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Immunologie et infection

Débit Virometry pour l'analyse antigénique Spectra de virions et extracellulaires Vésicules

Published: January 25, 2017
doi:
10.3791/55020
, , , , ,
1Section on Intercellular Interactions,Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, 2Laboratory of Atherothrombosis, Cardiology Department,Moscow State University of Medicine and Dentistry, 3Sidra Medical and Research Center

Summary

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

Abstract

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Introduction

Les cellules dans les organismes multicellulaires ont de nombreuses caractéristiques individuelles qui peuvent être soit unique pour une cellule particulière ou tout au moins appartiennent à des groupes particuliers de cellules. Même les cellules clonées en culture présentent des caractéristiques individuelles comme le montre leur morphologie diversifiée. En outre, l'individualité d'une cellule se reflète dans les produits qu'elle sécrète. Dans le cas d'une infection virale, les particules virales peuvent transporter des protéines à partir des cellules qui les produisent. Par exemple, le VIH pour de nombreuses protéines de la cellule hôte sont noyées dans l'enveloppe virale et les virus qui sont générés par des cellules différentes peuvent porter ces protéines caractéristiques 1, 2 ou "signatures" des cellules.

Même sans infection, les cellules libèrent dans les médias autour de petites vésicules extracellulaires (VE). Biogenèse de ces vésicules et leur structure dans de nombreux cas ressemble à celle des virus, en particulier les rétrovirus. Ces dernières années, il est devenu clairque les véhicules électriques, qui ont été initialement considérées comme " la poussière des plaquettes" 3, constituent un système physiologique important de la communication cellulaire. Avec deux autres systèmes de communication intercellulaire, à savoir les interactions de contact cellule-cellule et des molécules solubles libérés, les véhicules électriques coordonnent la physiologie normale et sont modifiés dans diverses pathologies 4, 5 y compris les infections virales 6, 7.

Bien que les deux particules virales libérées et des vésicules extracellulaires sont très diverses, elles se caractérisent principalement par une analyse en vrac dans lequel leurs caractéristiques individuelles sont perdues. Un procédé apparenté à la cytométrie de flux, ce qui phénotypes de cellules en fonction de leurs différents antigènes de surface, est nécessaire pour caractériser les particules virales et les pseudo-virales individuelles. Malheureusement, les véhicules électriques ou les petits virions ne peuvent pas être analysées à l'aide de cyto débit standardméthodes métrie parce qu'ils sont trop petits pour générer le signal de diffusion de lumière sur lequel la plupart des cytomètres comptent pour le déclenchement. Afin de contourner cette limitation, la fluorescence de déclenchement peut être appliqué. Cependant, si les véhicules électriques ou virions sont colorées avec des anticorps fluorescents, il est difficile de les distinguer des anticorps libres et leurs agrégats à cause de leur fluorescence similaire et des tailles comparables.

Récemment, nous avons développé une méthode à haut débit à base de nanotechnologie qui permet la caractérisation des antigènes sur les petites particules individuelles en utilisant des cytomètres de flux régulier 8, 9. Nous employons MNP à particules immunocapture d'intérêt, comme cela a été décrit par d' autres groupes pour diverses applications 10, 11, 12, 13; cependant, notre nouvelle technique permet la capture de spécificité individuellecibles fiques suivies par phénotypage de ces particules capturées par cytométrie de flux par fluorescence déclenchement plutôt que de diffusion de la lumière, sans interférence des anticorps flottant librement. Cette méthode a de larges applications et peut être utilisée pour caractériser la composition antigénique de toute petite particule viral- et non viral produit par des cellules in vivo et in vitro à condition que la disponibilité d'anticorps fluorescents spécifiques dirigés contre des antigènes de surface. Nous avons déjà appliqué cette technique pour étudier plusieurs problèmes biologiques.

En particulier, nous avons évalué la distribution des marqueurs de cellules hôtes sur individuels VIH-1 particules 9, nous avons étudié la maturation des différents virus de la dengue (DENV) basées sur l' analyse de leurs protéines de surface 14 et étudié les véhicules électriques libérés dans la circulation sanguine des volontaires sains et des patients avec un syndrome coronarien aigu (SCA). Bien que basé sur un principe similaire, leapplication de la nouvelle technique nécessaire au développement de protocoles spécifiques qui sont décrits ci-dessous.

Protocol

1. Couplage des nanoparticules magnétiques (MNP) Utilisez la procédure de couplage commercial et réactifs à quelques MNP avec des anticorps (Abs) (typiquement 1 mg). Nanoparticules d'oxyde de fer avec de l' acide carboxylique des groupes comme réactifs sont utilisés. Si les anticorps sont dans un volume supérieur à 0,5 ml, concentré en utilisant un concentrateur 100K. Spin à 2.000 xg pendant 3-5 min. A la fin de la procédure, après addition de 10 ul du tampon de trempe, le transfert MNP dans un tube de 12 mm x 75 mm et ajouter un tampon / 3 ml de stockage de lavage. Placer le tube dans le trou central d'un séparateur magnétique et laisser une nuit à 4 ° C. Vérifier que les MNP ont tous collectés sur le côté du tube, et ensuite soigneusement toutes pipettes à aspiration de liquide. Ajouter 3 ml de tampon de lavage / de stockage frais, et replacer dans l'aimant. Après plusieurs heures, vérifiez si MNP sont collectées sur le côté du tube, puis pipeter le liquide. Utilisez 2 ml de tampon de lavage / de stockageresuspendre le MNP et stocker à 4 ° C. Vérifiez que Abs sont couplées à MNP en les étiquetant avec un fragment d'anticorps Fab fluorescent approprié (par exemple de chèvre anti-souris si l' aide d' un anticorps monoclonal de souris Ab pour la capture comme décrit dans la section 2) et exécuté sur un cytomètre de flux. 2. Étiquetage des anticorps couplés à MNP Combiner 60 ul (3,9 x 10 12 particules) de MNP (par condition) et 5 ul (d ' une / ml d'une solution commerciale à 200 pg) a marqué les fragments Fab, spécifiques de l'isotype de la capture Ab dans un tube de 1,5 ml. Incuber à température ambiante (TA) pendant 30 minutes avec une agitation continue. Mouillez un concentrateur 100K avec 300 pi de tampon phosphate salin (PBS) et de spin dans une microcentrifugeuse à 1500 xg pendant 5 min. Purifier complexes marqués sur 100K colonne. Spin le mélange de l'étape 2.2 dans une microcentrifugeuse à 1500 xg pendant 5 min, laver avec 200 ul de PBS, et récupérer dans levolume initial. 3. Utilisation de Étiqueté Ab-MNP Complexes pour capturer les particules d'intérêt (virus ou véhicules électriques) Incuber MNP 60 pi pré-marquée (3,9 x 10 12 particules) avec le VIH (60 pi) ou de la préparation de EV (100 pi). Préparer les préparations EV en utilisant diverses méthodes. Ici, purifier les véhicules électriques sur des gradients de saccharose, les recueillir du plasma pauvre en plaquettes en utilisant des réactifs exosomes de précipitation ou d'isoler directement à partir de plasma 8. NOTE: Les rapports optimaux doivent être déterminés pour chaque expérience et dépendent de la concentration de virus / EV dans la préparation. Fraction MNP-Ab devrait être ~ 10 6 en excès par rapport à la concentration de la fraction virus / EV. Incuber 40 min à 37 ° C avec mélange doux pour les virus, soit 1 heure à 4 ° C pour les véhicules électriques. Ajouter 2,5% IgG de souris / IgG humaine pour bloquer la liaison Fc, doucement vortex, incuber 3-5 min à température ambiante. Ajouter concentrations fabricant recommandées ou titrés de chaque Abs de détection et incuber supplémentaire de 20 min à température ambiante. 4. Séparation des virions MNP-capturés (ou VE) de Unbound Anticorps Utilisation de colonnes magnétiques Préparer la colonne de séparation magnétique destiné à être utilisé en le plaçant dans un aimant de séparation. Pré-humecter la colonne avec 500 pi de tampon de lavage (2 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS). Laisser le tampon de lavage de circuler à travers la colonne. Ajouter les complexes MNP-virus / MNP-EV à la colonne et laisser tout le liquide de circuler à travers. Ajouter 500 pi de tampon de lavage à la colonne, permettant à l'ensemble du volume de passer à travers. Répéter le lavage avec un tampon de lavage 2 fois plus. Retirer la colonne de l'aimant et le lieu de 12 mm x 75 mm Tube pour la collecte des complexes MNP-virus / MNP-EV retenus. Laissez reposer la colonne dans le tube de l'aimant pendant 3 min. Ajouter 200 pi de PBS et laisserles perles coulent par gravité, ajouter un autre 200 pi de PBS, et fixer avec 200 ul paraformaldéhyde 4% après élution. NOTE: Le paraformaldéhyde est un cancérogène suspecté et doit être manipulé dans une hotte ventilée et des gants doivent être portés. Pour quantifier les virions uniques / véhicules électriques utilisent des paramètres volumétriques sur High Throughput Sampler (HTS) ou juste avant l'acquisition ajouter le flux bien mélangé cytométrie perles de comptage. 5. Analyse des virus MNP-capturés / véhicules électriques avec un cytomètre de flux Warm up cytomètre de flux pour 30 min. Exécuter perles de contrôle de la qualité. Régler le seuil sur la fluorescence soit MNP ou étiquetés virus / véhicules électriques. Utiliser 0,22 um filtrée PBS pour le seuil pour diminuer l'arrière-plan du «bruit». Régler le seuil en ajustant la tension de PMT au niveau où filtré PBS ne donne pas, ou très peu, des événements. échantillons Run sur bas. (Utilisez un filtre de 0,04 um en ligne supplémentaire pour le fluide de gaine placée en série derrière lafiltre standard de la gaine de 0,2 um pour éliminer plus faux événements). 6. Évaluation de l'efficacité de capture Capture de véhicules électriques marqués par fluorescence ou le VIH avec MNP-Abs comme décrit dans 3.1, 3.2. (Véhicules électriques peuvent être marquées soit avec un colorant membranaire ou par l'intermédiaire de leur cargaison 15; Le VIH peut être marqué par un colorant non codée par le gène 16 ou avec un colorant membranaire 12, 17). Préparer colonne de séparation magnétique tel que décrit au point (4.1 à 4.2). Ajouter les complexes MNP-virus / MNP-EV à la colonne et laisser tout le liquide de circuler à travers (écoulement à travers la fraction). Recueillir l'écoulement à travers la fraction en tube. Procéder à la fraction retenue sur la colonne comme décrit dans (4,4-4,5). procédure de capture répétée sur l'écoulement à travers la fraction de 6,3 avec séparation ultérieure (4.1-4.5). Analyser les fractions retenues de la première capture et la seconde capture en les exécutant sur cytomètre qui est situé sur le déclenchement sur marqueur fluorescent des véhicules électriques ou le VIH. Pour évaluer l'efficacité, de comparer le nombre d'événements dans les deux fractions. 7. Adaptation du Protocole pour les tâches spécifiques REMARQUE: Bien que le protocole peut être appliqué à l'analyse du VIH et les véhicules électriques tels que décrits ci-dessus, pour l'analyse des MENV les modifications suivantes devraient être introduites: Incuber les virions avec 1 uM de Dil dans l'obscurité pendant 30 min à température ambiante. Après une incubation de purifier le virus souillé par centrifugation dans un gradient de densité moyenne (10%, 20%, 25% et 35%) à 240 000 x g pendant 1,5 heures à 4 ° C sans freinage. Recueillir la fraction comprise entre 20% et 25% de gradient de densité moyenne des couches 14. Incuber Dil marqué DENV 1 x 10 7 (60 pi) avec des concentrations recommandée par le fabricant ou titrées de détection Ab , en présence de 2,5% d' IgG de souris pendant 20 minutes à la température ambiante. Incubate mélange avec 60 ul de pré-étiquetés (3,9 x 10 12 particules) MNP-capture des complexes Ab pendant 40 min à 37 ° C avec agitation douce. complexes résultants séparés de Abs non liés sur des colonnes magnétiques telles que décrites ci-dessus et d'analyser le flux cytomètre.

Representative Results

la capture sélective des antigènes cellulaires par virions VIH-1 Avec "virometry flow" il est maintenant possible de visualiser des antigènes cellulaires sur des particules virales individuelles. A titre d'exemple, nous nous sommes concentrés sur deux antigènes cellulaires portés par le VIH-1, LFA-1 et HLA-DR. Plus tôt ces deux antigènes ont été identifiés dans le VIH-1 des préparations analysées en vrac 1. Nous avons préparé MNP couplé à l' un des anticorps contre la protéine Env du VIH, VRC01 et capturé avec ces MNP virions VIH-1 (VIH-1 ou VIH-LAI.04 1 SF162 produites dans des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC)). En outre, nous avons coloré les virions avec 2G12, un autre anticorps anti-Env. Débit virometry a montré une forte hétérogénéité des virions VIH-1 en ce qui concerne la présence de LFA-1 et HLA-DR. En moyenne , 16,7 ± 2,0% (n = 6) et 8,6 ± 0,3% (n = 3) du HIV-1 virions LAI.04 portés LFA-1 et HLA-DR,respectivement. Seulement 4,8 ± 0,6% (n = 3) de l'ensemble des virions étaient positifs pour les deux antigènes. D'autre souche VIH-1, le VIH-1 SF162, ces antigènes sont présents sur 20,0 ± 4,4% (n = 6) et de 10,8 ± 1,3% (n = 6) de virions, respectivement, alors que les deux antigènes ont été de 6,5 ± 0,4% (figure 1). La répartition des protéines cellulaires était dépendante des cellules répliquées virus. Infectées par le VIH des cellules Jurkat virions antigéniquement différentes de celles produites par les PBMC infectées produites. Virions du VIH-1LAI 0,4 produites par les cellules Jurkat réalisées 1,6 ± 1,4% (n = 3) et de 1,6 ± 0,7% (n = 4) , LFA-1 et HLA-DR , respectivement. Pour le VIH-1 SF162 virions produits dans les cellules Jurkat, ces paramètres ont été de 7,2 ± 2,5% (n = 3) et 5,6 ± 2,7% (n = 4). Ainsi, le maquillage antigénique (au moins pour HLA-DR et LFA-1) est différent du VIH-1 LAI.04 produites par deux cellules différentestypes (p <0,02). Débit virometry appliquée à l'évaluation du virus de la dengue MENV maturation est associée à l'expression de la protéine prM sur les virions. Nous avons appliqué virometry de flux pour évaluer la fraction de DENV produite dans BHK-1 et dans les cellules LoVo constitue virus matures. Les virions ont été colorées avec un colorant lipidique Dil. L'analyse des virions individuelles capturées sur prM a révélé 48,2 ± 5,3% (n = 8) de DENVs. En revanche, 84,5 ± 3,4% (n = 4) de DENV produite dans des cellules LoVo réalisées prM. Le reste des virions, respectivement 51,8 ± 5,3% (n = 8) et de 15,5 ± 3,4% (n = 4) étaient négatifs prM (Figure 2). Ainsi, virometry de débit peut être utilisé pour distinguer DENV individu pleinement mature à partir immature (ou partiellement matures) virions DENV. vésicules extracellulaires libérés dans la circulation sanguine de la santéles bénévoles et les patients présentant un syndrome coronarien aigu (SCA) Afin d'étudier les différents sous-ensembles EV chez les patients avec ACS et des contrôles sains, nous avons capturé des véhicules électriques à partir de plasma pauvre en plaquettes (PPP) par fluorescence MNP couplés avec des anticorps contre CD31, CD41a ou CD63. Les véhicules électriques captés par les MNP-CD31 ont été colorées pour CD41a et CD63, CD41a véhicules électriques captés par-MNP ont été colorées pour CD31 et CD63, et les véhicules électriques captés par les MNP-CD63 ont été colorées pour CD31 , et CD41a (figure 3). La quantité de véhicules électriques capturés par CD31-MNP et positif pour un ou deux des anticorps de détection chez les patients ACS était 3359 [2328; 5.472] VE / pl par rapport à 1272 [714; 2157] VE / ul chez des volontaires sains (p = 0,001). Le montant total des véhicules électriques capturés par CD63 chez les patients ACS par rapport à des volontaires sains a été 3541 [1318; 5,173] VE / pi vs 806 [488; 2112] VE / ul (p = 0,007). Il y avait 4752 [3238; 7.173] VE / ul dans le plasma des patients avec ACS capturés par CD41a-MNP, alors que dans le plasma des volontaires en bonne santé ce nombre était significativement plus faible, 2623 [1,927; 4,188] VE / ul (p = 0,015). En général, nos résultats indiquent que, alors que les montants EV ont été la plupart du temps ont augmenté chez les patients ACS, l'ampleur de l'augmentation est différente dans les différentes sous-populations de véhicules électriques. Figure 1: l' incorporation sélective des antigènes cellulaires dans virions VIH-1 se répliquant dans différents types cellulaires. VIH (VIH-1 ou VIH-LAI.04 1 SF162) virions libérés par les PBMC ou des cellules de Jurkat ont été capturées avec VRC01-MNP et colorées avec un second anticorps anti-gp120 et 2G12 avec des anticorps spécifiques dirigés contre HLA-DR et LFA-1. Les préparations colorées ont été soumis à l'écoulement d'analyse pour HLA-DR (barres blanches) et LFA-1 (ba noirrs). Moyenne ± SEM de trois à six expériences 9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2: état Maturation des virions DENV. DENV produit en cellules BHK-21 (A, B) ou dans des cellules LoVo (C, D) ont été marquées avec le colorant lipidique DiI et, après ultracentrifugation dans un milieu à gradient de densité, colorées pour la protéine prM avec 2H2 anticorps (A, C) ou avec IgG2a isotype contrôle (B, D). Les virions marqués ont ensuite été capturés avec 3H5-1-MNP et soumis à une analyse 14 débit. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cettefigure. Figure 3: Analyse des véhicules électriques à partir de patients atteints de SCA et des contrôles sains. VÉ plasmatiques ont été capturés avec CD31-MNP, CD63-MNP ou CD41a-MNP et colorées avec des anticorps contre CD41a et CD63, contre CD31 et CD41a et contre CD31 et CD63, respectivement. VÉ capturés, colorées avec au moins l'un des Abs de détection, ont été visualisées et énumérés dans l'analyse des flux. Les données présentées sous forme de graphique point avec médiane et interquartile (IQR). symboles verts: des volontaires sains (témoins), les symboles bruns: ACS patients. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4: Evaluatisur de la fraction d'événements de flux qui représentent des virions individuels. (A) du VIH-1. Suspension des virions a été divisé en deux parties et colorées soit avec DiD (panneau de gauche) ou DiO (panneau du milieu). Après le mélange, la suspension, qui contenait deux virions différentiellement colorées, a été capturé avec VRC01-MNP et soumis à l' écoulement virometry (panneau de droite). Granulats (événements à double couleur) représentent moins de 10% du nombre total d'événements. (B – D) MENV. La suspension de virions Dil colorées a été dilué en série deux fois plus de 1: 2 à 1: 256 et a acquis HTS sur un cytomètre en flux (B). Dil-DENVs ont été marquées avec des anticorps 2H2 (C) ou DII-DENVs ont été capturés avec 3H5-1-MNP (D). Les préparations C et D ont ensuite été dilués en série deux fois plus de 1: 2 à 1: 256 et 14 acquises avec HTS. Virions ne semblent pas se regrouper puisque dans tous les cas,une corrélation linéaire entre le facteur de dilution et le nombre des événements. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5: Détection de particules uniques cytomètre en flux. Dil colorées suspension MENV été dilué en série deux fois plus de 1: 2 à 1: 2,048 et acquise à l'aide d'une HTS sur un cytomètre de flux. (A) Nombre de virus détectés en fonction du facteur de dilution. (B) Intensité médiane de fluorescence (MFI) de Dil étiquetés DENV 14. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <ialt = mg "Figure 6" src = "/ files / ftp_upload / 55020 / 55020fig6.jpg" /> Figure 6: Evaluation de la fraction de virions extracellulaires et des vésicules capturées avec MNP couplées à des anticorps spécifiques. Labellisées virions VIH-1 ou les véhicules électriques ont été capturés avec MNP couplés à des anticorps spécifiques et soumis à l'écoulement virometry. Après la séparation des colonnes magnétiques, l'écoulement (non retenu) fractions ont été analysées pour la présence de virions ou les véhicules électriques d'intérêt qui ont été manqué dans la première manche. (A) Labellisées virions VIH-1 bAL ont été capturés avec 2G12-MNP (panneau de gauche). La fraction accréditive a été repris et soumis à l' écoulement virometry (panneau de droite). Dans le premier cycle d'environ 95% des virions d'intérêt ont été capturés. (B) VÉ marquées ont été capturés avec anti-CD81 MNP et isolés sur des colonnes magnétiques (panneau de gauche). La fraction accréditives a été re-capturé et analysé (panneau de droite). En premierCycle environ 99% des vésicules d'intérêt ont été capturés 8. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Cytomètres classiques restent le principal outil d'analyse de cellules en fonction de leurs caractéristiques physiques et chimiques au niveau individuel 18. Les principes de base de cytométrie de flux n'a pas été modifié depuis son développement: une cellule qui passe à travers le faisceau laser et la lumière diffuse constitue un événement qui déclenche l'enregistrement des spectres de fluorescence émis par les anticorps fluorescents liés aux cellules. Les petites particules inférieures à 300 nm ne peuvent pas être détectés par la diffusion latérale d'un cytomètre car ils dispersent plus de lumière sous des angles plus grands au cours de laquelle plus de cytomètre de flux ne recueillent pas la lumière 18. La technique décrite ici, permet l'identification et l'analyse des antigènes multiples sur de nombreux virus ou des véhicules électriques individuels par cytomètres classiques par fluorescence de déclenchement.

Les étapes critiques dans le protocole sont le couplage des anticorps à MNP. Nos expériences ont été PERFORmed 15 nm en utilisant des nanoparticules d'oxyde de fer avec l'acide carboxylique en tant que groupe réactif tel que décrit précédemment 9. Selon le fabricant, chaque 15 nm MNP peut lier un maximum de 20 anticorps; on lie environ 10 anticorps par 15 nm MNP. Cette estimation est basée sur la quantité d'anticorps avant et après le couplage et le nombre de billes / ml telle que mesurée par la caractérisation des nanoparticules et de l'instrumentation de dimensionnement. En principe, le couplage peut provoquer l'agrégation des particules et est indésirable. Pour vérifier que l'agrégation ne se produit pas avec notre protocole, nous avons vérifié cela avec la caractérisation des nanoparticules et de l'instrumentation de dimensionnement. Cet instrument mesure le diamètre hydrodynamique des particules, qui comprend des couches de revêtement et d'anticorps, plutôt que le noyau 15 nm seulement. Nous avons constaté que la majorité des billes couplées sont situées à un seul pic (moyenne pic à 64,7 ± 4,2 nm avec 90% de tous les événements ci-dessous 73 ± 7,3 nm). Le mélange de Ab-MNP complexes avec virions ou les véhicules électriques dans la bonne proportion est importante pour que les MNP sont dans la concentration de plusieurs ordres plus élevés que VE / virions. Cela est essentiel pour veiller à ce que les véhicules électriques uniques / virions sont analysés. Évitez les coïncidences des événements en exécutant cytomètre à faible débit. Assurez-vous de déclencher l'acquisition sur la fluorescence et utiliser des contrôles volumétriques pour mesurer la concentration des entités capturées.

Cependant, MNP peut agréger les véhicules électriques ou virions par réticulation ou par la liaison de deux ou plusieurs des virions à la même nanoparticule. Pour vérifier cela, un test pour l' agrégation comme décrit à la figure 4 doit être effectuée. virions ou VÉ Même capturés individuellement peuvent entrer simultanément le faisceau laser de la cytométrie de flux. Cela créerait de faux-positivité pour deux antigènes différents. Pour éviter cela, le cytomètre de flux doit être réglé comme décrit et les préparatifs doivent être dilués. On peut vérifier si une coïncidence se produit en utilisant la mêmestratégie telle que décrite au point précédent. En outre, l'absence de coïncidence n'a pu être vérifiée par l' analyse des dilutions en série de la préparation et de prouver que le nombre d'événements diminue de manière linéaire avec la dilution tandis que l'intensité moyenne d'un antigène fluorescent teinté de fluorescence reste constante dans toutes les dilutions (figure 5). Un autre problème est que trop peu de virus / véhicules électriques peuvent être capturés. Cela peut être dû à la vraie rareté des virus / véhicules électriques qui transportent des antigènes par lesquels ils sont capturés par MNP spécifique. Alternativement, l'efficacité de la capture est faible en raison de diverses raisons (par exemple, le couplage inefficace des anticorps à MNP, écart par rapport aux ratios de MNP à virions / véhicules électriques développés pour ce protocole, etc.). Afin d'éviter cette dernière possibilité, l'efficacité de capture doit être spécifiquement évalué. En règle générale, l'efficacité doit être d' environ 90% , comme dans la figure 6.

Différents anticorps peuvent interférer en raison del'encombrement stérique entre eux ou avec des anticorps couplés à des MNP. Pour vérifier que cela ne se produise un protocole de capture inverse doit être testé (comme décrit dans la section 7. En bref, les virions ou les véhicules électriques doivent d'abord être teinté avec Abs de détection fluorescente, puis capturé par des complexes Ab-MNP avec séparation ultérieure de libre Abs flottant sur colonnes magnétiques.

Flux virometry présente des avantages significatifs par rapport aux méthodes d'analyse de la composition antigénique de virions ou les véhicules électriques existants. méthodes biochimiques de routine rapport sur la présence générale de protéines particulières dans les préparations, mais ne fournissent aucune information sur l'hétérogénéité des virions ou les véhicules électriques. Cela inclut immunocapture de virions ou les véhicules électriques sur de grandes particules disponibles dans le commerce. De telles particules sont typiquement de plusieurs microns de diamètre, et chacun d'eux peut capturer des centaines ou des milliers de virions ou des véhicules électriques. Par conséquent, toutes les moyennes d'analyse ultérieures les propriétés des virions / véhicules électriquescapturée par une particule. En revanche, virometry d'écoulement MNP utilise de 10 à 15 nm de diamètre et le protocole décrit au moins 90% des événements représentent un seul virion ou simple EV.

La principale limitation est que toute la population de virions ou les véhicules électriques dans la préparation pourrait ne pas être analysé, mais seulement ceux qui sont capturés. Ainsi, le choix de l'antigène à travers laquelle les virions ou les véhicules électriques sont capturés devient critique. En outre, contrairement à l'écoulement de cytométrie le nombre d'antigènes différents (le nombre d'anticorps fluorescents contre différents antigènes) est limitée par la faible surface des virions ou des véhicules électriques. Finalement, des anticorps différents peuvent stériquement interférer les uns avec les autres à nouveau en raison de la faible surface (par rapport aux cellules).

Le protocole actuel peut être adapté à l'analyse de tout virus ou EV de toute origine, à condition que les anticorps spécifiques à travers lesquels ils peuvent être capturés sont disponibles. Analyse des antigènes sur des virions individuels permiss les chercheurs pour traiter la pathogenèse de différentes fractions de populations virales. En outre, l'identification des véhicules électriques individuels dans le plasma peut permettre de retracer l'origine des véhicules électriques à des cellules particulières et de faire rapport sur les conditions normales ou pathologiques de ces cellules et les organes dans lesquels ils résident.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.

Materials

Materials
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits Ocean Nanotech ICK-15-005
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane Millipore UFC810024
5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap Falcon 352002
DEPC treated water Quality Biological  351-068-131
SuperMAG-01 magnetic separator  Ocean Nanotech SuperMAG-01
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit Thermo Fisher Scientific Z25055
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k Pall Corp OD100C34
EDTA 0.5M Corning Cellgro 46-034-CI
Bovine Serum Albumin solution Sigma-Aldrich A9576-50ML
PBS Gibco 10010-23
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified EMS 15710
123count eBeads  eBioscience 01-1234-42
CytoCount beads Dako S2366
AccuCheck count beads Invitrogen PCB100
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) BD Bioscience 642412
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution Thermo Fisher Scientific V22885
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
µMACS column  Miltenyi Biotec 130-042-701
OctoMACS Separator magnet Miltenyi Biotec 130-042-108
Nanodrop ThermoFisher none
NanoSight NS300 Malvern none
BD LSRII flow cytometer BD Bioscience none
Name Company Catalog Number Comments
Software
Flowjo software Flowjo
BD FACSDiva software BD
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References

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Citer Cet Article
Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vagida, M., Grivel, J., Margolis, L. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (119), e55020, doi:10.3791/55020 (2017).
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