JoVE Journal > Immunology and Infection
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Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
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Immunologie et infection

Fluxo Virometry para analisar antigênica Spectra de viriões e Extracelular vesículas

Published: January 25, 2017
doi:
10.3791/55020
, , , , ,
1Section on Intercellular Interactions,Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, 2Laboratory of Atherothrombosis, Cardiology Department,Moscow State University of Medicine and Dentistry, 3Sidra Medical and Research Center

Summary

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

Abstract

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Introduction

As células em organismos multicelulares têm muitas características individuais que podem ser ou único para uma determinada célula ou pelo menos parte de grupos de células únicas. Mesmo células clonadas cultivadas mostrar características individuais como evidenciado pela sua morfologia variada. Além disso, a individualidade de uma célula se reflete nos produtos que secreta. No caso de uma infecção virai, as partículas virais podem transportar proteínas a partir de células que a produzem. Por exemplo, para o HIV muitas proteínas da célula hospedeira são incorporados no envelope viral e vírus que são gerados por células diferentes podem realizar essas proteínas características 1, 2 ou assinaturas "células".

Mesmo sem a infecção, as células libertação para as mídia em torno pequenas vesículas extracelulares (SVE). Biogenesis destas vesículas e a sua estrutura em muitos casos que se assemelham de vírus, especialmente de retrovírus. Nos últimos anos tornou-se claroque EVs, que foram inicialmente consideradas como "pó de plaquetas" 3, constituem um sistema fisiológico importante de comunicação célula-célula. Juntamente com dois outros sistemas de comunicação intercelular, ou seja, interações de contato célula-célula e moléculas solúveis libertadas, EVs coordenar a fisiologia normal e são alteradas em várias patologias 4, 5, incluindo infecções virais 6, 7.

Embora ambas as partículas virais libertadas e vesículas extracelulares são altamente diversificada, eles são caracterizados essencialmente por análise de massa, em que as suas características individuais são perdidos. Um método semelhante para a citometria de fluxo, que fenótipos de células com base nas suas diferentes antigénios de superfície, é necessário caracterizar as partículas virais e virais individuais semelhantes. Infelizmente, EVs ou pequenos virions não podem ser analisados ​​usando cito fluxo padrãométodos metria, porque eles são muito pequenos para gerar o sinal de dispersão da luz em que a maioria dos citómetros contar para desencadear. Para ultrapassar esta limitação, a fluorescência de disparo pode ser aplicada. No entanto, se os VE ou viriões são coradas com anticorpos fluorescentes é difícil distingui-los de anticorpos livres e os seus agregados, devido à sua fluorescência semelhante e tamanhos comparáveis.

Recentemente, foi desenvolvido um método de alto rendimento à base de nanotecnologia que permite a caracterização de antígenos em pequenas partículas individuais utilizando citómetros de fluxo regular, 8, 9. Nós empregamos MNPs a partículas imunocaptura de interesse, como foi descrito por outros grupos para diversas aplicações 10, 11, 12, 13; no entanto, a nossa nova técnica permite a captura de especi indivíduoFIC alvos seguido por fenotipagem de estas partículas capturadas por citometria de fluxo por fluorescência desencadeamento, em vez de dispersão de luz, sem interferência a partir de anticorpos em circulação. Este método tem amplas aplicações e podem ser usadas para caracterizar a composição antigénica de qualquer partícula pequena viral- e não-viral gerada por células in vivo e in vitro, desde que a disponibilidade de anticorpos fluorescentes específicos contra antigénios de superfície. Nós já aplicou esta técnica para estudar vários problemas biológicos.

Em particular, foi avaliada a distribuição de marcadores de células hospedeiras em individuais HIV-1 partículas 9, estudamos a maturação do vírus da dengue individuais (DENV) com base na análise das suas proteínas de superfície 14 e investigados EVs liberadas na corrente sangüínea de voluntários saudáveis e doentes com síndrome coronariana aguda (SCA). Embora com base num princípio semelhante, oaplicação da nova técnica exigido o desenvolvimento de protocolos específicos que são descritos abaixo.

Protocol

1. Acoplamento de nanopartículas magnéticas (MNPs) Use procedimento de acoplamento comercial e reagentes para MNPs casal com anticorpos (Abs) (normalmente 1 mg). Nanopartículas de óxido de ferro com ácido carboxílico como grupos reactivos são utilizados. Se os anticorpos estão em um volume superior a 0,5 ml, concentrado utilizando um concentrador de 100K. Giram a 2.000 xg por 3-5 min. No final do processo, após a adição de 10 ul de tampão de têmpera, transferir MNPs a um tubo 12 mm x 75 mm e adicionar tampão de armazenamento / 3 mL de lavagem. Colocar o tubo no furo central de um separador magnético e deixar durante a noite a 4 ° C. Verificar que MNPs têm todos recolhidos para o lado do tubo, e, em seguida, cuidadosamente pipetar para fora todo o líquido. Adicionar 3 ml de tampão de lavagem / armazenamento fresca, e coloque de volta no ímã. Após várias horas, verificar se MNPS são recolhidos para o lado do tubo e, em seguida, pipetar o líquido. Utilizar 2 ml de tampão de lavagem / armazenagem deressuspender o MNPS e armazenar a 4 ° C. Verifique se Abs são acoplados a MNPs, rotulando-os com um fragmento de anticorpo Fab fluorescentes relevante (por exemplo cabra anti-rato se estiver usando um anticorpo monoclonal de ratinho Ab para captura como descrito na secção 2) e executado em um citômetro de fluxo. 2. Anticorpos Etiquetagem Acoplado a MNPs Combinar 60 mL (3,9 x 10 12 partículas) de MNPs (por condição) e 5 ul (de uma solução comercial / ml 200 ng) marcado, os fragmentos Fab específicos para o isotipo do Ab de captura num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar à temperatura ambiente (TA) durante 30 min, com mistura contínua. Pré-molhou um concentrador 100K com 300 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e centrifugação numa microcentrífuga a 1.500 xg durante 5 min. Purifica-se complexos marcados em coluna 100K. Girar-se a mistura a partir do passo 2.2 em uma microcentrífuga a 1500 xg durante 5 minutos, lava-se com 200 ul de PBS, e recuperar navolume inicial. 3. Uso de etiquetado Ab-MNP Complexos para capturar partículas de Interesse (Vírus ou EVs) Incubar pré-rotulados MNPs 60 ul (3,9 x 10 12 partículas) com HIV (60 uL) ou preparação VE (100 ul). Prepare preparações EV usando vários métodos. Aqui, purificar EVs em gradientes de sacarose, recolhê-los a partir de plasma pobre em plaquetas utilizando reagentes exosome precipitação ou isolar diretamente do plasma 8. NOTA: As razões óptimas precisa ser determinado para cada experimento e são dependentes de concentração de vírus / EV na preparação. Fracção MNP-Ab deve ser ~ 10 6 em excesso em relação à concentração da fracção de vírus / EV. Incubar 40 min a 37 ° C com mistura suave à presença de vírus, ou uma hora a 4 ° C durante VE. Adicionar IgG IgG de rato / humano 2,5% para bloquear a ligação de Fc, suavemente vortex, incubar 3-5 min a RT. Adicionar concentrações recomendadas fabricante ou tituladas de cada Abs detecção e incubar mais 20 minutos à TA. 4. Separação dos Virions MNP-capturados (ou EVs) de Unbound Anticorpos Usando Colunas magnéticas Preparar a coluna de separação magnética para utilização, colocando-o em um íman separador. Pré-molhou a coluna com 500 ul de tampão de lavagem (2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS). Permitir que a solução de lavagem a fluir através da coluna. Adicionar os complexos MNP-virus / MNP-EV para a coluna e permitir que todo o líquido flua. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem para a coluna, permitindo que todo o volume para passar através. Repita a lavagem com mais tampão de lavagem 2 vezes. Remova a coluna de ímã e coloque em 12 mm x 75 mm tubo para coleta dos complexos MNP-vírus / MNP-EV retidos. Deixar a coluna no tubo fora do íman durante 3 min. Adicionar 200 ul de PBS e deixouas contas fluir para baixo pela gravidade, adicione mais 200 ul de PBS, e fixar com 200 ul paraformaldeído a 4% após eluição. NOTA: O paraformaldeído é um cancerígeno e deve ser tratado em uma capa ventilado e devem ser usadas luvas. Para quantificar virions individuais / EVs usar as configurações volumétricas em High Throughput Sampler (HTS) ou apenas antes da aquisição adicionar fluxo bem misturada citometria de pérolas de contagem. 5. Análise de Vírus MNPs-capturados / EVs com um citômetro de fluxo Aqueça citômetro de fluxo para 30 min. Executar esferas de controlo de qualidade. Definir limite de fluorescência de qualquer MNPs ou rotulados vírus / EVs. Use 0,22 filtrada PBS para limiar para diminuir a fundo "ruído". Definir o limite ajustando a tensão PMT no nível onde filtrada PBS não dá, ou muito poucos, eventos. As amostras são executados em baixa. (Use um filtro de 0,04 mm em linha adicional para fluido de revestimento colocado em série atrás dopadrão bainha filtro de 0,2 um para eliminar ainda mais eventos falsos). 6. Avaliação da eficiência de captura Capturar EVs fluorescente etiquetado ou HIV com MNP-Abs, conforme descrito no 3.1, 3.2. (EVs podem ser rotulados ou com um corante de membrana ou através de sua carga 15; HIV podem ser marcados quer por meio de corante 16 codificados por genes, ou com um corante de membrana 12, 17). Preparar a coluna de separação magnética como descrito em (4,1-4,2). Adicionar os complexos MNP-virus / MNP-EV para a coluna e permitir que todo o líquido flua através (fluir através de fração). Recolher o fluxo através fracção no tubo. Prosseguir com a fracção retida na coluna, conforme descrito no (4,4-4,5). procedimento de captura de repetição no fluxo através fracção de 6,3 com posterior separação (4,1-4,5). Analisar as frações acumulados de primeira capture e segunda captura, executando-os em citômetro que está definido no desencadeamento na etiqueta fluorescente de EVs ou HIV. Para avaliar a eficiência, compare o número de eventos em ambas as frações. 7. Adaptação do Protocolo para tarefas específicas Nota: Embora o protocolo pode ser aplicado à análise de HIV e VE como descrito acima, para a análise do DENV as seguintes modificações devem ser introduzidos: Incubar viriões com 1 uM DII no escuro durante 30 min à TA. Após incubação purificar vírus manchado por centrifugação em meio de gradiente de densidade (10%, 20%, 25% e 35%) em 240.000 xg durante 1,5 h a 4 ° C sem travão. Recolha fração entre 20% e gradiente de densidade de 25% de camadas médias 14. Incubar DII marcado DENV 1 x 10 7 (60 ul) com concentrações recomendado pelo fabricante ou tituladas de detecção de Ab na presença de IgG de rato a 2,5% durante 20 min à TA. IncubComeram mistura com pré-marcado com 60 ul (3,9 x 10 12 partículas) complexos MNP Ab de captura durante 40 min a 37 ° C com mistura suave. complexos resultantes separados de Abs não ligados em colunas magnéticas, como descrito acima e analisar em citômetro de fluxo.

Representative Results

captura seletiva de antígenos celulares por HIV-1 virions Com "virometry fluxo" agora é possível visualizar antígenos celulares em partículas virais individuais. Como um exemplo, focada em dois antigénios celulares realizadas pelo HIV-1, LFA-1 e HLA-DR. No início dos dois antigénios foram identificados em preparações de HIV-1 em grandes quantidades analisadas 1. Preparamos MNPs acoplado com um dos anticorpos contra a proteína env de HIV, VRC01, e capturado com estes MNPs viriões de HIV-1 (HIV-1 ou HIV-LAI.04 1 SF162 produzidos em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)). Além disso, estes viriões coradas com 2G12, um outro anticorpo anti-env. Fluxo virometry apresentam uma grande heterogeneidade do HIV-1 virions a respeito da presença de LFA-1 e HLA-DR. Em média, 16,7 ± 2,0% (n = 6) e 8,6 ± 0,3% (n = 3) do HIV-1 virions LAI.04 realizadas de LFA-1 e de HLA-DR,respectivamente. Apenas 4,8 ± 0,6% (n = 3) de todos os viriões foram positivos para ambos os antigénios. Por outro estirpe HIV-1, HIV-1 SF162, estes antigénios estavam presentes em 20,0 ± 4,4% (n = 6) e 10,8 ± 1,3% (n = 6) de viriões, respectivamente, ao passo que ambos os antigénios foram realizadas por 6,5 ± 0,4% (Figura 1). A distribuição das proteínas celulares era dependente das células que replicados vírus. HIV-infected células Jurkat viriões antigenicamente diferentes daqueles produzidos por PBMC infectados produzidos. Os viriões de VIH-1 LAI 0,4 produzida pelas células Jurkat realizada 1,6 ± 1,4% (n = 3) e 1,6 ± 0,7% (n = 4) de LFA-1 e HLA-DR respectivamente. No caso do HIV-1 SF162 viriões produzidos em células Jurkat, estes parâmetros foram de 7,2 ± 2,5% (n = 3) e 5,6 ± 2,7% de (N = 4). Assim, a composição antigénica (pelo menos para HLA-DR e LFA-1) era diferente para o HIV-1 LAI.04 produzido por duas células diferentestipos (p <0,02). Fluxo virometry aplicada à avaliação do vírus da dengue DENV maturação está associada com a expressão da proteína prM nos viriões. Nós aplicamos virometry fluxo para avaliar o que fração do DENV produzido em BHK-1 e em células LoVo constitui vírus maduros. Virions foram marcadas com um corante lipídica DII. Análise de viriões capturados individuais revelou prM em 48,2 ± 5,3% (n = 8) de DENV. Em contraste, 84,5 ± 3,4% (n = 4) do DENV produzida em células LoVo realizadas prM. O resto dos viriões, respectivamente, de 51,8 ± 5,3% (n = 8) e 15,5 ± 3,4% (n = 4) foram prM negativa (Figura 2). Assim, virometry fluxo pode ser usado para distinguir DENV indivíduo totalmente madura de imaturo (ou parcialmente maduras) DENV viriões. vesículas extracelulares liberados na corrente sanguínea de saudávelvoluntários e pacientes com síndrome coronariana aguda (SCA) A fim de investigar os diversos subgrupos EV em pacientes com SCA e controles saudáveis, nós capturamos EVs de plasma pobre em plaquetas (PPP) por fluorescentes MNPs acoplado com anticorpos contra CD31, CD41a ou CD63. EVs capturadas por CD31-MNPs foram coradas para CD41a e CD63, EVs capturadas por CD41a-MNPs foram coradas para CD31 e CD63, e EVs capturadas por CD63-MNPs foram coradas para CD31 e CD41a (Figura 3). A quantidade de VE capturado por CD31-MNPS e positivo para um ou dois dos anticorpos de detecção em pacientes com SCA foi 3,359 [2,328; 5.472] EVs / mL, em comparação com 1272 [714; 2.157] EVs / mL em voluntários saudáveis ​​(p = 0,001). A quantidade total de EVs capturado por CD63 em pacientes com SCA, em comparação com voluntários saudáveis ​​foi de 3,541 [1,318; 5.173] EVs / l vs. 806 [488; 2.112] EVs / ul (p = 0,007). Houve 4752 [3238; 7.173] EVs / mL no plasma de pacientes com SCA capturadas por CD41a-MNPs, enquanto que no plasma de voluntários saudáveis ​​este número foi significativamente menor, 2623 [1927; 4.188] VE / l (p = 0,015). Em geral, os nossos resultados indicam que, embora quantidades EV foram principalmente um aumento em pacientes com SCA, a magnitude do aumento era diferente em diferentes sub-populações de veículos eléctricos. Figura 1: incorporação selectiva de antigénios celulares em viriões de HIV-1 se replicar em diferentes tipos de células. HIV (HIV-1 ou HIV-LAI.04 1 SF162) viriões libertados por PBMCs ou células Jurkat foram capturados com VRC01-MNPS e corado com o segundo anticorpo anti-gp120 e 2G12, com anticorpos específicos contra HLA-DR e LFA-1. As preparações coradas foram submetidas a análise de fluxo de HLA-DR (barras brancas) e LFA-1 (BA pretoRS). Médias ± SEM de três a seis experiências 9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: estado de maturação do vírus da DENV. DENV produzidos em células BHK-21 (A, B) ou em células LoVo (C, D) foram marcadas com o corante lipídica DII e, após ultracentrifugação em meio de gradiente de densidade, coradas para proteína prM com 2H2 anticorpos (A, C) ou com IgG2a de isotipo de controlo (B, D). Os virions marcadas foram então capturado com 3H5-1-MNPs e submetido a análise de fluxo 14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura. Figura 3: Análise de EVs de pacientes com SCA e controles saudáveis. EVs de plasma foram capturadas com CD31-MNPs, CD63-MNPs ou CD41a-MNPs e coradas com anticorpos contra CD41a e CD63, contra CD31 e CD41a e contra CD31 e CD63, respectivamente. VE capturados, coradas com pelo menos uma das Abs detecção, foram visualizados e enumerados na análise de fluxo. Dados apresentados como gráfico de pontos com mediana e intervalo interquartil (IQR). símbolos verdes: voluntários saudáveis ​​(controles), símbolos marrom: pacientes com SCA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Evaluatino qual a fracção do fluxo de eventos que representam viriões individuais. (A) de HIV-1. A suspensão de viriões foi dividida em duas partes e coradas quer com DID (painel da esquerda) ou DiO (painel do meio). Após a mistura, a suspensão, que continha dois virions diferencialmente manchadas, foi capturado com VRC01-MNPs e submetido a fluir virometry (painel direito). Agregados (eventos de duas cores) constituída menos de 10% do total de eventos. (B – D) DENV. A suspensão de viriões de DII-coradas foi diluída em série duas vezes a partir de 1: 2 a 1: 256 e adquirida com HTS num citómetro de fluxo (B). Dil-DENV foram marcadas com anticorpos 2H2 (C) ou DII-DENV foram capturados com 3H5-1-MNPS (D). As preparações C e D foram então diluídos em série duas vezes a partir de 1: 2 a 1: 256 e 14 adquirida com HTS. Os viriões não parecem agregar uma vez que em todos os casos háé uma correlação linear entre o factor de diluição e o número dos acontecimentos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Detecção de partículas individuais por citómetro de fluxo. suspensão DENV DII-corada foi diluída em série duas vezes a partir de 1: 2 a 1: 2048 e adquiridos utilizando um HTS num citómetro de fluxo. (A) Número de vírus detectadas como uma função do factor de diluição. (B) A mediana da intensidade de fluorescência (IMF) de DII marcado DENV 14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt = "Figura 6" src = "/ files / ftp_upload / 55020 / 55020fig6.jpg" /> Figura 6: Avaliação da fracção de viriões e as vesículas extracelulares capturados com MNPs acoplados a anticorpos específicos. Rotulados viriões de HIV-1 ou os VE foram capturados com MNPs acoplados a anticorpos específicos e submetidos a fluir virometry. Após separação sobre colunas magnéticos, o fluxo de passagem (não retido) fracções foram analisadas quanto à presença de viriões ou VE de interesse que foram perdidas na primeira corrida. (A) marcado viriões de HIV-1 BaL foram capturados com 2G12-MNPS (painel da esquerda). A fracção de fluxo foi recuperada e submetida a fluir virometry (painel da direita). No primeiro ciclo foram capturados cerca de 95% dos viriões de interesse. (B) VE marcadas foram capturadas com anticorpo anti-CD81 isolado MNPS e em colunas magnéticas (painel esquerdo). A fracção de fluxo foi re-captada e analisada (painel da direita). Em primeirociclo de cerca de 99% das vesículas de interesse foram capturados 8. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Citómetros de fluxo convencionais continuam a ser a principal ferramenta para a análise de células com base em suas características físicas e químicas em um nível individual 18. Os princípios básicos da citometria de fluxo não tenham sido alterados desde o seu desenvolvimento: uma célula que passa através do feixe de laser e a luz dispersa constitui um acontecimento que desencadeia a gravação do espectro de fluorescência emitida por anticorpos fluorescentes ligados às células. Partículas menores abaixo de 300 nm não pode ser detectado por dispersão lateral de um citômetro como eles se dispersam mais luz sob ângulos maiores em que a maioria citômetro de fluxo não recolhem luz 18. A técnica descrita aqui, permite a identificação ea análise de múltiplos antígenos em numerosas vírus ou EVs individuais por citómetros de fluxo convencionais com fluorescência desencadeante.

Os passos críticos no âmbito do protocolo são o acoplamento de anticorpos para MNPs. Nossos experimentos foram PerforMed 15 utilizando nanopartículas de óxido de ferro nm com o ácido carboxílico na forma de um grupo reactivo, tal como descrito anteriormente 9. Segundo o fabricante, a cada 15 nm MNP pode ligar um máximo de 20 anticorpos; ligamos cerca de 10 anticorpos por 15 MNP nm. Esta estimativa é baseada na quantidade de anticorpos antes e após o acoplamento e o número de esferas / ml como medido pela caracterização de nanopartículas e instrumentação de dimensionamento. Em princípio, o acoplamento pode causar a agregação de partículas e é indesejável. Para verificar que a agregação não está acontecendo com nosso protocolo, verificou-se isso com a caracterização de nanopartículas e instrumentação de dimensionamento. Este instrumento mede o diâmetro hidrodinâmico das partículas, que inclui as camadas de revestimento e de anticorpos, em vez de apenas o núcleo 15 nm. Verificou-se que a maioria das pérolas acopladas estão localizados em um único pico (pico médio de 64,7 ± 4,2 nm, com 90% de todos os eventos abaixo de 73 ± 7,3 nM). A mistura de Ab-co MNPmplexes com virions ou EVs na proporção certa é importante para que MNPs estão na concentração de várias ordens superiores EVs / virions. Isso é fundamental para garantir que EVs individuais / virions são analisados. Evitar coincidências dos eventos executando citômetro de fluxo baixo. Certifique-se de desencadear a aquisição de fluorescência e utilizar controlos volumétricos para medir a concentração das entidades capturados.

No entanto, pode agregar MNPs VE ou viriões por reticulação ou pela ligação de duas ou mais viriões ao mesmo nanopartículas. Para verificar isto, um teste de agregação como descrito na Figura 4 tem de ser realizada. viriões ou VE Mesmo capturados individualmente podem introduzir simultaneamente o feixe de laser do citómetro de fluxo. Isso criaria falso-positividade para dois antigénios diferentes. Para evitar isso, o citómetro de fluxo deve ser definida como descrito e as preparações devem ser diluídas. Pode-se verificar se por acaso está a acontecer usando a mesmaestratégia, tal como descrito no ponto anterior. Além disso, a falta de coincidência pode ser verificada por análise de diluições em série da preparação e provando que o número de eventos diminui linearmente com a diluição, enquanto a intensidade de fluorescência média de um antigénio fluorescentemente manchado permanece constante em todas as diluições (Figura 5). Outra questão é que muito poucos vírus / EVs podem ser capturados. Isto pode ser devido à verdadeira escassez de vírus / EVS que transportam antigénios através da qual eles são capturados por MNPs específica. Em alternativa, a eficiência de captura é baixa, devido a várias razões (por exemplo, o acoplamento de anticorpos a ineficiente MNPs, desvio das proporções de MNPs para viriões / EVS desenvolvidos para este protocolo, etc.). Para evitar esta última possibilidade, a eficiência de captura deve ser avaliada especificamente. Tipicamente, a eficácia deve ser de cerca de 90%, como na Figura 6.

diferentes anticorpos podem interferir devido àimpedimento estérico uns com os outros ou com os anticorpos acoplados a MNPs. Para verificar que isso não aconteceu um protocolo de captura reverso deve ser testada (como descrito na Seção 7. Resumidamente, virions ou EVs deve ser primeiro corados com Abs detecção fluorescente e então capturado por complexos Ab-MNP com subsequente separação do Abs flutuantes livres em colunas magnéticas.

Fluxo virometry tem vantagens significativas em relação aos métodos existentes de análise da composição antigênica do vírus da ou EVs. métodos bioquímicos de rotina informar sobre a presença geral de proteínas específicas nos preparativos, mas não fornecem informações sobre a heterogeneidade dos virions ou EVs. Isto inclui imunocaptura de viriões ou em VE grandes partículas disponíveis comercialmente. Tais partículas são geralmente de vários micra de diâmetro e cada um deles pode capturar centenas ou milhares de viriões ou VE. Portanto, quaisquer médias de análises posteriores das propriedades dos viriões / EVscapturado por uma partícula. Em contraste, o fluxo virometry utiliza MNPs de 10-15 nm de diâmetro e com o protocolo descrito, pelo menos, 90% dos eventos representar um único virião ou EV único.

A principal limitação é que toda a população de viriões ou em VE a preparação não pode ser analisado, mas apenas aqueles que são capturados. Assim, a escolha do antigénio, através do qual os viriões são capturados ou VE torna-se crítica. Além disso, ao contrário de citometria de fluxo o número de antigénios diferentes (o número de anticorpos fluorescentes contra diferentes antigénios) é limitada pela pequena superfície de viriões ou VE. Finalmente, os anticorpos diferentes podem interferir estericamente com a outra novamente, devido à superfície de pequeno (em comparação com as células).

O protocolo de corrente pode ser adaptada para análise de qualquer vírus ou EV de qualquer origem, desde que os anticorpos específicos através dos quais eles podem ser capturadas estão disponíveis. Análise de antigénios no indivíduo autorização de viriõess investigadores para tratar a patogênese de diferentes fracções de populações virais. Além disso, a identificação de EVs individuais no plasma podem torná-lo possível rastrear a origem de EVs para células particulares e informar sobre as condições normais ou patológicos dessas células e os órgãos em que residem.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.

Materials

Materials
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits Ocean Nanotech ICK-15-005
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane Millipore UFC810024
5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap Falcon 352002
DEPC treated water Quality Biological  351-068-131
SuperMAG-01 magnetic separator  Ocean Nanotech SuperMAG-01
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit Thermo Fisher Scientific Z25055
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k Pall Corp OD100C34
EDTA 0.5M Corning Cellgro 46-034-CI
Bovine Serum Albumin solution Sigma-Aldrich A9576-50ML
PBS Gibco 10010-23
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified EMS 15710
123count eBeads  eBioscience 01-1234-42
CytoCount beads Dako S2366
AccuCheck count beads Invitrogen PCB100
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) BD Bioscience 642412
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution Thermo Fisher Scientific V22885
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
µMACS column  Miltenyi Biotec 130-042-701
OctoMACS Separator magnet Miltenyi Biotec 130-042-108
Nanodrop ThermoFisher none
NanoSight NS300 Malvern none
BD LSRII flow cytometer BD Bioscience none
Name Company Catalog Number Comments
Software
Flowjo software Flowjo
BD FACSDiva software BD
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References

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Citer Cet Article
Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vagida, M., Grivel, J., Margolis, L. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (119), e55020, doi:10.3791/55020 (2017).
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