Fluss Virometry zur Analyse Antigenic Spektren von Virionen und extracellular Vesikeln
Summary
Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.
Abstract
Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.
Introduction
Zellen in mehrzelligen Organismen haben viele einzelne Merkmale, die entweder einzigartig für eine bestimmte Zelle oder zumindest zur einzigartigen Gruppen von Zellen gehören, sein kann. Selbst kultiviert zeigen geklonten Zellen individuellen Eigenschaften durch ihre unterschiedlichen Morphologie bewiesen wie. Außerdem wird eine Zelle die Individualität in den Produkten wider es absondert. Im Fall von viralen Infektion können virale Teilchen Proteine aus den Zellen tragen, die sie produziert. Beispielsweise für HIV sind viele Wirtszellproteine in der Virushülle eingebettet und Viren, die von verschiedenen Zellen erzeugt werden , können diese charakteristischen Proteine 1, 2 oder "Zell Signaturen" tragen.
Auch ohne Infektion, lassen Sie Zellen in den Medien kleine extrazellulären Vesikeln (EVs) umgibt. Biogenesis dieser Vesikel und ihre Struktur in vielen Fällen ähnlich dem von Viren, insbesondere Retroviren. In den letzten Jahren ist es klar geworden,dass EVs, die zunächst betrachtet wurden "plättchen dust" 3 bilden eine wichtige physiologische System der Zell-Zell – Kommunikation. Zusammen mit zwei anderen Systemen der interzellulären Kommunikation, nämlich Zell-Zell – Wechselwirkungen und Kontakt freigesetzt lösliche Moleküle, koordinieren EVs normale Physiologie und an verschiedenen Pathologien 4, 5 einschließlich viraler Infektionen 6, 7 verändert werden .
Obwohl beide freigegeben virale Partikel und extrazelluläre Vesikel sehr unterschiedlich sind, werden sie überwiegend von bulk-Analyse charakterisiert, in der ihre individuellen Eigenschaften verloren gehen. Verfahren ähnlich Durchflusszytometrie, die auf ihren unterschiedlichen Oberflächenantigenen basieren Zellen Phänotypen benötigt einzelne virale und virale ähnlichen Partikel zu charakterisieren. Leider kann EVs oder kleine Virionen nicht mit Standard-Flow Zyto analysiert werdenmetry Methoden, weil sie sind zu klein, um das Lichtstreuungssignal zu erzeugen, auf denen die meisten Zytometer angewiesen zu triggern. Um diese Einschränkung zu umgehen, Fluoreszenz auslösenden angewendet werden kann. wenn EVs oder Virionen jedoch mit fluoreszierenden Antikörpern gefärbt werden, ist es schwierig, sie von freien Antikörpern und deren Aggregate aufgrund ihrer ähnlichen Fluoreszenz und vergleichbarer Größe zu unterscheiden.
Vor kurzem haben wir eine Nanotechnologie-basierte Hochdurchsatzverfahren, die die Charakterisierung von Antigenen auf einzelne kleine Partikel mit Hilfe von regulären Durchflusszytometer 8, 9 ermöglicht. Wir beschäftigen MNPs Immunocapture Partikel von Interesse, wie sie von anderen Gruppen für vielfältige Anwendungen 10, 11, 12, 13 beschrieben worden ist ; ermöglicht es jedoch, unsere neuartige Technik für die Erfassung von einzelnen spezifischenFic Ziele durch Phänotypisierung dieser gefangenen Partikel durch die Strömung gefolgt Zytometrie Fluoreszenz unter Verwendung Auslösung statt Lichtstreuung, ohne Einmischung von frei schwebenden Antikörpern. Dieses Verfahren hat breite Anwendungen und kann verwendet werden , um die antigene Zusammensetzung nach viral- und nicht-virale kleine Teilchen von Zellen in vivo und in vitro bereitgestellt , um die Verfügbarkeit von bestimmten fluoreszierenden Antikörpern gegen Oberflächenantigene erzeugt zu charakterisieren. Wir haben bereits mit dieser Technik zu studieren mehrere biologische Probleme angewandt.
Insbesondere wir die Verteilung von Wirtszellmarker zu einzelnen HIV-1 – Partikel 9, bewertet suchten wir die Reifung von einzelnen Dengue – Viren (DENV) basierend auf der Analyse ihrer Oberflächenproteine 14 und untersucht EVs in den Blutstrom von gesunden Freiwilligen freigesetzt und Patienten mit akutem Koronarsyndrom (ACS). Obwohl basierend auf einem ähnlichen Prinzip, dasAnwendung der neuen Technik erforderliche Entwicklung von spezifischen Protokolle, die nachfolgend beschrieben werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herkömmliche Durchflusszytometer bleiben das wichtigste Instrument für die 18 Zellen auf der Grundlage ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften auf individueller Ebene zu analysieren. Die Grundprinzipien der Strömungs haben Cytometrie nicht seit seiner Entwicklung verändert: eine Zelle, die durch den Laserstrahl passiert und streut Licht bildet ein Ereignis, das die Aufzeichnung der Fluoreszenzspektren von zellgebundenen Fluoreszenz Antikörper emittiert auslöst. Kleinere Partikel unterhalb von 300 nm kann nicht durch Seitenstreuung eines cytometer erkannt werden , da sie mehr Licht unter größeren Winkeln streuen , an denen die meisten Durchflusszytometer nicht 18 Licht zu sammeln. Die hier beschriebene Technik, ermöglicht die Identifizierung und die Analyse von mehreren Antigenen auf zahlreiche einzelne Viren oder EVs durch herkömmliche Durchflusszytometer mit Fluoreszenz auszulösen.
Die kritischen Schritte innerhalb des Protokolls sind die Kopplung von Antikörpern gegen MNPs. Unsere Experimente wurden PERFORmed unter Verwendung von 15 nm Eisenoxid-Nanopartikel mit Carbonsäure als eine reaktive Gruppe, wie zuvor beschrieben 9. Nach Angaben des Herstellers, die jeweils 15 nm MNP kann maximal 20-Antikörper binden; wir binden etwa 10 Antikörper pro 15 nm MNP. Diese Schätzung wird auf die Menge von Antikörpern basiert vor und nach der Kopplung und die Anzahl der Perlen / ml, wie durch Nanopartikel-Charakterisierung und Dimensionierung Instrumentierung gemessen. Grundsätzlich kann Kupplungs Aggregation von Teilchen verursachen und ist unerwünscht. Um zu überprüfen, dass die Aggregation mit unserem Protokoll nicht geschieht, überprüften wir dies mit der Nanopartikel Charakterisierung und Dimensionierung Instrumentierung. Dieses Instrument misst den hydrodynamischen Durchmesser der Partikel, die nur die Beschichtung und die Antikörperschichten, anstatt den Kern 15 nm enthält. Wir fanden heraus, dass die Mehrheit der gekoppelten Kügelchen in einem einzigen Peak (Spitzen bedeuten bei unter 73 ± 7,3 nm 64,7 ± 4,2 nm bei 90% aller Veranstaltungen) befinden. Das Mischen von Ab-MNP complexe mit Virionen oder EVs im richtigen Verhältnis ist wichtig, damit MNPs in der Konzentration von mehreren Ordnungen höher als EVs / Virionen. Dies ist wichtig, um sicherzustellen, dass einzelne EVs / Virionen analysiert. Vermeiden Sie Zufälle der Ereignisse durch cytometer bei niedrigen Strömungs läuft. Stellen Sie sicher, den Erwerb der Fluoreszenz auszulösen und verwenden Volumen steuert die Konzentration der erfassten Einheiten zu messen.
Jedoch EVs oder Virionen aggregieren durch Vernetzung oder durch die Bindung von zwei oder mehr Virionen zu derselben Nanopartikel MNPs kann. Um dies zu überprüfen, wird ein Test für die Aggregation , wie in Abbildung 4 beschrieben , muss durchgeführt werden. Auch einzeln erfasst Virionen oder EVs können gleichzeitig den Laserstrahl des Durchflusszytometer ein. Dies wäre falsch-positiver für zwei verschiedene Antigene erzeugen. Um dies zu vermeiden, sollte das Durchflusszytometer eingestellt werden, wie beschrieben und sollten die Präparationen verdünnt werden. Man kann prüfen, ob Zufall geschieht durch die Verwendung derselbenStrategie wie im vorherigen Punkt beschrieben. Auch könnte das Fehlen der Koinzidenz durch die Analyse Reihenverdünnungen der Präparation überprüft werden , und beweisen , dass die Anzahl der Ereignisse nimmt linear mit der Verdünnung während die mittlere Fluoreszenzintensität eines fluoreszent stained Antigen bleibt konstant in allen Verdünnungen (Abbildung 5). Ein weiteres Problem ist, dass zu wenige Viren / EVs erfasst werden können. Dies kann auf die wahre Knappheit von Viren / EVs zurückzuführen sein, die Antigene durch die sie erfasst werden durch spezifische MNPs tragen. Alternativ kann die Effizienz der Erfassung gering ist aus verschiedenen Gründen (beispielsweise ineffizienten Kopplung von Antikörpern an MNPs, abweichend von den Verhältnissen von MNP zu Virionen / EVs für dieses Protokoll entwickelt, etc.). Um die letztere Möglichkeit zu vermeiden, sollten die Effizienz der Erfassung speziell ausgewertet werden. Typischerweise sollte der Wirkungsgrad etwa 90% , wie in Figur 6 sein.
Verschiedene Antikörper können aufgrund störensterische Hinderung miteinander oder mit den Antikörper gekoppelt MNP. Um zu überprüfen, dass dies nicht getestet werden, der Fall war ein Reverse-Capture-Protokoll muss (wie in Abschnitt 7 beschrieben Kurz gesagt, Virionen oder EVs sollte mit Fluoreszenzdetektion Abs zuerst gefärbt werden und dann eingefangen durch Ab-MNP-Komplexe mit anschließender Trennung von frei schwebenden Abs auf magnetische Säulen.
Strömungs virometry hat erhebliche Vorteile gegenüber bestehenden Methoden der Analyse der antigenen Zusammensetzung von Virionen oder EVs. Routine biochemische Methoden berichten über die allgemeine Vorhandensein bestimmter Proteine in den Vorbereitungen, aber keine Auskunft über die Heterogenität der Virionen oder EVs. Dazu gehören Immunocapture von Virionen oder EVs auf großen kommerziell erhältlichen Partikel. Solche Partikel sind typischerweise von einigen Mikrometern im Durchmesser und jeder von ihnen kann Hunderte oder Tausende von Virionen oder EVs erfassen. Daher werden alle nachfolgenden Analyse mittelt die Eigenschaften der Virionen / EVsvon einem Partikel eingefangen. Im Gegensatz dazu fließen virometry verwendet MNP von 10-15 nm im Durchmesser und mit dem beschriebenen Protokoll von mindestens 90% der Ereignisse eines einzelnen Virion oder einzelne EV darstellen.
Die wichtigste Einschränkung ist, dass die gesamte Bevölkerung von Virionen oder EVs in der Vorbereitung nicht analysiert werden können, sondern nur diejenigen, die erfasst werden. Daher sind die Wahl des Antigens durch die Virionen oder EVs erfasst wird kritisch. Auch im Gegensatz zu Durchflusszytometrie der Anzahl verschiedener Antigene (die Anzahl der fluoreszierenden Antikörper gegen verschiedene Antigene) durch die kleine Oberfläche von Virionen oder EVs begrenzt. Schließlich können verschiedene Antikörper sterisch miteinander wieder aufgrund der kleinen (im Vergleich zu den Zellen) Oberfläche stören.
Das aktuelle Protokoll kann zur Analyse von Viren oder EV beliebigen Ursprungs angepasst werden, sofern die spezifischen Antikörper durch die sie zur Verfügung stehen erfasst werden. Analyse von Antigenen auf einzelnen Virionen Erlaubniss Forscher die Pathogenese der verschiedenen Fraktionen der viralen Populationen zu adressieren. Weiterhin Identifizierung einzelner EVs in Plasma kann es aufzuhalten ermöglichen, den Ursprung von EVs auf bestimmte Zellen zu verfolgen und zu normalen oder pathologischen Bedingungen dieser Zellen und den Organen, in denen sie zu berichten.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.
Materials
| Materials | |||
| Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits | Ocean Nanotech | ICK-15-005 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | Millipore | UFC810024 | |
| 5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap | Falcon | 352002 | |
| DEPC treated water | Quality Biological | 351-068-131 | |
| SuperMAG-01 magnetic separator | Ocean Nanotech | SuperMAG-01 | |
| Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | Z25055 | |
| Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k | Pall Corp | OD100C34 | |
| EDTA 0.5M | Corning Cellgro | 46-034-CI | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A9576-50ML | |
| PBS | Gibco | 10010-23 | |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | EMS | 15710 | |
| 123count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CytoCount beads | Dako | S2366 | |
| AccuCheck count beads | Invitrogen | PCB100 | |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) | BD Bioscience | 642412 | |
| Vybrant DiI Cell-Labeling Solution | Thermo Fisher Scientific | V22885 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| µMACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-701 | |
| OctoMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | none | |
| NanoSight NS300 | Malvern | none | |
| BD LSRII flow cytometer | BD Bioscience | none | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Flowjo software | Flowjo | ||
| BD FACSDiva software | BD |
References
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