使用了大气颗粒物引起的染色体畸变分析<em>体外</em>系统
Summary
该协议与周围空气的微粒物质处理后描述了在RAW264.7小鼠巨噬细胞体外量化和染色体畸变的表征技术。
Abstract
暴露于颗粒物质（PM）是一个主要的全球健康问题，这可能会损坏的各种细胞组分，包括核遗传物质。为了评估PM的核遗传完整性的影响，染色体结构畸变的得分在小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的中期扩展。 PM被从环境空气中具有高体积总悬浮颗粒采样收集。所收集的材料被溶解，并过滤以保持水溶性，细部。所述颗粒的特征在于用于通过核磁共振（NMR）谱的化学组成。不同浓度的颗粒悬浮液中加入到RAW264.7小鼠巨噬细胞的体外培养72小时的总暴露时间，与未处理的对照细胞一起。在曝光结束后，文化与秋水仙胺治疗逮捕细胞分裂中期。细胞，然后收获，用低渗溶液，定格在acetomethanol，D处理ropped到玻片上，最后用吉姆萨溶液染色。幻灯片进行检查，以评估使用亮场显微镜的结构染色体畸变（CA）的分裂中期利差在放大1000倍。 50至100中期扩展被打进每个治疗组。该技术适于检测结构染色体畸变（CA）的，如染色单体型断裂，染色单体型交流，偏心片段，双着丝粒和环染色体，双分钟，核内复制，和罗伯逊易位体外暴露于PM之后的。这是一个行之有效的细胞遗传学端点后天的改变相关联的有效方法。
Introduction
据估计，暴露于颗粒物（PM）导致每年超过300万过量死亡，主要是从心肺疾病和肺癌1。的确，PM被确认为致癌由国际癌症研究机构（组1）人类，如肺癌的暴露的水平提高到下午的风险增加已经显示2。有趣的是，几乎所有的肿瘤细胞海港数值和/或结构染色体异常。颗粒有机碳是一种变型的，复杂的，和非均相混合物，其组成和大小分布取决于排放以及物理和化学变化。它占来自城市的PM2.5质量的35-55％（PM 2.5微米尺寸和更小）以及农村和大陆背景的PM 2.5质量3,4的60％以上。水溶性部分占有机气溶胶的30-90％。大量有机化合物已经确定，包括脂族烃，多环芳烃，和它们的氧化和硝化的衍生物，脂族醛和醇，游离脂肪酸和它们的盐，二羧酸，多官能的化合物，蛋白质和类腐殖质大分子（HULIS）使用色谱法加上质谱技术5-8。这些化合物代表微粒的有机碳小于10-20％，因此大多数的有机碳是未知9。
实验证据表明，细胞毒性，氧化应激和炎症中涉及的PM-有关的病理状态的发展。最近已显示，但是，暴露于PM也导致一些外遗传改变的，包括在重复元件的DNA甲基化的改变，在这两个实验在体外系统以及在人受试者10-12。特别感兴趣的是的效果PM卫星DNA – 主要和次要的卫星 – 这是在围绕染色体着丝粒的异色地区发现的。结果表明，这些效果可能是由自然持久的，因为他们可以在至少72小时曝光12后进行检测。改变DNA甲基化，特别是围绕着丝粒，可以在细胞分裂过程导致的卫星DNA的mRNA转录物，折衷染色体完整性累积，并随后导致的各种病理状态13的发展。
为CA的分析所造成的PM后生改建的终点细胞遗传学方法的适应性，因此具有很高的重要性。在这里，我们报告使用小鼠巨噬细胞RAW264.7模型系统中的CA 体外照射和分析环境PM收集和准备的办法。巨噬细胞包括防御的第一线对吸入异物，因此，叔他的细胞系用作建立和粒子毒理学11，12，14，15中的最常用的模型。
Protocol
Representative Results
Discussion
细胞遗传学研究或数字或染色体，主要是在中期扩展的结构，微观分析，为预测，风险评估和治疗各种疾病的关键信息。它现在公认该细胞遗传学异常与几种疾病，包括癌症的进展和发展相关。迄今为止，中国科学院已经在所有主要类型的肿瘤中发现。可诱导各种类型的细胞遗传学改变16的主要外部危险因素之一-的CA可以自发或通过外部或内部的刺激，如电离辐射（IR）的出现。 CA的辅助?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持的，部分由生物学卓越研究[授权号1P20GM109005]，阿肯色空间格兰特财团通过美国国家航空和航天局[授权号NNX15AK32A]卫生中心的国家研究所和美国国家职业安全和健康研究所（NIOSH）授权号码2T420H008436。笔者想感谢克里斯托弗Fettes校对和编辑这篇稿子。
Materials
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
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