Diseño experimental para microdisección láser RNA-Seq: Lecciones de un análisis del desarrollo de la hoja de maíz

La hoja de maíz es un modelo ideal para estudiar la formación de campos de desarrollo durante la morfogénesis, ya que tiene un límite distinto entre la cuchilla y la vaina que es susceptible a la disección genética (Figura 1A). Durante las primeras etapas de desarrollo de las hojas, una banda lineal de células más pequeñas, la banda preligule (PLB), subdivide el primordio de la hoja en dominios pre-cuchilla y pre-vaina. Un lígula franja similar y aurículas triangulares desarrollan a partir de la PLB (Figura 1 A, C, D). cribados genéticos han identificado mutaciones que alteran la frontera hoja-vaina. Por ejemplo, liguleless1 recesivo (LG1) mutaciones eliminar la lígula y aurículas ^{1, 2, 3, 4} (Figura 1B). La hibridación in situ reveló que la transcripción lg1 se acumula en el PLB y lígula emergentes, por lo que es un excelente marcador para el desarrollo lígula ^{5, 6} (Figura 1E).

Figura 1: De tipo salvaje y hojas de maíz liguleless1-R. (A) zona de borde de la lámina de la vaina de la hoja de tipo salvaje madura que muestran estructuras lígula y la aurícula. (B) zona de borde de la lámina de las vainas maduras de liguleless1-R hoja que muestra ausencia de estructuras lígula y la aurícula. Hojas en A y B se han reducido a la mitad a lo largo del nervio central. (C) longitudinal a través de la sección primordio de hoja de tipo salvaje. Muestra que se ha procesado y se tiñeron para el análisis histológico. La lígula iniciar es evidente como una protuberancia que sobresale desde el plano de la hoja (punta de flecha). (D) secta Longitudinalprimordio de iones a través de la hoja de tipo salvaje. Muestra que se ha procesado para LM como se describe en el texto. Punta de flecha indica el inicio lígula. (E) lg1 hibridación in situ de rodaje sección longitudinal lateral ápice. Los asteriscos indican la acumulación de transcripción lg1 en el PLB del primordio de hoja P6. Las flechas indican la base de P6 primordio. La barra indica la medición de la base del primordio de la PLB. Las barras de escala en A y B = 20 mm. Las barras de escala en CE = 100 m. Esta cifra se ha modificado de la referencia ⁶ (Derecho de Autor Sociedad Americana de Biólogos Vegetales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En este estudio, se empleó LM RNA-Seq para identificar un conjunto de genes que se expresan diferencialmente (DE) en el límite de la hoja de la vaina en relación con otras partes del primordio de la hoja y a IDE ntify genes que están en lg1 DE-R mutantes en relación con los hermanos de tipo salvaje. LM RNA-Seq es un método de cuantificación de la acumulación de transcripción en células específicas o dominios celulares ^7. sistemas LM combinan un láser y un microscopio con una cámara digital. tejido seccionado se monta en portaobjetos y se ve a través del microscopio. El software LM típicamente incluye herramientas de dibujo que permiten al usuario para delinear cualquier región seleccionada para la microdisección. Los cortes de láser a lo largo de la línea, y el tejido seleccionado es catapultado fuera de la diapositiva y en un tubo suspendido por encima de la diapositiva. LM permite al usuario microdissect dominios precisas, incluyendo capas de células específicas e incluso células individuales ^{8, 9.} ARN se puede extraer del tejido microdissected. Posteriormente, el componente de RNA-Seq utiliza secuenciación de próxima generación para secuenciar bibliotecas de ADNc generados a partir de ARN extraído ^10,= "xref"> 11.

Las principales ventajas de LM ARN-ss son la capacidad de cuantificar la acumulación de transcripción en dominios definidos con precisión y la capacidad para perfilar todo el transcriptoma simultáneamente ^7. La técnica es particularmente adecuada para el sondeo acontecimientos de desarrollo tempranos en la región de interés es a menudo microscópico. Estudios anteriores han utilizado LM combina con la tecnología de microarrays para estudiar los procesos de desarrollo en plantas ^{9, 12, 13.} RNA-Seq tiene la ventaja de la cuantificación de los transcritos en un amplio rango dinámico, incluyendo genes de bajo expresado, y la información de secuencia anterior no se requiere ^{10, 11.} Por otra parte, LM RNA-Seq tiene el potencial para resaltar genes de desarrollo importantes que pueden perderse en las pantallas de mutagénesis debido a la redundancia genética o a la letalidad de la pérdida-de-función mutante.

Genes importantes para el desarrollo, tales como sheath1 estrecha (NS1) y en forma de copa cotyledon2 (CUC2), a menudo tienen patrones de expresión específica de sólo una o unas pocas células ^{17, 18, 19, 20.} Muchos se expresan solamente durante las etapas tempranas del desarrollo y no en el órgano maduro. Cuando se analizan órganos enteros o grandes dominios, estos transcritos específicos de células se diluyen y no pueden detectarse en los análisis más convencionales. Al permitir que los análisis de dominios definidos con precisión, LM RNA-Seq permite que estos genes específicos de tejido para ser identificados y cuantificados.

factores cruciales para el éxito de los experimentos descritos aquí fueron un análisis histológico exhaustivo que guió a la selección de la etapa de desarrollo apropiado y dominio para el análisis y la medida PA precisant de dominios de células de tejidos para LM. Para asegurar que los dominios equivalentes se tomaron muestras para todas las repeticiones, se recogió tejido de primordios de la hoja en la misma etapa de desarrollo y los dominios microdissected se mide en relación con puntos de referencia morfológicos tales como la lígula emergente (Figura 2). Se sabe que algunos genes se expresan en un gradiente desde la punta hasta la base de la hoja. Mediante la medición de dominios precisos, debido a la variación de muestreo de diferentes lugares a lo largo del eje proximal-distal de la hoja se mantiene al mínimo (Figura 3A). Por microdissecting dominios del mismo tamaño, la variación debido a la diferencia de dilución de los transcritos específicos de células también se redujo (Figura 3B). secciones longitudinales laterales del ápice del brote se utilizaron para todos microdisecciones. Estos son secciones que son perpendiculares al eje nervio central margen (Figura 4). Usando sólo las secciones que incluyen la SAM asegura que las regiones laterales equivalentes deSe analizan primordios foliares.

En las muestras procesadas y seccionados para LM, la primera señal morfológica del crecimiento de lígula es una protuberancia en el lado adaxial debido a las divisiones celulares periclinales en la epidermis adaxial (Figura 1 D, Figura 2). Se determinó que la lígula emergente podría ser fiable identificado en plastocrono 7 primordios foliares etapa. Estábamos interesados ​​en los genes expresados ​​en toda la región lígula, incluyendo la lígula emergentes y las células inmediatamente distales que formarán la aurícula. Con el fin de asegurar que se hicieron selecciones de tejidos equivalentes, la protuberancia lígula se utilizó como un punto de referencia morfológica y un rectángulo 100 micras centrado en la protuberancia lígula fue seleccionado para LM (Figura 2A, 2B). rectángulos de tamaño equivalente de pre-lámina y pre-envoltura fueron seleccionados de las mismas primordios foliares.

Los análisis de las plantas mutantes liguleless presentaron un challe diferenteESN; LG1-R mutantes no forman una lígula, por lo tanto, esta característica morfológica no se podría utilizar para seleccionar la región de LM. En lugar de ello, se determinó el dominio de la acumulación de transcripción lg1 en los primordios de la hoja de tipo salvaje, y se definió una región que abarque este dominio. Estos análisis preliminares se realizaron en plantas de semillero de la misma plantación que se utilizaron para el análisis final, ya que el trabajo previo ha demostrado que la ubicación de la PLB varía dependiendo de las condiciones de crecimiento. La hibridación in situ indicó que los transcritos LG1 se acumulan en el PLB de P6 primordios foliares (Figura 1E). Hemos seleccionado un dominio de 400-900 micras desde la base de la primordios foliares que abarcaba el dominio de la expresión lg1 (rectángulos de color violeta, Figura 2A) y capturó estas regiones equivalentes de tipo salvaje y las plantas lg1-R. Para minimizar la variación en el fondo de crecimiento y condiciones genéticas cuando se comparan trascripciónSe utilizaron t acumulación en lg1-R y plantas de tipo salvaje, la segregación de las familias de los mutantes y de tipo salvaje hermanos.