Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu
Summary
Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.
Abstract
Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.
Introduction
Dendritik hücreler (DC), bağışıklık sisteminin en önemli özel antijen sunan hücrelerdir. Olgunlaşmamış DC'ler (iDH'ler) deride veya mukozal dokularda bulunan ve işgalci patojenlere ile etkileşim ilk bağışıklık hücreleri arasında bu nedenle. Bu patojen tespiti, aşağıdaki T- ve B-hücresi tepkilerini aktifleştirme çünkü DH'ler, doğal ve adaptif bağışıklık sisteminin 1 arasında bir köprü oluşturmaktadır. Bundan başka, çünkü bu tür IL-1, IL-6 ve IL-12 gibi sitokinler yüksek miktarda salgılanması pro-enflamatuar bağışıklık tepkilerinin katkıda bulunur. DH'ler NK hücrelerini aktive ederek ve kemotaksi neden olduğu enfeksiyona sitesine başka bağışıklık hücrelerinin çeker.
DH'ler olgun olmayan dendritik hücreler (iDH'ler) ve bunların yapısının ve fonksiyonunun göre olgun dendritik hücreler (MDC) 2 ayrılabilir. Birçok örüntü tanıma reseptörlerinin biri (örn, paralı-benzeri reseptörler, C tipi yabancı antijenlerin alımdan sonralektinleri veya bol hücre yüzeyi üzerinde ifade edilen) reseptörleri güzelleştirmek, iDH'ler büyük değişiklikler geçmesi ve olgun başlar. Antijen sunumu için gerekli moleküllerin 3 yukarı regüle edilir ise, bu olgunlaştırma işlemi sırasında, antijen tutma reseptörleri, aşağı regüle edilir. Olgun DH'ler ana histokompatibilite kompleksi I ve II (MHC I ve II) yukarı doğru regüle, T lenfositlerin antijen sunumu ve aktivasyonu için gerekli olan CD80 ve CD86 gibi eş-uyarıcı moleküller. Buna ek olarak, hücre yüzeyi üzerinde kemokin reseptör CCR7 ekspresyonu lenf düğümlerine periferik dokularda DC'lerin geçişini sağlayan, indüklenir. Taşıma lenf düğümlerine 4-6 bir kemokin ligand 19 (CCL19 / MIP-3b) ve kemokin ligandı 21 (CCL21 / SLC) degrade boyunca DClerin "döner" ile kolaylaştırılır.
Göç eden, MDC ve böylece ini, CD4 + ve CD8 + T hücreleri naiv işlenmiş antijeniistilacı patojen 7 karşı edinilmiş bağışıklık tepki tiating. Lenf düğümlerindeki T hücreleri ile bu etkileşimi de virüsü 8 yayılması ile ilişkilidir. Diğer in vitro çalışmalar DC'ler verimli yakalamak ve güçlü bir enfeksiyon 9-12 Bu iletim sonuçlarına T hücrelerine ve HIV aktarmak olduğunu ortaya koydu. Bu deneyler lenf düğümlerine çevreden servisleri olarak in vivo HIV patlatır DC'ler vurgulayın. Antijen sunumu sırasında DH'ler efektör T yardımcı hücrelerinin farklılaşmasını şekil ve bu nedenle, mikrop karşı tüm bağışıklık tepkisinin sonucu bu çok etkileşim belirlenir önemli interlökinler salgılar. Yanı sıra tip 1 (Th1) ve tip 2 (Th2) efektör T hücreleri, CD4 + T yardımcı hücreleri (örneğin, tip 17 (Th17) ve tip 22 (Th22) T hücreleri) tarif edilmiştir ve diğer alt-gruplar ve bunların gidiş ve fonksiyon iyice incelenmiştir. DH'ler, ayrıca katılandüzenleyici T hücreleri (Tregs) 13,14 nesil. Bu hücreler bağışıklık ve durdurmak ya da indüksiyon veya efektör T hücrelerinin çoğalmasını aşağı düzenleyen ve böylece bağışıklık ve hoşgörüyü geliştirmek için çok önemli olabilir.
İnsan konvansiyonel DC'ler (CDCS) bir miyeloid kökenli hücrelerin çeşitli alt kümelerini oluşturan (yani, Langerhans Hücreleri (LCs) ve dermal ve interstisyel DC'ler) veya lenf kökenli (yani, plazmasitoid DC'ler (PDC)). In vitro deneylerde veya DC aşılama stratejileri, monosit kökenli DH'ler rutin dermal DC'ler için bir model olarak kullanılmaktadır. Bu hücreler, geleneksel miyeloid dendritik hücrelerin fizyoloji, morfoloji ve fonksiyon benzerlikler göstermektedir. Bunlar, sağlıklı vericilerden 12,15-18 izole monositlere interlökin 4 (IL-4) ve granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF) eklenerek oluşturulur. Dendritik hücreler, doğrudan dermal ya da mukozal biopsiden izole edilmiş ya da olabilir b edilebilire CD34 + eski utero elde göbek kordonu kan örneklerinden izole edilen hematopoetik progenitör hücrelerden geliştirdi. Burada, monositler izole edilmiş ve yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla periferal kan tek-çekirdekli hücresi (PBMC), zenginleştirme sonra anti-pıhtılaşmış insan kanından uyarılır gösterilmektedir. 5 gün için inkübe edildikten sonra, özel koşullar altında insan monositleri iDH'ler ayrılırlar olmayan bir klinik deney prosedürleri için hazırdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, manyetik nanopartikül bazlı analiz kullanılarak anti-pıhtılaşmış kandan alınan insan monosit yalıtımla monosit türevli dendritik hücreler (MDDCs) üretimini tarif eder. Bu protokol, santrifüj adımları PBMC fraksiyonu bir zenginleşmeye yol açan hücre izolasyon prosedürü, üst baş tarafında ifa edilir. Hücreler santrifüj sırasında kaybolur, ancak, yoğunluk gradyanlı ortamının 200-300 ml gerektirecektir yoğunluk gradyan ortamında bütün bir kan paket içeriğini kaplamak için…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).
Materials
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10mL Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25mL Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | — | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
- Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
- Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
- Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
- McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
- Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
- Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
- Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
- Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
- Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
- Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, 1368-1374 (2012).
- Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
- Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
- Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
