטיות.
יש זרימה virometry יתרונות משמעותיים ביחס לשיטות הקיימות של ניתוח הרכב אנטיגני של virions או מכוניות חשמליות. בשיטות ביוכימיות שיגרתיות לדווח על הנוכחות הכללית של חלבונים מסוימים בהכנות, אבל מספקות שום מידע על ההטרוגניות של virions או מכוניות חשמליות. זה כולל immunocapture של virions או מכוניות חשמליות על חלקיקים גדולים זמינים מסחרית. חלקיקים כאלה הם בדרך כלל של כמה מיקרונים בקוטר וכל אחד מהם יכול ללכוד מאות או אלפי virions או מכוניות חשמליות. לכן, כל ממוצעים לניתוח שלאחר מכן את המאפיינים של virions / כלי רכב חשמלייםנתפס על ידי חלקיק אחד. לעומת זאת, תזרים virometry משתמשת MNPs של 10-15 ננומטר בקוטר עם פרוטוקול המתואר לפחות 90% של אירועים מייצגים virion בודד או EV יחיד.
המגבלה העיקרית היא כי אוכלוסיית virions או מכוניות חשמליות בהכנה אולי לא להיות מנותחת, אבל רק אלה נלכדים. לכן, הבחירה של אנטיגן שדרכו virions או מכוניות חשמליות נלכדים הופכת להיות קריטית. כמו כן, תזרים בניגוד cytometry מספר אנטיגנים שונים (מספר נוגדני ניאון נגד אנטיגנים שונים) הוא מוגבל על ידי המשטח הקטן של virions או מכוניות חשמליות. לבסוף, נוגדנים שונים עשויים sterically להפריע זה לזה שוב בשל קטן (לעומת התאים) משטח.
הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מותאם עבור ניתוח של כל וירוס או EV ממקור כלשהו, ובלבד נוגדנים ספציפיים שבאמצעותם הם יכולים ליפול בפח זמינים. ניתוח של אנטיגנים על יתר virions פרטחוקרים של להתייחס בפתוגנזה של שברים שונים של אוכלוסיות ויראלי. יתר על כן, זיהוי של כלי רכב חשמליים פרט בפלזמה עשוי לאפשר להתחקות אחר מקורו של EVS תאים מסוימים ולדווח על תנאים נורמלים או פתולוגי של תאים אלה ואת האיברים שבם הם מתגוררים.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.
Materials
| Materials | |||
| Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits | Ocean Nanotech | ICK-15-005 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | Millipore | UFC810024 | |
| 5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap | Falcon | 352002 | |
| DEPC treated water | Quality Biological | 351-068-131 | |
| SuperMAG-01 magnetic separator | Ocean Nanotech | SuperMAG-01 | |
| Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | Z25055 | |
| Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k | Pall Corp | OD100C34 | |
| EDTA 0.5M | Corning Cellgro | 46-034-CI | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A9576-50ML | |
| PBS | Gibco | 10010-23 | |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | EMS | 15710 | |
| 123count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CytoCount beads | Dako | S2366 | |
| AccuCheck count beads | Invitrogen | PCB100 | |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) | BD Bioscience | 642412 | |
| Vybrant DiI Cell-Labeling Solution | Thermo Fisher Scientific | V22885 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| µMACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-701 | |
| OctoMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | none | |
| NanoSight NS300 | Malvern | none | |
| BD LSRII flow cytometer | BD Bioscience | none | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Flowjo software | Flowjo | ||
| BD FACSDiva software | BD |
References
- Tremblay, M. J., Fortin, J. F., Cantin, R. The acquisition of host-encoded proteins by nascent HIV-1. Immunol Today. 19 (8), 346-351 (1998).
- Santos, S., Obukhov, Y., Nekhai, S., Bukrinsky, M., Iordanskiy, S. Virus-producing cells determine the host protein profiles of HIV-1 virion cores. Retrovirology. 9, 65 (2012).
- Wolf, P. The nature and significance of platelet products in human plasma. Br J Haematol. 13 (3), 269-288 (1967).
- Piccin, A., Murphy, W. G., Smith, O. P. Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications. Blood Rev. 21 (3), 157-171 (2007).
- Bernal-Mizrachi, L., et al. High levels of circulating endothelial microparticles in patients with acute coronary syndromes. Am Heart J. 145 (6), 962-970 (2003).
- Rozmyslowicz, T., et al. Platelet- and megakaryocyte-derived microparticles transfer CXCR4 receptor to CXCR4-null cells and make them susceptible to infection by X4-HIV. Aids. 17 (1), 33-42 (2003).
- Bhattarai, N., et al. GB virus C particles inhibit T cell activation via envelope E2 protein-mediated inhibition of TCR signaling. J Immunol. 190 (12), 6351-6359 (2013).
- Arakelyan, A., Ivanova, O., Vasilieva, E., Grivel, J. C., Margolis, L. Antigenic composition of single nano-sized extracellular blood vesicles. Nanomedicine. 11 (3), 489-498 (2015).
- Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Margolis, L., Grivel, J. C. Nanoparticle-based flow virometry for the analysis of individual virions. J Clin Invest. 123 (9), 3716-3727 (2013).
- Yang, H., Liang, W., He, N., Deng, Y., Li, Z. Chemiluminescent labels released from long spacer arm-functionalized magnetic particles: a novel strategy for ultrasensitive and highly selective detection of pathogen infections. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (1), 774-781 (2015).
- Tang, Y., et al. Highly sensitive and rapid detection of Pseudomonas aeruginosa based on magnetic enrichment and magnetic separation. Theranostics. 3 (2), 85-92 (2013).
- Borlido, L., Azevedo, A. M., Roque, A. C., Aires-Barros, M. R. Magnetic separations in biotechnology. Biotechnol Adv. 31 (8), 1374-1385 (2013).
- Xi, Z., et al. Selection of HBsAg-Specific DNA Aptamers Based on Carboxylated Magnetic Nanoparticles and Their Application in the Rapid and Simple Detection of Hepatitis B Virus Infection. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (21), 11215-11223 (2015).
- Zicari, S., et al. Evaluation of the maturation of individual Dengue virions with flow virometry. Virology. 488, 20-27 (2016).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nat Commun. 6, 7029 (2015).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J Cell Biol. 159 (3), 441-452 (2002).
- Morcock, D. R., et al. Elimination of retroviral infectivity by N-ethylmaleimide with preservation of functional envelope glycoproteins. J Virol. 79 (3), 1533-1542 (2005).
- Shapiro, H. M. . Practical Flow Cytometry. , 101-223 (2005).
