Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi<em> İn Vitro</em> Sistem
Summary
Bu protokol ortam havası partiküler madde ile tedaviden sonra RAW264.7 fare makrofajlar in vitro ölçümü ve kromozomal anomaliler karakterizasyonu için teknikleri açıklar.
Abstract
partiküler madde (PM) maruz kalma nükleer genetik materyalin dahil olmak üzere çeşitli hücresel bileşenleri, zarar verebilir önemli bir dünya sağlık sorunu vardır. Nükleer genetik bütünlüğü üzerindeki PM etkisini değerlendirmek için, yapısal kromozom bozuklukları fare RAW264.7 makrofaj hücrelerinin metafaz mamulünün puanlanır. PM yüksek hacimli toplam askıda partiküller örnekleyici ile ortam havasından toplanır. Toplanan malzeme çözünebilir ve suda çözünür ince kısmı tutmak için filtre edilir. partiküller, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi ile kimyasal bileşim açısından karakterize edilir. Parçacık süspansiyonu farklı konsantrasyonları muamele edilmemiş kontrol hücreleri ile birlikte, 72 saatlik bir toplam maruz kalma süresi için RAW264.7 fare makrofaj bir in vitro kültürü üzerine ilave edilir. Temas süresi sonunda, kültür metafaz hücreleri yakalama colcemid ile işlenir. Daha sonra hücreler toplandı, acetomethanol sabit hipotonik çözelti, D ile muamele edilirCam slaytlar üzerine ropped ve son olarak Giemsa çözeltisi ile boyandı. Slaytlar parlak alan mikroskobu kullanılarak 1,000X büyütmede metafaz yayılır yapısal kromozom sapmaları (CA) değerlendirmek için incelenir. 50 ila 100 metafaz yayılımı, her tedavi grubu için puan verilir. Bu teknik kromatid tipi tatili, chromatid tipi alışverişi, acentric parçaları, disentrik ve halka kromozomlar, çift dakika endoreduplication ve PM maruz kaldıktan sonra in vitro Robertsonian translokasyonları gibi yapısal kromozomal anomaliler (CA), tespiti için uyarlanmıştır. Epigenetik değişikliklere köklü bir sitogenetik uç noktasını ilişkilendirmek için güçlü bir yöntemdir.
Introduction
Partikül madde (PM) maruz kalma öncelikle kardiyopulmoner hastalığı ve akciğer kanseri 1 yılda 3 milyondan fazla aşırı ölümlere neden olması tahmin edilmektedir. PM maruz kalma seviyeleri arttıkça akciğer kanseri riski 2 gösterilmiştir Nitekim, PM, Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı (Grup 1) ile insanlarda kansere olarak tanındı. İlginç bir şekilde, hemen hemen tüm kanser hücrelerinin sayısal ve / veya yapısal kromozom anomalileri liman. Partikül organik karbon, terkibi ve boyut dağılımı emisyonları ve fiziksel ve kimyasal dönüşümler bağlı olan bir varyantı, karmaşık ve heterojen karışım vardır. Bu 35-55 (boyutunda PM 2.5 mikron ve daha küçük) kentsel PM 2.5 kütlesinin% kırsal ve kıta arka plan PM 2.5 kütle 3, 4 den fazla% 60 oluşturmaktadır. suda çözünen fraksiyon organik aerosol 30-90% oluşturmaktadır. Organik bileşiklerin büyük bir kısmıalifatik hidrokarbonlar, poliaromatik hidrokarbonlar ve bunların oksijenli nitratlı türevlerini, alifatik aldehitler ve alkoller, serbest yağ asitleri ve bunların tuzları, di-karboksilik asitler, çok fonksiyonlu bileşikler, proteinler, ve hümik benzeri makromoleküller (HULIS) kullanılması dahil olmak üzere tespit edilmiştir kütle spektrometrik teknikleri 5-8 ile birleştiğinde kromatografik yöntemler. Bu nedenle bu bileşikler, organik karbonun çoğu 9 bilinmemektedir, parçacık halinde organik karbon az% 10-20 temsil etmektedir.
Deneysel kanıtlar, sitotoksisite, oksidatif stres ve enflamasyon PM ile ilişkili patolojik durumların gelişiminde rol oynadığını düşündürmektedir. Yakın zamanda, bununla birlikte, PM bu maruz kalma da in vitro sistemlerinde, insan konularında 10-12 hem de deneysel olarak, tekrar eden elemanların, DNA metilasyon değişiklikler de dahil olmak üzere epigenetik değişiklikler, bir dizi ile sonuçlanır gösterilmiştir. Özel ilgi konusu olan etkileri vardırMajör ve minör uydular – – kromozomların sentromer etrafında heterokromatik bölgesinde bulunan uydu DNA PM. Onlar maruz 12. sonra en az 72 saat süreyle tespit edilebilir olarak bu etkiler, doğası gereği kalıcı olabileceğini gösterilmiştir. Özellikle sentromer yaklaşık DNA metilasyonu değişiklikler, hücre bölünmesi esnasında, uydu, DNA mRNA transkript, bir uzlaşma kromozom bütünlük birikimine yol açabilir ve daha sonra, patolojik durumların 13 çeşitli oluşmasına da neden olabilir.
PM bağlı epigenetik değişiklikler bir son nokta olarak bir CA analizi için sitogenetik yaklaşım adaptasyonu, bu şekilde, yüksek bir öneme sahiptir. Burada, fare makrofaj RAW264.7 modeli sistemini kullanarak CA'ların in vitro maruziyet ve analiz ortam PM toplama ve hazırlama yaklaşımı, rapor. Makrofajlar t nedenle, inhale yabancı nesnelere karşı ilk savunma hattını oluşturan veCep hattı kurulmuş ve partikül toksikoloji 11, 12, 14, 15, en sık kullanılan bir model olarak hizmet vermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sitogenetik çalışma veya numaraları veya öncelikle metafaz yayılır kromozom, yapılarının mikroskobik analizi, çeşitli hastalıklar için prognoz, risk değerlendirmesi ve tedavisi için önemli bilgiler sağlar. Şimdi sitogenetik anormallikler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesi ve gelişimi ile bağlantılı olduğu iyi bilinmektedir. Bugüne kadar, CA tüm ana tümör tiplerinde olduğu bulunmuştur. Sitogenetik değişikler 16 çeşitli uyarabilir önemli dış ri…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
iş Biyolojik Araştırma Mükemmellik [hibe sayısı 1P20GM109005], Ulusal Havacılık ve Uzay Dairesi [hibe sayısı NNX15AK32A] aracılığıyla Arkansas Uzay Grant Konsorsiyumu Sağlığı Merkezi Ulusal Enstitüsü ve İş Güvenliği Ulusal Enstitüsü tarafından, kısmen, desteklenen Sağlık (NIOSH) [hibe sayısı 2T420H008436]. Yazarlar redaksiyon ve bu taslağın düzenlenmesi için Christopher Fettes teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- . . IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
