JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar Yönetim T hücresi kanser antijenleri Reseptör tanıma belirlemek için

Published: February 06, 2017
doi:
10.3791/54991
, , , , , , , ,
1Division of Infection and Immunity and Systems Immunity Research Institute,Cardiff University, 2Department of Oncology,University Hospital of Lausanne (CHUV), 3Ludwig Insitutue for Cancer Research, Lausanne Branch,University of Lausanne

Summary

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

Abstract

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Introduction

X-ışını kristalografisi olmuştur ve ligand-reseptör etkileşimleri doğasını anlamak için son derece güçlü bir tekniktir olmaya devam edecektir. atomik ayrıntılı olarak bu etkileşimleri görselleştirerek, sadece mümkün birçok biyolojik süreçleri düzenleyen moleküler mekanizmaları açıklamaya, ama doğrudan terapötik fayda irtibat arayüzleri değiştirmek de mümkündür. Bu tür yüzey plazmon rezonansı ve (isim sadece bir çift) izotermal titrasyon kalorimetri gibi teknikler ile birleştiğinde, bu tür değişiklikler daha sonra bağlanma afinitesi, etkileşim kinetik ve termodinamik doğrudan etkisini değerlendirmek için biyofiziksel analiz edilebilir. Son olarak, ilgili hücre tipleri üzerinde fonksiyonel deneyler yaparak, reseptör-ligand etkileşimleri değişiklikler moleküler ve fonksiyonel etkisi ayrıntılı bir resim çok özel mekanik bilgi veren, toplanan olabilir. Genel olarak, yöntemler bu tür caydırmak sağlayan bir atomik çözünürlükte görüntü elde tanı ve tedavi gelişmeler için görevli etkileri olan, nasıl çalıştığını, biyolojik sistemleri ermesi.

Laboratuvarımız rutin otoimmünite, patojenler ve kansere insan T-hücresi bağışıklık aracılık reseptörleri incelemek için bu teknikleri kullanır ve nakli sırasında. Burada, T-hücresi reseptörü (TCR) ve insan lökosit antijeni (HLA) -restricted tümör kaynaklı peptid (pHLA) arasındaki etkileşim aracılık ettiği kanseri insan CD8 + T-hücresi yanıtı, odak. CD8 + T hücreleri, kanser hücrelerini hedeflemek için mümkün olsa da, ve diğerleri, daha önce bir anti-kanser TCRler Optimal kendi aynı kökenli pHLA 1, 2 bağlanan göstermiştir, çünkü bu önemlidir. Bu nedenle, bir çok laboratuar değiştirme girişiminde ya TCR 3, 4, 5 ya da peptid bağ 6,bağışıklık artırmak amacıyla daha iyi hedef kanserli hücrelerin sınıf = "xref"> 7, 8. Ancak, bu yaklaşımlar her zaman etkili değildir ve hedef dışı toksisite 4, 9, 10 de dahil olmak üzere ciddi yan etkileri olabilir. Kanser antijenleri T-hücre tanıma yöneten moleküler mekanizmaları keşfetmek daha fazla araştırma bu eksiklikleri aşmak için önemli olacaktır.

Bu çalışmada, en yaygın * 0201 (HLA-A tarafından sunulan 100 (gp100) glikoprotein farklılaşma melanosit antijenin bir parçası için spesifik CD8 + T hücreleri ile otolog melanoma hücrelerine karşı tepkiler, gp100 280-288, odaklanmış eksprese insan pHLA sınıfı I). Bu antijen, melanom immünoterapisi için çok çalışılan hedef olmuştur ve valin, alanin yerine olan bir sözde "heteroklitik" peptit olarak geliştirilmiştirçapa 9 konumundaki pHLA istikrarı 11 artırmak için. Bu yaklaşım, in vitro melanom reaktif CTL 'lerin indüksiyonunu arttırmak için kullanılmış ve başarılı klinik çalışmalarda 12 kullanılmıştır. Bununla birlikte, peptid kalıntılarına modifikasyonlar klinik 6, 13 en heterolitic peptidlerin zayıf etkinlik gösterdiği T-hücresi özgüllüğü, öngörülemeyen etkileri olabilir. Gerçekten de, Glu3 Ala ile ikame edildiği, peptit kısımsını gp100 280-288 diğer heteroklitik şekilde, gp100 280-288 özgü T hücreleri 14, 15 bir poliklonal nüfus tarafından tanınması iptal etmiştir. Daha önce peptid bağlantı kalıntılarının küçük değişikliklere bile hemen hemen tahmin edilemeyecek bir şekilde 6, 16 T-hücresi tanımayı değiştirebileceğini gösterdi. Böylece, çalışma yapı üzerinde durulduCD8 + T hücreleri TCRler ve pHLA arasındaki etkileşimin gp100 ve nasıl modifikasyonları fark ne ilişkin daha ayrıntılı bir görüntü ing bu işlevi etkileyebilir.

Burada, HLA-A * 0201 (A2-yle) tarafından sunulan gp100 280-288 özgü iki TCRlerin son derece saf, çözünür formları, yanı sıra pHLA doğal ve değiştirilmiş formları üretilir. Bu reaktifler heteroklitik A2-YLE şeklinde, hem de bağlanmamış formda mutan pHLAs iki ile kompleks olan bir insan TCR üçlü atom yapısını çözmek protein kristallerinin üretilmesi için kullanılmıştır. Daha sonra derinlemesine biyofiziksel deneyler yaparak TCR'lerinin peptit değiştirmelerin etkisini göstermek için bir peptit tarama yaklaşımı kullanılır. Son olarak, genetik olarak modifiye edilmiş CD8 + T hücre soyu elde çeşitli peptid değişiklikler biyolojik etkilerini test etmek fonksiyonel deneyler için, A2-yle özgü TCRlerin bir ifade yeniden programlanabilir. Bu veriler bile Modi ortaya koymaktadırfications öngörülemeyen vuruş on TCR bağlanması ve T-hücre tanıma iptal bitişik peptid artıkları üzerindeki etkileri olabilir TCR bağlanma motifi dışındaki kalıntılarını peptid. Bulgularımız melanom için bu önemli terapötik hedefin T-hücre tanıma altında yatan yapısal mekanizmaların ilk örneğini temsil etmektedir.

Protocol

1. Protein Ekspresyonu Daha önce 17, 18 ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi, çözünür TCRlerin ve pHLAs üretimi için gen yapılarını yapmak. bir 5 'BamH1 ve bir 3' pGMT7 vektörüne sokulması için EcoR1 kısıtlama sahası ile inşa her tasarım. 4 ° C'de 50-200 ng / 5 dakika boyunca E.coli 5 uL uL plazmid 1 uL inkübe edilerek ilgili proteini kodlayan sekansı ihtiva eden bir pGMT7 türetilmiş plazmit vektörü ile E.coli Rosetta (DE3) pLysS Transform 42 ° C'de 2 dakika ve 4 ° C'de 5 dakika ve 50 mg / L karbenisilin ile desteklenmiş LB agar plakası üzerinde 37 ° C'de gece boyunca plaka. Bireysel koloniler ve süspansiyon kadar 100 uM karbenisilin ile desteklenmiş 37 ° C ve 220 rpm'de 30 ml TYP ortam içinde (16 g / L tripton, 16 g / L maya ekstresi, 5 g / L HK 2 O 4) büyümesine optik DE ulaşırnsity 0.4 ila 0.6 arasında (OD 600). 3 saat boyunca, 0.5 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) verilmesi ile 5 ml kısım protein üretimini uyarmaktadır. ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz için uyandırılmadan süspansiyon 20 uL tutmak ve jel leke. 100 uM karbenisilin ile desteklenmiş TYP 1 L başlatıcı kültürler ekleyin ve süspansiyon 0.4 ila 0.6 arasında bir OD 600 ulaşıncaya kadar adım 1.3 tarif edildiği gibi hücreler büyür. 0.5 mM IPTG ile 3 saat boyunca protein ifadesi neden. 3,000 x g'de 20 dakika boyunca hücreleri Santrifüj ve dikkatli süpernatant dökün. Bir 2 s aralığı kullanılarak 30 dakika ila 60% 'si güç için, buz üzerinde sonikasyon liziz tamponu 40 mL pelet çözülür (% 10 gliserol, 10 mM magnezyum klorür, MgCI2, 150 mM NaCI, 10 mM Tris, pH 8.1) ve 0.1 g / L DNaz ile 30 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir. sus tedaviYıkama tampon maddesi 100 mL inklüzyon cisimcikleri (IB) 'şeklindeki proteinleri içeren emekli (% 0.5 Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8.1; 100 mM NaCI; 10 mM EDTA). 4 ° C'de 20 dakika ve 8000 x g'de santrifüj numunenin ve dikkatli bir şekilde Süpernatantı dökün. yeniden süspansiyon tamponu 100 ml pelet askıya-Re (100 mM NaCI, 50 mM Tris, pH 8,1 mM EDTA, pH 8.1 ve 10), bir santrifüj daha önce olduğu gibi 8000 xg, ve dikkatli bir şekilde Süpernatantı dökün. Son olarak, guanidin tampon maddesi 10 mL pelet çözülür (6 M guanidin, 50 mM Tris, pH 8.1; 2 mM EDTA, pH 8.1; 100 mM NaCI) ve bir spektrofotometre kullanılarak 280 nm'de protein konsantrasyonu ölçülür. 2. pHLA ve TCR tekrar katlanması pHLA refolds için, bir son hacim içinde, bir su banyosu içinde 37 ° C 'de IBS (bir biyotin etiketi ya da HLA-A2) β2m IB, 30 mg ve 30 dakika süre ile 4 mg peptit, HLA-A2 30 mg karıştırın 10 mM ditiotreitol ile takviye edilmiş guanidin tamponu 6 mL(DTT). önceden soğutulmuş bir HLA yeniden katlama tamponu, 1 L önceki karışımı seyrelterek, protein yeniden katlaması başlatma (50 mM Tris, pH 8.1; 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA, pH 8.1, 6 mM sisteamin ve 4 mM sistamin). HLA 3 saat boyunca 4 ° C de karıştırılarak yeniden katlama ve daha sonra bir 12.4 kDa'lık bir MWCO halinde (molekül ağırlığı kesme) diyaliz tüpü transfer 10 mM Tris, pH 8.1 20 L karşı 24 saat boyunca iki kez diyaliz bırakın. TCR refolds için, 10 mM DTT ile takviye edilmiş guanidin tamponu 6 mL bir su banyosu içinde 37 ° C 'de 30 dakika süre ile TCR α zinciri IB, 30 mg ve TCR β zinciri IB, 30 mg karıştırın. önceden soğutulmuş bir TCR yeniden katlama tamponu 1 L denatüre TCR karışımını, protein yeniden katlaması başlatma (50 mM Tris, pH 8.1; 2.5 M üre, ve 4 mM sistamin, 2 mM EDTA, pH 8.1;, 6 mM sisteamin) 3 h. 12.4-kDa'lık bir MWCO diyaliz tüpü içine katlanan aktarın ve 10 mM Tris, pH 8.1 20 L karşı 24 saat boyunca iki kez diyaliz. pHLA veya TCR ref hem Filtresaflaştırma adımları için 0.45 um'lik bir membran filtre kullanılarak yaş. Hızlı protein sıvı kromatografi ile 3. saflaştırma (FPLC) 7.9 ml üzerine süzüldü yeniden katlama preparasyonu (pHLA ya da TCR) yüklemek, 50 um anyon değişim reçine kolonu 10 mM Tris, esnek ve sezgisel kromatografi sistemi üzerindeki pH 8.1 20 mL önceden dengelenmiş. (8 sütun hacmi boyunca, 10 mM Tris içinde 0-500 mM NaCl, pH 8.1), bir tuz gradyanı ile 5 ml / dak proteinini ayrıştırmak ve 1 mL'lik kısımlar toplanır. birlikte ilgili proteini ihtiva eden fraksiyonlar havuzda SDS-PAGE ile, ilgilenilen proteine ​​karşılık gelen fraksiyonlar, analiz etmek ve 4.000 x g'de 20 dakika boyunca santrifüjleme ile 10 kDa ile 500 uL kadar bir MWCO 20 ya da 10 kDa'lık bir MWCO 4 aşağı konsantre , flow-through atarak. 24 ml boyut dışlama kromatografi kolonu üzerine 2 mL enjeksiyon döngüsü içine konsantre edildi proteini preparatları yük uygulama ile önceden dengelenmişropriate elüsyon tamponu: fosfat tamponlu salin (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM NaCI; 3.4 mM EDTA ve% 0.005 yüzeyaktif madde), veya kristal tamponu (10 mM Tris, pH 8.1 ve 10 mM NaCI ). 0.5 mL / dakika hacmi kolonu üzerinde 1 bir akış hızında proteinleri elüte; SDS-PAGE ile doğrulandı ilgili proteini ihtiva eden 1 ml'lik fraksiyonlar toplanır. Not: Bu yöntem çözünebilir PMEL17 TCR ve gp100 TCRler, hem de bu çalışmada kullanılan pHLAs her şekilde üretilmesi için kullanılmıştır: HLA-A * 0201 ile birlikte YLEPGPVTA (A2-yle), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1 a), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- Şekil 7A) veya YLEPGPVAA (A2-YLE-8A). 4. Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) Analizler Bir CM5 sensör çipi 19 ile donatılmış bir moleküler etkileşim analiz sistemi kullanılarak denge bağlayıcı analizi veya termodinamik analizi yapın. f CM5 çip etkinleştiriniyice silinir 1: 10 uL / ​​dakika akış hızında 25 ° 'de 10 dakika boyunca 100 mM N-hidroksisüksinimid (NHS) ve 400 mM 1-etil-3- (3-dimetil-propil) -carboiimide (EDC)' nin 1 karışımı C. dört akım-hücrelerinde çip yüzeyine bağlama ve devre dışı bırakmak için, 1 M etanolamin hidroklorid, 100 uL kullanımı kovalent yükü yaklaşık 5000 tepki ünitesinde (10 mM asetat, 200 ug 110 ul / ml, pH 4.5) (RU) streptavidin kalan reaktif gruplar. pHLA Birkaç yaklaşık 500-600 RU, 10 uL / ​​dakika yavaş bir akış hızında CM5 sensör çipine (üretici tarafından sağlanan), ticari tampon maddesi içinde ~ 1 uM, talaş yüzeyinde üniform dağılım sağlamak için. 60 saniye boyunca (üretici tarafından sağlanan) ticari tamponunda 1 mM biotin ile yonga yüzeyi doyurabilecek. 25 ° C'de 30 ul / dakikalık bir yüksek akış hızında ilgili akış hücreleri üzerinde çözünür TCRlerin on seri dilüsyonları enjekte edilir. denge bağlama sabitini hesaplamak(KD (e)), bir doğrusal olmayan eğri uyum (y = (P1x) / (P2 + x)) ile 20 değerleri kullanarak. NOT: y = tepki birimleri x = analist konsantrasyonu, P1 = r max, P2 = K D. 1 varsayarak kinetik analiz gerçekleştirin: bağlama 1 Langmuir ve yazılım paketinde 2 küresel-fit algoritması kullanarak veri uyar. 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C ve 30 ° C 19: Aşağıdaki sıcaklıklarda bu yöntemi tekrarlayarak termodinamik deneyleri gerçekleştirmek. Standart termodinamik denklemi (ΔG ° = -RTlnK D) 19 kullanılarak ° ΔG hesaplamak için farklı sıcaklıklarda SPR tarafından belirlenen K D değerleri kullanın. NOT: R = gaz sabiti, T K = sıcaklık, ln = doğal günlüğü. 19 – Gibbs-Helmholtz denklemi (TΔS ° ΔG ° = AH) göre termodinamik parametreleri hesaplayın. </li> (Üç parametreli denklem uygun bir lineer olmayan regresyon kullanılarak sıcaklığa karşı bağlanma serbest enerjileri, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK D), (k) Konu Y = Sh + ΔCp * (x-298) -X * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) 19. : X = ΔG ° K y = sıcaklığı. 5. İzotermal Titrasyon Kalorimetre (ITC) izotermal titrasyon kalorimetre kullanarak ITC deneyleri. şırıngaya Kalorimetre hücre ve yük 210 uM çözünür TCR'yi 30. uM pHLA enjekte edilir. 20 mM Hepes, 150 mM NaCI ihtiva eden (pH 7.4): Aşağıdaki tampon koşulları kullanın. 20 TCR enjeksiyonları, 2 mcL hacmi her gerçekleştirin. Analitik yazılımı kullanarak Sh ve K D hesaplayın. 6. Kristalleşme, Kırınım Veri Toplama ve Model Arıtma Bir kristalleşme robot kullanılarak kristalleşme denemeleri yapın. vap kristalleri büyürveya kristalleştirme tamponu, 60 ul (ana çözelti) 21 içeren bir rezervuar ile 96 oyuklu bir plaka içerisinde, kuluçka süresi, damla tekniği ile 18 ° C 'de difüzyon. 10 kDa molekül ağırlıklı bir kesim santrifüjlü konsantre 3000 xg'de eğirme kristal tamponu içinde yaklaşık olarak 10 mg / ml (0.2 mM) çözünür pHLA konsantre edilir. yaklaşık 10 mg / ml (0.1 mM) bir protein solüsyonu elde etmek için 1 mol oranında: CO-kompleks yapılar için, Bir 1 TCR ve pHLA karıştırın. 24 saat sonra, 48 saat, 72 sonra bir mikroskop altında kristalleri için TCR ve pHLA 1 mol oranı karışımı, bir kristalizasyon robot kullanılarak kristalleştirme ekranından Her rezervuar çözeltisi 200 nL ve skor: Tek başına 200 nL pHLA eklenir, ya da 1 H ve sonra haftada bir kez. El mikroskop altında cryo-döngüler onları monte edilerek hasat tek kristaller batış ve sıvı azot (100 K) saklayarak onları cryo-serin. NOT: Yükleme kristaller Uy biraz alırtice ve veri toplama için yeterince iyi olan kristalleri karar tecrübesi ile birlikte geliyor. Genel bir kural, daha büyük ve daha düzenli kristal, daha iyi olarak. 100 K azot gazı akımı verileri toplamak Not: Bu veriler Elmas Işık Kaynağı (DLS) İngiltere'de ulusal sinkrotron bilim tesisinde elde edildi. Her iki MOSFLM 22 kullanılarak xia2 ile yansıma yoğunlukları tahmin verileri analiz etmek ve XDS 23 paketleri ve daha sonra SCALA veya amaçsız 24 ve CCP4 paketinin 25 ile veri ölçeklendirme. Phaser 26 kullanılarak moleküler değiştirme ile yapıları çözün. Coot 27 modelini ayarlayın ve REFMAC5 28 modeli rafine. Pirol 29 ile grafik temsilleri hazırlayın. "Temas" seçeneğini kullanarak kişileri hesaplayınCCP4 paketinde programı. Van der Waals kişiler için 4 Å kesme ve hidrojen bağları ve tuz köprüleri için 3.4 Å cut-off kullanın. CCP4 paketinde "SC" programını kullanarak yüzey tamamlayıcılık hesaplayın. 30 tarif edildiği gibi, TCR-kompleksinin pHLA kesişme açısı hesaplanır. NOT: Bu çalışma için, yansıma verileri ve son modeli koordinatları PDB veritabanı tevdi edilmiştir (PMEL17 TCR-A2-yle-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-yle-3A PDB: 5EU4 ve A2 -YLE-5A PDB: 5EU5).

Representative Results

Yukarıda tarif edilen metotlar kullanılarak, CD8 + T hücreleri tarafından derinlemesine gp100 280-288 tanıma moleküler analizler yapmak için çözünür TCR'yi (Tablo 1) ve pHLA molekülleri üretilir. Bir tadil edilmiş E. coli sentezleme sistemi TCRler (α ve β zincirleri) ve pHLAs (α zinciri ve β2m) her ikisinin de, her bir ayrı zincir için çözünmeyen IBler üretmek için kullanıldı. Bu yöntem kurmak için nispeten ucuz ve kolay olma avantajına sahiptir ve protein büyük verim (kültürün 100-500 mg / L) üretir. -80 ° C'de saklanır, ayrıca, çözünmeyen proteinler, yüksek derecede kararlıdır. Daha sonra fonksiyonel homojen çözünebilir proteinlerin üretilmesi için iyi bilinen bir katlama ve saflaştırma tekniği kullanılır. Bu yöntem, teşhis ve tedavi için kullanılabilir, biyofiziksel yapısal ve hücresel deneylerde, hem de reaktif proteinlerin üretilmesi için faydalıdır. <p class="jove_content" fo:keep-together.within sayfa = "1"> Burada, peptid omurgası boyunca alanin tarama mutagenezi deneyler gerçekleştirmek için, bu proteinler, kullanılan ve yüzey plazmon rezonansı (SPR) deneyleri (Tablo 2) kullanılarak bağlanma afinitesi TCR değerlendirildi. peptid içinde kalıntıları ortaya Bu deney TCR bağlanması için en önemli idi. Yüksek çözünürlüklü bu tekniği kullanarak bağlanma afiniteleri analizleri çok, protein-protein etkileşimlerini kontrol biyolojik mekanizmaları belirlenmesi için yararlı, hem de terapötik moleküllerin bağlanma afinitesine analiz içindir. Daha sonra, atomik çözünürlükte (Şekiller 1 ve 2 ve Tablo 3) bağlanma modunu araştırmak için bir tadil edilmiş tümör kaynaklı pHLA (A2-YLE-9V) ile kompleks bir melanoma özgü çözünür TCR'yi (PMEL17 TCR) kristalleştirildi. Bu deneyler, iki moleküller arasındaki bağlanma arayüzü doğrudan görselleştirme sağlamak, providinetkileşimi yöneten temel prensipleri hakkında g anahtarı bilgileri. Biz daha (Şekil 3) bağlayıcı etkin enerjik katkıları açığa SPR ve ITC her ikisini de kullanarak etkileşim termodinamik analizini yaptılar. Bu analizler ayrıca iki protein (Şekil 4 ve Tablo 4) arasındaki temas ayak izi yüksek çözünürlüklü açıklaması ile desteklenmiştir. Sonra bir moleküler anahtar açıklayabilir ortaya koyan, peptit mutasyona uğramış formları sunulması, bağlanmamış pHLA moleküllerin yapılarını çözüldü neden bağlayıcı TCR iptal bazı mutasyonlar (Şekil 5). Genel olarak, bu teknikler, T-hücreleri anti-kanser tedavi için önemli bir hedeftir Melanom türevli bir antijeni tanıyan açıklayan bir mekanizmayı ortaya koyan, yeni veriler elde edilmiştir. Daha geniş anlamda, bu teknikleryeni terapötik gelişmeler için hedeflenen olabilir yeni biyolojik mekanizmaları açığa çıkarmak, hemen her reseptör-ligand etkileşimi araştırmak için kullanılabilir. Şekil 1: Yoğunluk Plot Analizi. Sol sütunda gösterileri modeli peptid yokluğunda rafine edildiği haritalar ihmal. Fark yoğunluğu 3.0 sigma de konturlu olduğu, olumlu kontür yeşil gösterilir ve negatif kontür kırmızı vardır. sağ sütun REFMAC5 tarafından uygulanan otomatik olmayan kristalografik simetri koltuk kullanarak sonraki arıtma sonra (protein zincirlerinin sopa temsilleri etrafında gri bir örgü olarak gösterilen) 1.0 sigma de gözlenen haritasını gösterir. (A) TCR CDR3 ile PMEL17 TCR-A2-yle-9V modeli renkli mavi (α zinciri) ve turuncu (β zinciri) ve yeşil peptid döngüler. (B) A2-YLE modeli ilepeptid koyu yeşil renkli. (C), A2-yle 3A peptid turuncu renkli A2-yle 3A modeli (orada asimetrik birim içinde 2 molekülü, ancak bu omit ve yoğunluk haritaları açısından hemen hemen aynıdır, böylece sadece 1 kopya ) burada gösterilir. (D) peptid renkli pembe A2-yle-5A modeli. Referans 31 izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2: A2-yle-9V ile Kompleksi'nde PMEL17 TCR bakış. PMEL17 TCR-A2-yle-9V kompleksi (A) Çizgi gösterimi. TCR siyah renkli; koyu yeşil, CDR2α;; TCR CDR döngüler (kırmızı, CDR1α gösterilmiştir mavi, CDR3α, sarı, CDR1β; aqua, CDR2 ^6 ;; turuncu, CDR3β); ve HLA-A * 0201, gri tasvir edilmiştir. YLE-9V peptid yeşil sopalarla tarafından temsil edilmektedir. (; Yle-9V, yeşil sopalarla A2, gri) PMEL17 TCR CDR kalıntılarının (B) Yüzey ve sopa temsilleri (A gibi renk kodlu) A2-YLE yüzeye temas olduğunu döngüler. Siyah çapraz çizgi YLEPGPVTV peptid (46.15 °) uzun eksenine göre TCR'nin kesişme açısını gösterir. (C) A2-yle-9V yüzeyinde PMEL17 TCR (A2, gri) İletişim ayak izi; mor ve yeşil (yüzey ve sopalarla), HLA-A * 0201 gösterir ve yle kalıntıları, sırasıyla gp100 TCR tarafından temasa geçti. Cut-off hidrojen bağları için 3.4 Å ve van der Waals kişiler için 4 Å. Referans 31. izniyle bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt = "Şekil 3" src = "/ files / ftp_upload / 54991 / 54991fig3.jpg" /> Şekil 3: PMEL17 TCR-A2-YLE Etkileşim Termodinamik Analizi. (A) PMEL17 TCR denge bağlayıcı, 18, 12, 5 de 25 A2-YLE yanıtlarını ve on TCR seri seyreltme ile dokuz arasında 37 ° C. Her eğrinin yerleşsin gösterilir ve küresel-fit algoritma (BIAevaluation 3.1) kullanılarak ve K off değerleri üzerinde K hesaplamak için kullanılmıştır: SPR ham ve monte veri (Langmuir bağlanma 1 1 varsayarak). Tablo denge bağlayıcı gösterir (KD (e)) ve kinetik bağlanma sabitleri (KD (K) = K kapalı / K), her ilave edildi. Sabit denge bağlanma (Kd, uM) değerleri lineer olmayan uyum kullanılarak hesaplanmıştır (y = (P1x) / (P2 + x)). (B) termodinamik parametreler Gibbs Helmholtz denklemine göre hesaplanmıştır (ΔG ° = Sh ° – TΔS °). bağlayıcı serbest enerjileri, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK D), sıcaklığa karşı grafiğe geçirildi (K) üç parametre denklemi sığdırmak için doğrusal olmayan regresyon (y = Sh ° + ΔCp ° * (x-298) -X * ΔS ° -x * ΔCp ° * ln (x / 298)). 298 K (25 ° C) entalpi (AH °) ve entropi (TΔS °) kilokalori / mol gösterilir ve sıcaklık, (K) içindeki bir lineer olmayan regresyon kullanılarak hesaplandı serbest enerji karşı çizilen (ΔG °). PMEL17 TCR-A2-YLE etkileşim için (C) izotermal Kalorimetre titrasyon (ITC) ölçümleri. 298 K (25 ° C) Entalpi (AH °) ve entropi (TΔS °) kcal / mol gösterilmiştir. Referans 31 izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <str ong> Şekil 4: Peptid Kalıntı Pro4, Val7 ve Thr8 üzerinde PMEL17 CDR Döngüler Odak. (A) yle-9V peptid ve PMEL17 CDR halka artıkları arasındaki temasların şematik gösterimi (Şekil 2A gibi renk kodlu). Panelin alt kısmındaki sayılar TCR ve peptid arasındaki toplam kişileri gösterir. (B) PMEL17 TCR ve van der gösteren yle-9V peptid (yeşil çubukları) arasındaki İletişim Waals kişiler (siyah kesikli çizgiler) ve TCR CDR3α (mavi) tarafından yapılan hidrojen bağları (kırmızı kesik çizgiler), CDR1β (sarı) , CDR2β (aqua) ve CDR3β (turuncu) döngüler. alt panelde YLE Pro4, Val7 ve Thr8 arasındaki temasların yakın bir görünüm sırasıyla, ve TCR CDR halka kalıntıları (renk Şekil 1A olarak kodlanmıştır çubukları). Cut-off hidrojen bağları için 3.4 Å ve van der Waals kişiler için 4 Å. Referans 31 izniyle.rge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 5: HLA-A * 0201 tarafından sunulan YLE, İle-3A konformasyonel karşılaştırması ve A2-yle-5A Peptides. (A) yle (koyu yeşil sopa) ve YLE-3A (turuncu sopa) HLA-A üst üste * 0201 α1 sarmal (gri karikatür) tarafından peptit hizalama. Kutulu tortuları alanin içine Glu3 mutasyon göstermektedir. insets Glu3Ala ikame A2-YLE yapıya göre A2-yle-3A yapısında komşu kalıntı Pro4 konumunda bir kayma (siyah ok) neden nasıl gösterir. (B) yle (koyu yeşil sopa) ve YLE-5A (pembe sopa) HLA-A * 0201 α1 sarmal (gri karikatür) üst üste peptid hizalama. Kutulu tortuları alanin halinde glisin 5 mutasyonu gösterir. referans izniyle <sup> 31. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. TCR CDR1α CDR2α CDR3α CDR1β CDR1β CDR1β PMEL17 DSAIYN IQSSQRE CAVLSSGGSNYKLTFG SGHTA FQGTGA CASSFIGGTDTQYFG gp100 TSINN IRSNERE CATDGDTPLVFG LNHDA SQIVND CASSIGGPYEQYFG <strong> MPD KALYS LLKGGEQ CGTETNTGNQFYFG SGHDY FNNNVP CASSLGRYNEQFFG 296 DSASNY IRSNVGE CAASTSGGTSYGKLTFG MNHEY SMNVEV CASSLGSSYEQYFG Tablo 1: TCR CDR3 PMEL17 Bölgeleri, gp100, MPD ve 296 gp100-özgü TCRlerin hizalanması. Referans 31 izniyle. Peptit sekansı, peptit PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 Affinity K D gp100 TCR TRAV17 TRBV19 Affidilmekte K D YLEPGPVTA YLE 7.6 ± 2 uM 26.5 ± 2.3 uM YLEPGPVT V YLE-9V 6.3 ± 1.2 uM 21.9 ± 2.4 uM bir LEPGPVTA Yle-1A 15.9 ± 4.1 uM 60.6 ± 5.4 uM YL A PGPVTA Yle-3A hiçbir bağlayıcı hiçbir bağlayıcı YLE A GPVTA Yle-4A 19.7 ± 1.3 uM 144.1 ± 7.8 uM YLEP bir PVTA Yle-5A > 1 mM > 1mM YLEPG A VTA Yle-6A 11.4 ± 2.7 uM 954,9 ± 97,8 uM </tr> YLEPGP A TA Yle-7A 31.1 ± 4 uM 102.0 ± 9.2 uM YLEPGPV A Yle-8A 38.1 ± 7.4 uM 121.0 ± 7.5 uM Tablo 2: PMEL17 TCR'nin Afinite Analizi (KD) ve gp100 TCR 280-288 peptit türevlerini gp100 için. Referans 31 izniyle. parametreler PMEL17 TCR-A2-yle-9V A2-yle A2-yle-3A A2-yle-5A PDB kodu </strong> 5EU6 5EU3 5EU4 5EU5 Veri kümesi istatistikler Uzay grubu P1 P1 21 1 P1 P1 21 1 Birim hücre parametreleri (a) a = 45.52, b = 54.41, c = 112,12, a = 85.0 °, b = 81.6 °, g = 72.6 ° a = 52.81, b = 80,37, c = 56.06, b = 112.8 ° a = 56.08, b = 57,63, c = 79,93, a = 90.0 °, b = 89.8 °, g = 63.8 ° a = 56.33, b = 79,64, c = 57.74, b = 116,2 ° Radyasyon kaynağı DIAMOND I03 DIAMOND I03 DIAMOND I02 DIAMOND I02 Dalga boyu (A) 0,9763 0,9999 0,9763 0,9763 measuKırmızı çözünürlük aralığı (Å) 51,87-2,02 45,25-1,97 43,39-2,12 43,42-1,54 Dış Çözünürlük Kabuk (Å) 2,07-2,02 2,02-1,97 2,18-2,12 1,58-154 Yansıma gözlenen 128.191 (8.955) 99.442 (7056) 99.386 (7463) 244.577 (17.745) benzersiz yansımalar 64.983 (4.785) 30.103 (2.249) 49.667 (3.636) 67.308 (4.962) Bütünlük (%) 97.7 (96.7) 98.5 (99.3) 97.4 (96.7) 99.6 (99.9) çokluk 2.0 (1.9) 3.3 (3.1) 2,0 (2.1) 3.6 (3.6) I / (Sigma I) 'in 5.5 (1.9) 7.2 (1.9) 6.7 (20,3) 13 (2.3) Rpim (%) 5.7 (39.8) 8.8 (44.7) 8.7 (41.6) 4,5 (35.4) R birleştirme (%) 7.8 (39.6) 9.8 (50.2) 8.7 (41.6) 5.0 (53.2) Arıtma istatistikleri Çözünürlük (Å) 2.02 1.97 2.12 1.54 kullanılmadı yansımalar 61688 28557 47153 63875 Rfree sette hiçbir yansıması 3294 1526 2514 3406 R cryst (hiçbir kesme) (%) 18.1 19.7 17.2 17.0 R ücretsiz 22.2 25.5 210,1 20.1 Kök İdeal geometriden kare sapma Bağ uzunlukları (Å) 0.018 (0.019) * 0.019 (0.019) * 0.021 (0.019) * 0.018 (0.019) * Bağ açıları (°) 1,964 (1,939) * 1,961 (1,926) * 2,067 (1,927) * 1,914 (1,936) * Genel hata (Å) koordinat 0.122 0.153 0.147 0,055 Ramachandran istatistikleri en Beğenilen 791 (% 96) 371 (% 98) 749 (% 99) 384 (% 98) İzin 32 (% 4) 6 (% 2) 10 (% 1) 5 (% 1) Aykırı 2 (% 0) 3 (% 1) 1 (% 0) 2 (% 0) Tablo 3: Veri Azaltma ve Arıtma İstatistikleri (moleküler değiştirme). Referans 31 izniyle. Parantez içindeki değerler en yüksek çözünürlük kabuk içindir. HLA / peptit Tortu TCR kalıntısı Hayır VDW (≤ 4A) No. H-bağları (≤3.4Å) Gly62 αGly98 3 αSer99 1 Arg65 αSer99 2 <td> Arg65 O αAsn100 Nδ2 2 1 Arg65 NH1 βAsp58 Oδ2 1 βSer59 8 Lys66 αGly98 1 αSer99 4 αAsn100 4 Ala69 αAsn100 2 βAla56 2 Gln72 Nε2 βGln51 O 3 1 βGly54 7 βAla55 1 <td> Thr73 βGln51 1 Val76 βGln51 3 βGly52 2 Lys146 βPhe97 3 βIle98 3 Ala150 βIle98 1 βAsp102 3 Val152 βIle98 1 Glu154 αTyr32 1 Gln155 N αTyr32 OH 4 1 Gln155 Oε1 βThr101 N 10 1 <tr> Tyr1 OH αGly97 Ç 1 1 αGly98 1 αSer96 1 Glu3 αTyr101 1 Pro4 αSer96 1 αSer99 1 αAsn100 4 Pro4 O αTyr101 N 14 1 Gly5 αTyr101 3 βGly100 2 Val7 βIle98 7 βGly99 2 βGly100 2 Thr8 βThr31 5 βGln51 1 βPhe97 1 Thr8 N βIle98 O 6 1 Tablo 4: PMEL17 TCR-A2-yle-9V İletişim Tablosu. Referans 31 izniyle.

Discussion

Burada belirtilen protokoller herhangi bir insan hastalığı bağlamında T-hücresi tepkilerinin, moleküler ve hücresel diseksiyon için bir çerçeve sağlar. Kanser Bu çalışmanın ana odak olmasına rağmen, biz virüs 32, 33, 34, 35, T-hücresi tepkilerini araştırmak için çok benzer yaklaşımlar kullanmışlardır 36, 37 ve otoimmünite 38, 39, 40 döneminde. Ayrıca, T-hücresi antijen tanıma 2, 19, 41, 42 yöneten moleküler ilkelerini anlamak için daha geniş bu teknikleri kullandık. Gerçekten de, modifikasyonların öngörülemeyen doğası, hatta kalıntıları peptidTCR temas artıkları dışında, etkileri T-hücre tanıma heteroklitik peptidler tasarımı için önemli etkileri vardır. Bu bulgular doğrudan gelişmiş teşhis 45, 46, 47, yanı sıra peptit aşılarının 6, 43 ve yapay yüksek afiniteli TCR'Irin 3, 4, 5, 20, 44 de dahil olmak üzere, yeni T-hücre tedavilerinin geliştirilmesine katkıda bulunmuştur.

protokolü içinde kritik adımlar
yüksek ölçüde saf bir fonksiyonel protein üretimi bu dokümanda belirtilen yöntemlerin tümü için gereklidir.

Değişiklikler ve sorun giderme
yüksek ölçüde saf protein üreten güçlükler çoğu kez yüksek ekspresyonu ile ilgilidir-Saf E. coli sentezleme sistemi için çözünmeyen IBler. Genellikle, ifade protokolü (örneğin, farklı E.coli suşları kullanılarak, farklı optik yoğunluklarda uyarılması veya farklı medya oluşumları kullanarak) modifiye bu sorunları çözer.

tekniğin sınırlamaları
Bu teknikler, normal olarak hücre yüzeyinde ifade edilir çözünür protein molekülleri (TCR ve pHLA) kullanın. Böylece, yapısal / biyofizik bulgular biyolojik önemini teyit etmek için hücresel yaklaşımlar ile tutarlı olmasını sağlamak için önemlidir.

Mevcut / alternatif yöntemlere göre tekniğin önemi
X-ışını kristalografisi ve fonksiyonel analiz ile ispat biyofizik kullanımı sayesinde, biz ve diğerleri, kanser epitoplarına için TCR'ler özgü genellikle düşük bağlanma ilgisi 48 ile karakterize olduğunu göstermiştir. Bu düşük TCR afinite T hücreleri ar açıklamaya yardımcı olabilirE kanseri temizlenmesi de doğal olarak etkili değildir. anti-kanser TCR'lerinin ve soydaş tümör antijenleri arasındaki komplekslerin yüksek çözünürlüklü atomik yapıları bu zayıf afinite moleküler temelini ortaya çıkarmak için başlıyor. Ayrıca, bu çalışmalar gelecekteki gelişmeler 16 ekim, bu sorunu aşmak için tasarlanmış terapötik girişimlerin altında yatan mekanizmaları belirlemek için faydalıdır. Bu çalışmada, bir gp100, HLA-A * 0201 kısıtlı melanom epitopu kompleks bir doğal olarak meydana gelen αβTCR ilk yapısı incelenmiştir. derinlemesine bir biyofiziksel muayene ile kombine yapısı, etkileşim genel bağlayıcı modu saptandı. Ayrıca ve CD8 + T-hücresi tanımayı (fonksiyonel deneyler) (yüzey plasmon rezonansı kullanılarak değerlendirildi) bağlanma TCR iptal peptidin mutasyona uğramış bir biçimde meydana gelen beklenmedik bir molekül anahtarı, ortaya çıkardı. HLA antijeni presentati bu yeni mekanizma göstermek mümkün olmuşturaçıklanan yüksek çözünürlüklü yöntemleri kullanarak.

Bu tekniği mastering sonra gelecek uygulamalar veya yön
sağlam, fonksiyonel analizler ile kombine edildiğinde Genel olarak, bizim sonuçlar X-ışını kristalografisi ve biyofizik yöntemlerin gücünü göstermek. Bu yaklaşımları kullanarak, T-hücresi antijen tanıma yöneten kesin moleküler mekanizmalar teşrih etmek mümkündür. Gerçekten de, biçim alma değişiklikleri, antijen ayrım 49, 50, 51 boyunca bir rol oynasa gösteren bağlanmamış TCRlerin yapısını çözmek için bu yaklaşım kullanmak da mümkündür. TCR-pHLA etkileşimleri destekleyen son derece karmaşık ve dinamik doğasının daha iyi anlaşılması da tedavi tasarımı için bariz etkileri vardır. doğrudan değişiklikler antijen recognitio var terapötik hedef alınmaktadır molekülleri yanı sıra etkisi "görmek" için güçlü olmakn, açıkça ileriye dönük bu ilaçların geliştirilmesini artıracaktır. Bu çalışmada, yoğun bir TCR ile birleşmeyen tek bir peptid artığı da değişiklikler tahmin edilemeyecek da, önemli ölçüde T-hücresi tanımayı değiştirir, HLA bağlı peptid, diğer kalıntısı elde etmek, yapısal değişiklikler iletebilir göstermektedir. insan hastalıklarının geniş bir aralığı için gelecekteki terapiler tasarımı T hücresi antijen tanıma sırasında kullanılan moleküler mekanizmalar daha tam olarak anlaşılması, oldukça faydalı olacaktır.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

BM Kanser Research UK Doktora öğrencilik tarafından desteklenmektedir. AG, bir Yaşam Bilimleri Araştırma Ağı Galler Doktora öğrencilik tarafından desteklenmektedir. VB Kanser Araştırma Galler Doktora öğrencilik tarafından desteklenmektedir. DKC bir Wellcome Trust Araştırma Kariyer Geliştirme Görevlisi (WT095767) 'dir. AKS, Wellcome Trust Araştırmacı olduğunu. YHİ ortak Yaşam Bilimleri Araştırma Ağı Galler ve Tenovus Cancer Care Doktora Bursu tarafından finanse edilmektedir. Biz tesisleri ve destek sağlamak için Elmas Işık Kaynağı kadroyla teşekkür ederiz.

Materials

S.O.C. media Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit incubator Sanyo
carbenicillin  Sigma
IPTG  Fisher
Quick Coomassie Stain SafeStain  Generon
Legend RT centrifuge  Sorvall
Tris  Fisher
magnesium chloride  Arcos
NaCl  Fisher
glycerol  Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070  Bandelin
DNAse  Fisher
Triton Sigma-Aldrich
EDTA  Fisher
guanidine  Fisher
NanoDrop ND1000  Thermo
Peptides Peptide Protein Research
dithiothreitol  Sigma-Aldrich
L-arginine  SAFC
cysteamine  Fisher
cystamine  Fisher
dialysis tubing  Sigma-Aldrich
urea  Sigma-Aldrich
Metricel 0.45 μm membrane filter Pall
POROS 10/100 HQ  Applied biosystems
ÄKTA pure FPLC system  GE Healthcare Life Sciences
10 kDa MWCO Vivaspin 20  Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4  Sartorius
Superdex 200 10/300 GL column  GE Healthcare Life Sciences
Phosphate Buffer Saline  Oxoid
BIAcore buffer HBS  GE Healthcare Life Sciences
Biotinylation kit Avidity
BIAcore T200 GE Healthcare Life Sciences
CM5 chip coupling kit GE Healthcare Life Sciences
streptavidin  Sigma-Aldrich
Microcal VP-ITC  GE Healthcare Life Sciences
Hepes  Sigma-Aldrich
Gryphon crystallisation robot Art Robbins Instruments
Intelli-plate  Art Robbins Instruments
Crystallisation screens and reagents Molecular Dimensions
75 cm2 flask  Greiner Bio-One
0.22 μm filters Miller-GP, Millipore
Ultra-Clear ultracentrifuge tube  Beckman Coulter
Optima L-100 XP with SW28 rotor Beckman Coulter
CD8 microbeads  Miltenyi Biotec
anti-CD3/CD28 Dynabeads  Invitrogen
anti-PE microbeads  Miltenyi Biotec
CK medium, PHA Alere Ltd
anti-TCRVβ mAb  BD
dasatinib  Axon
MIP-1β and TNFα ELISA  R&D Systems
 51Cr  PerkinElmer
1450 Microbeta counter PerkinElmer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aleksic, M., Liddy, N., et al. Different affinity windows for virus and cancer-specific T-cell receptors: implications for therapeutic strategies. European journal of immunology. 42 (12), 3174-3179 (2012).
  2. Cole, D. K., Pumphrey, N. J., et al. Human TCR-binding affinity is governed by MHC class restriction. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 178 (9), 5727-5734 (2007).
  3. Cole, D. K., Sami, M., et al. Increased Peptide Contacts Govern High Affinity Binding of a Modified TCR Whilst Maintaining a Native pMHC Docking Mode. Frontiers in immunology. 4 (JUN), 168 (2013).
  4. Raman, M. C. C., Rizkallah, P. J., et al. Direct molecular mimicry enables off-target cardiovascular toxicity by an enhanced affinity TCR designed for cancer immunotherapy. Scientific reports. 6, 18851 (2016).
  5. Liddy, N., Bossi, G., et al. Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nature medicine. 18 (6), 980-987 (2012).
  6. Cole, D. K., Edwards, E. S. J., et al. Modification of MHC anchor residues generates heteroclitic peptides that alter TCR binding and T cell recognition. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 185 (4), 2600-2610 (2010).
  7. Parkhurst, M. R., Salgaller, M. L., et al. Improved induction of melanoma-reactive CTL with peptides from the melanoma antigen gp100 modified at HLA-A*0201-binding residues. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (6), 2539-2548 (1996).
  8. Salgaller, M. L., Marincola, F. M., Cormier, J. N., Rosenberg, S. A. Immunization against epitopes in the human melanoma antigen gp100 following patient immunization with synthetic peptides. Cancer research. 56 (20), 4749-4757 (1996).
  9. Cameron, B. J., Gerry, A. B., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science translational medicine. 5 (197), 197ra103 (2013).
  10. Linette, G. P., Stadtmauer, E. A., et al. Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity of affinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma. Blood. 122 (6), 863-871 (2013).
  11. Miles, K. M., Miles, J. J., Madura, F., Sewell, A. K., Cole, D. K. Real time detection of peptide-MHC dissociation reveals that improvement of primary MHC-binding residues can have a minimal, or no, effect on stability. Molecular immunology. 48 (4), 728-732 (2011).
  12. Lesterhuis, W. J., Schreibelt, G., et al. Wild-type and modified gp100 peptide-pulsed dendritic cell vaccination of advanced melanoma patients can lead to long-term clinical responses independent of the peptide used. Cancer immunology, immunotherapy CII. 60 (2), 249-260 (2011).
  13. Speiser, D. E., Baumgaertner, P., et al. Unmodified self antigen triggers human CD8 T cells with stronger tumor reactivity than altered antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (10), 3849-3854 (2008).
  14. Schaft, N., Willemsen, R. A., et al. Peptide fine specificity of anti-glycoprotein 100 CTL is preserved following transfer of engineered TCR alpha beta genes into primary human T lymphocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 170 (4), 2186-2194 (2003).
  15. Schaft, N., Coccoris, M., et al. An Altered gp100 Peptide Ligand with Decreased Binding by TCR and CD8α Dissects T Cell Cytotoxicity from Production of Cytokines and Activation of NFAT. Frontiers in immunology. 4 (SEP), 270 (2013).
  16. Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. Structural basis for ineffective T-cell responses to MHC anchor residue-improved "heteroclitic" peptides. European journal of immunology. 45 (2), 584-591 (2015).
  17. Boulter, J. M., Glick, M., et al. Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein engineering. 16 (9), 707-711 (2003).
  18. Garboczi, D. N., Utz, U., et al. Assembly, specific binding, and crystallization of a human TCR-alphabeta with an antigenic Tax peptide from human T lymphotropic virus type 1 and the class I MHC molecule HLA-A2. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (12), 5403-5410 (1996).
  19. Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. T-cell receptor specificity maintained by altered thermodynamics. Journal of Biological Chemistry. 288 (26), 18766-18775 (2013).
  20. Cole, D. K., Rizkallah, P. J., et al. Computational design and crystal structure of an enhanced affinity mutant human CD8 alphaalpha coreceptor. Proteins: Structure, Function and Genetics. 67 (1), 65-74 (2007).
  21. Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature protocols. 2 (7), 1633-1651 (2007).
  22. Leslie, A. G. W., Powell, H. R., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data – a generic approach. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (11), 1924-1928 (2002).
  23. Kabsch, W. Xds. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  24. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution?. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  25. Bailey, S. N. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
  26. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  27. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (12 I), 2126-2132 (2004).
  28. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (3), 240-255 (1997).
  29. Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How Tcrs Bind Mhcs, Peptides, and Coreceptors. Annual Review of Immunology. 24 (1), 419-466 (2006).
  30. Bianchi, V., Bulek, A., et al. A Molecular Switch Abrogates Glycoprotein 100 (gp100) T-cell Receptor (TCR) Targeting of a Human Melanoma Antigen. Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8951-8959 (2016).
  31. Matthews, P. C., Koyanagi, M., et al. Differential clade-specific HLA-B*3501 association with HIV-1 disease outcome is linked to immunogenicity of a single Gag epitope. Journal of virology. 86 (23), 12643-12654 (2012).
  32. Gostick, E., Cole, D. K., et al. Functional and biophysical characterization of an HLA-A* 6801-restricted HIV-specific T cell receptor. European Journal of Immunology. 37 (2), 479-486 (2007).
  33. Miles, J. J., Bulek, A. M., et al. Genetic and structural basis for selection of a ubiquitous T cell receptor deployed in Epstein-Barr virus infection. PLoS Pathogens. 6 (11), e1001198 (2010).
  34. Holland, C. J., Rizkallah, P. J., et al. Minimal conformational plasticity enables TCR cross-reactivity to different MHC class II heterodimers. Scientific reports. 2, 629 (2012).
  35. Kløverpris, H. N., Cole, D. K., et al. A molecular switch in immunodominant HIV-1-specific CD8 T-cell epitopes shapes differential HLA-restricted escape. Retrovirology. 12, 20 (2015).
  36. Motozono, C., Kuse, N., et al. Molecular Basis of a Dominant T Cell Response to an HIV Reverse Transcriptase 8-mer Epitope Presented by the Protective Allele HLA-B*51:01. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 192 (7), 3428-3434 (2014).
  37. Motozono, C., Pearson, J. A., et al. Distortion of the major histocompatibility complex class i binding groove to accommodate an insulin-derived 10-mer peptide. Journal of Biological Chemistry. 290 (31), 18924-18933 (2015).
  38. Cole, D. K., Bulek, A. M., et al. Hotspot autoimmune T cell receptor binding underlies pathogen and insulin peptide cross-reactivity. The Journal of clinical investigation. , (2016).
  39. Bulek, A. M., Cole, D. K., et al. Structural basis for the killing of human beta cells by CD8(+) T cells in type 1 diabetes. Nature immunology. 13 (3), 283-289 (2012).
  40. Ekeruche-Makinde, J., Clement, M., et al. T-cell receptor-optimized peptide skewing of the T-cell repertoire can enhance antigen targeting. Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37269-37281 (2012).
  41. Cole, D. K., Miles, K. M., et al. T-cell Receptor (TCR)-peptide specificity overrides affinity-enhancing TCR-major histocompatibility complex interactions. Journal of Biological Chemistry. 289 (2), 628-638 (2014).
  42. Cole, D. K., Gallagher, K., et al. Modification of the carboxy-terminal flanking region of a universal influenza epitope alters CD4+ T-cell repertoire selection. Nature communications. 3, 665 (2012).
  43. Varela-Rohena, A., Molloy, P. E., et al. Control of HIV-1 immune escape by CD8 T cells expressing enhanced T-cell receptor. Nature medicine. 14 (12), 1390-1395 (2008).
  44. Holland, C. J., Dolton, G., et al. Enhanced Detection of Antigen-Specific CD4+ T Cells Using Altered Peptide Flanking Residue Peptide-MHC Class II Multimers. The Journal of Immunology. 195 (12), 5827-5836 (2015).
  45. Wooldridge, L., Clement, M., et al. MHC class I molecules with Superenhanced CD8 binding properties bypass the requirement for cognate TCR recognition and nonspecifically activate CTLs. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 184 (7), 3357-3366 (2010).
  46. Laugel, B., Den Berg, H. A. V. a. n., et al. Different T cell receptor affinity thresholds and CD8 coreceptor dependence govern cytotoxic T lymphocyte activation and tetramer binding properties. Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 23799-23810 (2007).
  47. Bridgeman, J. S., Sewell, A. K., Miles, J. J., Price, D. A., Cole, D. K. Structural and biophysical determinants of αβ T-cell antigen recognition. Immunology. 135 (1), 9-18 (2012).
  48. Willcox, B. E., Gao, G. F., et al. TCR binding to peptide-MHC stabilizes a flexible recognition interface. Immunity. 10 (3), 357-365 (1999).
  49. Borbulevych, O. Y., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational melding permits a conserved binding geometry in TCR recognition of foreign and self molecular mimics. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 186 (5), 2950-2958 (2011).
  50. Armstrong, K. M., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational changes and flexibility in T-cell receptor recognition of peptide-MHC complexes. The Biochemical journal. 415 (2), 183-196 (2008).

Tags

X-ray CrystallographyBiophysicsFunctional AssaysT-cell ReceptorCancer AntigensT-cell ImmunologyReceptor-ligand InteractionsProtein RefoldingHLABeta 2-MTCR Alpha/beta ChainsAnion Exchange ChromatographyStructural AnalysisBiophysical AnalysisImmune ResponsesTherapyDiagnosis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
MacLachlan, B. J., Greenshields-Watson, A., Mason, G. H., Schauenburg, A. J., Bianchi, V., Rizkallah, P. J., Sewell, A. K., Fuller, A., Cole, D. K. Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens. J. Vis. Exp. (120), e54991, doi:10.3791/54991 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image