液体中の振幅変調原子間力顕微鏡でのサブナノメートル分解能イメージング

イメージング液とカンチレバー剛性が適切に選択されたと仮定すると、成功した高解像度を達成するための最も重要なステップは、撮像振幅の調整であり、システムの全体的な清浄度を調べました。

界面液体領域（典型的には2nm未満）の厚さに匹敵する振幅は、界面の溶媒⁴²の特性で主に変化をプローブします。振動振幅が大きすぎる場合には、振動チップは、カンチレバーの運動の安定性を排除し、そして必然的に解像度の低下をもたらす関係なく、撮影条件²⁹のサンプルを打つ長距離、非線形力場^52を横断します。別に解像度の損失から、高調波は、先端運動に表示されるように開始し、システムが^55をモデル化するために、より複雑になります。あるいは、撮像振幅が小さすぎるOである場合インタフェースのNLY一部（界面の液体、典型的には、特定の層）をプローブして、安定した画像形成のみ堅いカンチレバーを用いて達成することができるリスクが良好な信号対雑音比のために（>水⁵³ 10 N / m）を、大規模な高さの変動の上に柔らかい試料に損傷を与えます。硬いカンチレバーの必要性は小さい振幅で作業する場合、測定された信号は、チップと試料の間の長距離相互作用が依然として存在しているが、大部分は一定であり、影響しないことが、より重要になることができ、熱雑音を克服することです得られた画像中の高解像度のコントラスト。

それは、高分解能AFMになると、撮像環境の清浄度は最も重要です。システム内の望ましくない化合物は、イメージングおよび力分光法の両方を妨害することができます。撮影する場合（ⅰ）汚染物質（直接見る：実験に影響を与える傾向がある汚染の2つの主なカテゴリがあります。 <stroNG>図4B、4C）と高解像度の（ii）の一般的な原因不明の欠如。ケース（i）は唯一のそのようなチップと試料の相互作用を妨害し、吸着分子集合体が明らかに原子レベルで平坦な雲母表面（ 図4A）に対して対比される水マイカ界面でのような高度に理想化されたシステムで発生する傾向があります。チップとサンプルを変更する前に、それが効果的に繰り返しサンプルに対してハード先端を押すと、大きな偏向に分光曲線を取得する価値があります。これは通常、新しいチップに損傷を与えるだろうが、時折汚い先端を清掃またはイメージングに適した安定した水和サイトを誘導することができます。このヒントは、しかし、必然的に平滑化され、従って、イメージングが改善される場合でも、フラットサンプルのためにのみ適しています。堅いサンプルを超える疑いがある汚染の場合には、上記のやや破壊的な手順を実行する前に、カンチレバーの第二の固有モードで画像に試す価値はあるかもしれ。これは、単にSWが必要です第二の固有モードへの駆動周波数をかゆみと振幅/設定値を（以下のトラブルシューティングの説明を参照）再調整。第二の固有モードで作動し、いかなる弱く吸着した汚染物質が撮影しながら先端によって押しのけすることができるかなりカンチレバー増加の有効剛性。この戦略は、きれいなサンプルとチップの必要性を置き換えるが、チップ/サンプルが明らかに理想的ではないときに良好な画像を取得するために、いくつかのさらなる手段を提供していますされません。

図4：高分解能イメージングを阻害白雲母を撮影するときに観察汚染の例。 ：マイカは5 mMのRbClをで撮像された-何の汚染粒子が表示されていません。 B：汚染は名目上、超純水を撮像しながら、全体で数十nmのオーダーの凝集体の形をとります。 C：contamiによって形成された自己集合構造自然の中でおそらく両親媒性NAntの粒子。イメージングは​​再び名目上は、超純水で行いました。 D：マイカの原子レベルで平坦な表面からの偏差を示すA、BおよびCの破線に対応する垂直方向オフセットのセクション。 A、B及びC中のスケールバーは300nmで対応します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ケース（ii）は、より一般的なサブナノメートルの機能は、単に関係なく、撮影条件を、解決することができないイライラ事実によって主に特徴づけられます。この種の状況の署名は、いくつかの矛盾を示す傾向にある力分光測定では通常表示されます。これらは、かなり一般的なS字状の形状⁴²から外れる距離曲線対再現性に乏しい曲線と振幅を含むことができます。イオン性または他の汚染物質は、ディスある場合流体全体に均質編、彼らは地形イメージングに表示されない場合がありますが、通常のチップと試料の相互作用^29を維持し、高解像度の^70を得るため^に重要であるサンプル⁶⁹の水和構造を破壊する可能性があります。また、特にソフト、生物学的実験では、試料上の汚染物質の直接的な影響があってもよいです。不可能なサブナノメートルレベルの解像度をレンダリングする^{、73 –}例えば、ウェル（洗浄手順から）のアルコールの存在がゲル相の脂質二重層^71を流動化することができることが知られています。高解像度が可能でない場合、注意は、第1の撮像溶液と接触する任意の装置に特に焦点を当て、洗浄工程中に注意すべきです。完全に硬化していない場合、このようなエポキシ樹脂としても表向きは安定な化合物は、ある程度の流体に溶媒和することができます。

AM-AFMによる高分解能イメージングが要求している、忍耐を必要とし、可能な限り最高の撮影条件に到達する前に、多くの場合、いくつかの試験。小さな実験的な問題は、簡単に高解像度とトラブルシューティングスキルが不可欠である防ぐために十分に重要になることができます。以下、私たちは私たちが提案された解決策で発生する最も一般的な問題のいくつかをリストアップ。

カンチレバーのチューニング

ほとんどの市販のAFMカンチレバーを駆動するための音響励起を使用します。ステップ5.4に記載されているような場合には、その共振周波数付近で、カンチレバーのチューニング多くの場合、空気中の動作のために十分な性能を提供します。液体環境では、液体は、カンチレバーチップホルダーとしてAFMの異なる機械部品間のいくつかの結合を誘導する傾向があります。これは、多くの場合、一般に「ピークの森」として記載されている多くの鋭いピークと谷を示すカンチレバーの周波数スペクトルによって示され、カンチレバーの見かけ上の共振に影響を与えることができます。その結果、カレを見つけることがしばしば困難ですCTの駆動周波数。これらのピークは、ガス環境内に存在するが、によりカンチレバーの品質係数の高い値に、共振の振幅は^、74,75かなり大きいです。液体では、カンチレバーを駆動するために、適切なピークを選択することは容易ではないとすることができ、試行錯誤を必要とすることができます。実際には、共振周波数の周りの「ピークの森」での振幅の最も急な変動による周波数ピークは通常、必ずしも正確に共鳴上、多くの場合、高分解能イメージングを取得するのに十分な駆動周波数を提供しているにもかかわらず、最善の策です。

画像の歪み

イメージングドリフトは、多くの場合、高解像度を求めている問題で、画像が歪んだ（一般的に引き伸ばさ）に見えるのです。その起源は、スキャナ/ AFMが平衡動作温度に達していないため、またはサンプル液体の一部が急激に蒸発しているので（ 例えば 、画像化アルコールのいずれかで、一般的に熱であります ）。すべての場合において、ドリフトが熱平衡に無視できるようになります。可能な場合は、サンプルの温度を固定するために有用です。それ以外の場合は、実験を行う前に、数時間のブランクサンプル（低速走査速度で大型スキャン）をスキャンするためにAFMを残す価値があります。蒸発が問題ではない場合は、この手順は最良の第一の面から先端に短い距離（ 例えば 、20μm）を撤回するように注意しながら、手順の手順6の後に行われます。時折、ドリフトがあっても大規模な熱化後に残ります。これは通常、カンチレバーまたはそのチップの一部は、撮影しながら、このような薄いフィルムのような柔らかい粘着性の試料上またはチップ/カンチレバー/チップが適切に配置されていない場合に発生する可能性が何かをサンプルをドラッグしていることを示しています。 1カンチレバー/先端よりもホストより多くのチップでは、しばしば使用されていないカンチレバーを壊すのではなく、それらが表面上にドラッグしてみましょうすると便利です。

イオン強度

バートカンチレバー/先端

それは、（上述の症状を参照）カンチレバーが汚染源であることが疑われる場合、それは最初に光学顕微鏡下で検査されるべきです。ゲルボックスに保存されている場合は、カンチレバーが表示されることがゲルポリマーまたはシリコンオイル⁵⁹の痕跡を拾うことができます、極端な場合には、暗いスポットとして、カンチレバーの背面にある（ 図5（a）のように）。カンチレバーの光熱振動は、同様のスポットを誘導することができるが、それらはレーザ駆動によってカンチレバーコーティングの劣化/過熱に起因するものです。汚染は、カンチレバーにランダムに表示される傾向にあります。超純水で、その後、イソプロパノールで洗浄し、（12時間）が長くカンチレバーから望ましくない粒子を除去することができます。

図5：新しいカンチレバーとの比較や長時間のハード面に広く使用され、ゲルボックスに残されている同一1。 ：トップ;クリーニングされた新品のカンチレバーの光学像（手順を参照してください）。ボトム;光学像は、ゲルボックスから見える汚染（青い矢印）の外観を実証します。 B：カンチレバーのそれぞれの熱スペクトルの比較。古いカンチレバーの第1の共振ピークの広がり（緑色の矢印）がクリアされると、いくつかの高次モードが強化されている（青い矢印）。スペクトルは垂直オフセットと明瞭にするために対数スケールで提示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

必要なサブナノメートルの解像度を低解像度に許容される画像にもかかわらず、達成されない場合には、AFMチップは、化学的に、そのストレージ環境中に変更となっている可能性があります。これは、チップ⁶⁰上の親水性表面基の生成を助ける120秒間紫外線酸化剤にカンチレバーチップの曝露によって治療することができます。ケアは、先端の形状とUV出力に応じて変えることができる必要が正確な時間として、しかし取られるべきである、と過剰露出先端と低解像度の鈍化をもたらす可能性があります。

熱雑音</ P>

高解像度イメージングは、力と距離の変化に大きな感度が必要です（通常、サブ-PN力をサブオングストロームは^78を距離）。より柔らかいカンチレバーは、その固有のブラウン運動（熱振動）によるカンチレバーの熱機械的な動きが問題になる可能性があります。第一近似では、剛性kのカンチレバーでは、より小さいフィーチャを測定することは不可能です で、k _Bはボルツマン定数、Tは温度であり、熱雑音の振幅。具体的には、より高い共振周波数を有するカンチレバーを使用すると、より大きな周波数範囲で騒音を拡散し、測定帯域幅⁷⁹内の全体のノイズレベルを低下させます。

高い固有モードイメージング

時々その第二の固有モードでカンチレバーを動作させるのに有用であることができます増加有効剛性による（汚染の説明を参照してください）。実際に、これはその第二の固有モードにカンチレバー駆動することによって簡単に行われる（より高い周波数で第2の共振ピークを、 図1Aを参照）。カンチレバーをチューニングする場合、代わりに単に主共振の第二の固有モードを選択して、5.4に進みます。カンチレバーは、第2の固有モードで駆動されたときにInvOLSは異なるであろうことに注意してください。一般的に長方形のカンチレバーのためのステップ5.2で測定InvOLSの〜1月3日。

技術の主な制限は、試料の表面に安定した溶媒和の風景を必要とすることです。サンプルは、サンプル自体の大幅な変形を引き起こすことなく、界面の液体を乱す可能にするのに十分に堅牢でなければなりません。これは非常に柔らかく、不安定なサンプルなど大きな生体分子に挑戦することができます。さらに、小振幅AFMのpについての機械的な情報を得ることができない、ここで説明したようにサンプルのroperties、カンチレバー先端が界面流体にその時間の大半を費やしているよう。このため、このような定量的ナノメカニカルマッピング⁸⁰のような他の方法を使用するか、カンチレバー運動の高調波を利用することが有益であり得ます。 ^83、同時に地形やサンプル^25,81の剛性を提供することができます^{– – （}低品質因子で）流体に^29,81を撮像する場合、より高いハーモニカは、一般的に強化されている⁸⁴が、それらは一般的に高解像度に有害です。すべての走査型プローブ顕微鏡技術に固有の他の制限は、特に、ここではまだ結果は必然的に測定チップに関する情報が含まれているという事実有効です。小振幅の使用は、大規模な高さ変動を有するサンプルのための理想的ではありません。高さの変動は、撮像振幅よりも大きい場合、フィードバックループは、必然的に、したがって、試料と先端の損傷の危険、よりゆっくりと反応します。使用OFより柔らかいカンチレバーがある程度この問題を軽減します。

ここに提示される方法の主な利点は、それが液体でAFMで可能な最高の画像解像度を提供することであるが、任意の商業AFM上に実装することができ、機械のノイズレベルが十分に低いことを条件とします。市販の装置に匹敵する解像度は、通常、硬いカンチレバーと接触モードで、または時折FM-AFMで達成されます。 AMモードでは、比較的柔らかいカンチレバーを操作するサンプルのより広い選択を可能にし、ほとんどのシステムでFM-AFMよりも実装が容易です。アプローチは、解像度を向上させ、局所的な化学的情報を得るために、任意の固体と液体の間の界面に存在する溶媒和力を利用するに依存しています。これは、原理的にのみ空気の湿度に起因するほとんどの表面上に構築水層（典型的には数ナノメートルの厚さ）に依存する、周囲条件で使用することができます。基本原理高解像度の戦略は変わらないが、先端のほとんどは、先端の頂点と試料⁸⁵の間のみの毛細管ブリッジと、空気中です。高解像度は、これらの状態^86,87に固い試料で実証されています。撮影条件が原因で、カンチレバーの振動の高いQ値に浸漬液体のものとはしかし異なっています。実際に、我々は、おそらく毛細管ブリッジの時間的変化に、それが困難なソフトや不規則なサンプルにわたって安定した動作を実現発見し、与えられたカンチレバー剛性のためのQ値を増加させました。

本明細書に記載されたプロトコルは、最も近代的な商業AM-のAFMによる液中のサンプルの分子レベルの解像度の画像を達成するための方法論を提供しています。私たちは、撮像パラメータの我々の選択の背後にある科学的根拠を提供し、溶媒和力の役割を強調する。また、一般的な問題を議論し、特に汚染インチ特定のチップと試料の相互作用CAn個の撮像溶液、カンチレバー形状および材料、およびサンプルの化学的性質の内容に応じて劇的に変化します。スキャンの間に存在する支配的な力の性質の実用的な理解は、新しいシステムにこのプロトコルを適応させ、信頼性の高い結果を確保することが不可欠です。最適化されたときは、実験的なアプローチは、in-situで 、溶液中の試料の局所的分子レベルの洞察を得るために強力です。