亚纳米级分辨率成像与调幅原子力显微镜在液体

假设成像液体和悬臂刚度被适当地选择，以实现成功的高分辨率的最关键的步骤是成像振幅的调整，并研究了系统的整体清洁。

振幅媲美的界面液体区域（通常小于2纳米）的厚度探针在界面溶剂⁴²的性能主要变化。如果振荡幅度过大，振动尖端将遍历远距离，非线性力场⁵²排除悬臂运动的稳定性，并不可避免地打到样品不管成像条件^29，从而导致分辨率的恶化。除了在分辨率的损失，高次谐波开始出现在尖端运动并且系统变得更复杂的模型^55。可替代地，如果成像幅度过小O接口的唯一一句一部分被探测（界面液体的典型具体层）和稳定的成像只能与僵硬悬臂来实现（> 10牛顿/米在水中^53），用于令人满意的信噪比，与风险破坏软样品在大高度变化。需要刚性悬臂是克服热噪声，可以成为更显著所测量当与小振幅工作的信号，所述针尖与样品之间的长距离相互作用仍然存在，但在很大程度上是恒定并且不影响高分辨率对比度在所获得的图像。

成像环境的清洁是非常重要的，当涉及到高分辨率的原子力显微镜。在系统中不期望的化合物可以与成像和力光谱既干扰。有迹象表明，往往会影响实验污染物的两个主要类别：成像时（ⅰ）污染物直接可见的（ <stroNG>图4B，4C）和（ii）一般无法解释缺乏高分辨率。情况（ⅰ）易于发生仅在高度理想化的系统，例如在水云母接口，其中，与针尖-样品的相互作用干扰吸附分子集合体清楚对比对原子级平坦云母表面（ 图4A）。改变针尖与样品之前，值得取得分光曲线具有大偏转，有效地用力挤压靠在样品的前端反复。这通常会损害一个新的提示，但可以偶尔清洗脏尖或诱发适合成像稳定的水化网站。这个技巧将，但是，不可避免地减弱，因此只适用于平板样品即使成像改善。在以上僵硬样品怀疑被污染的情况下，它可能是值得尝试的图像与悬臂的尝试上述有些破坏性过程之前，第二本征模式。这仅仅需要SW瘙痒驱动频率到第二本征模式，调整幅度/设定值（请参见下面的故障排除讨论）。的相当时在第二本征模式操作，任何弱吸附污染物可以通过在成像的前端被推远离悬臂增加有效刚度。这种策略并不能取代一个干净的样品和小费的需要，但提供了一些更多的渠道，以获得令人满意的图像时小费/样本显然不理想。

图4：摄像白云母时观察到抑制高分辨率成像污染的例子。答 ：云母成像在5mM氯化铷-无污染物颗粒是可见的。 A：污染服用几十纳米的数量级的聚集体的形式跨越而成像在名义上超纯水。 C：由contami形成自组装结构恶性颗粒性质大概两亲性。成像在名义上超纯水中再次进行。 D：对应于A，B和C中的虚线示出了从云母的原子级平坦的表面的偏差垂直偏移部分。在A，B和C比例尺对应于300纳米。 请点击此处查看该图的放大版本。

案例（二）更常见，其主要特征是令人沮丧的事实，亚纳米级的功能根本无法得到解决，无论成像条件。这种类型的情况的签名是通常在力光谱测量这往往表现出一定的不一致性可见。这些可能包括很难再现曲线和幅度对距离的曲线从一个典型的S形⁴²的显著偏离。如果污染物，离子的或以其他方式，是DISPERS编均匀整个流体，他们可能不会在地形成像显示，但可以打乱样本^69，这是用于保持常规针尖-样品的相互作用²⁹和获得高分辨率⁷⁰至关重要的水合结构。也可能存在于样品中的污染物的直接影响，特别是在软，生物实验。例如，它是公知的醇的存在下（从清洁步骤）可积液凝胶相脂质双层^{71 – 73，}渲染亚纳米级分辨率是不可能的。如果高分辨率是不可能的，应先采取在清洗过程中，特别是着眼于该进入与成像溶液接触的任何设备。甚至如环氧树脂表面上的稳定化合物可以在流体溶剂化物在一定程度上，如果没有完全固化。

用AM-AFM高分辨率成像要求很高，需要耐心和达到最佳的成像条件之前经常多次试验。小实验的问题很容易变得足够重要，以防止高分辨率和故障排除技能是必不可少的。此后，我们列出了一些我们与提出的解决方案中遇到的最常见的问题。

悬臂式调整

大多数商业用原子力显微镜声激励来驱动悬臂。在这种情况下，调谐悬臂，如在步骤5.4中所述，接近其谐振频率常常提供了在空气中操作足够的性能。在液体环境中，液体趋于以诱导AFM的不同的机械零件，如悬臂芯片和支架之间的一些耦合。这可能会影响悬臂的表观共振，常表现出许多尖锐的峰和谷通常被描述为一个“峰的森林”悬臂频谱示出。其结果，常常难以找到CORRECT变频器频率。这些峰也存在于气体环境，但由于悬臂的质量因数的高值，在共振的幅度是相当大的^74,75。在液体选择适当的峰以驱动悬臂可以是不容易的，并且可以要求试验和错误。在实践中，随着“峰森林”周围的共振频率的幅度变化幅度最大的频率峰值通常尽管是不一定准确共振，往往提供的驱动频率足以获得高分辨率成像的最佳选择。

图像失真

影像漂移往往是追求高分辨率时的问题，使图像看起来失真（通常拉伸）。其来源是一般的热，可能是因为在扫描仪/ AFM还没有达到它的平衡的工作温度，或由于样品液体的一部分被迅速蒸发（ 例如 ，成像在醇 ）。在所有情况下，漂移变为在热平衡可忽略不计。因此，有用的固定样品，如果可能的温度。否则，这是值得离开AFM在进行实验前扫描数小时空白样品（大尺寸的扫描在慢扫描速率）。如果蒸发是不是一个问题，此过程最好在步骤6之后进行，注意第一撤回尖端从表面的短距离（ 例如 ，20微米）。偶尔，漂移甚至会经过广泛的热化依然存在。这通常表明悬臂或它的芯片部分拖动样品同时成像，这东西可以在软凝聚力样品发生，如薄膜或针尖/悬臂/芯片不宜放置。在芯片上该主机多个悬臂/尖端，它常常是有帮助打破不在使用，而不是让它们在表面拖过悬臂。

离子强度

坏悬臂/针尖

如果怀疑该悬臂是污染的来源（见上述症状），应先在光学显微镜下检查。如果存储在凝胶中，悬臂可以拿起凝胶聚合物或硅油^59，可以显示的痕迹在极端情况下，如暗斑，在悬臂的背部（如在图5A）。悬臂的光热振荡可诱导类似的斑点，但它们是由于由驱动激光退化/过热悬臂涂层。污染往往会随机出现在悬臂。较长（12小时）清洁用异丙醇，然后，用超纯水可以从悬臂除去任何不希望的粒子。

图5：新的悬臂，并且已被广泛使用于硬质表面和左中的凝胶盒在较长时间内一个相同的比较。答 ：顶部;已被清理（见程序）全新的悬臂梁光学图像。底部;光学图像展示可见的污染物从胶箱的外观（蓝色箭头）。 A：悬臂各自的热谱图的比较。老悬臂的第一共振峰拓宽清楚（绿色箭头）和一些高阶模式增强（蓝色箭头）。谱已垂直偏移并呈现在为清楚起见数 – 对数标度。 请点击此处查看该图的放大版本。

如果没有实现所需的亚纳米分辨率，尽管在较低的分辨率上可接受的图像，它是可能的针尖已存储环境中变得化学修饰。这可以通过在悬臂芯片的曝光处理以紫外线氧化剂为120秒，这有助于在嘴⁶⁰的亲水性表面基团的创建。注意应然而采取必要可以取决于尖端几何形状和紫外线功率变化的准确时间，并经曝光，可能会导致在尖端和减小的分辨率的钝化。

热噪声</ P>

高分辨率成像要求现行的变化和距离（通常分PN部队和亚埃的距离^78）非常敏感。对于较软的悬臂，所述悬臂的，由于其固有的布朗运动（热振动）的热机械运动可能是一个问题。在第一近似值，具有刚度k的悬臂，它是不可能测量设有小于中，热噪声，其中k _B是玻耳兹曼常数，T是温度的幅度。实际上，使用悬臂具有较高的共振频率扩展在较大的频率范围内的噪音，并降低在测量带宽⁷⁹的整体噪声水平。

较高的本征成像

有时可能是有益的在其第二本征模式来操作悬臂增加所致的有效刚度（见污染的讨论）。实际上，这是通过驱动在其第二本征模的悬臂仅仅做（在较高频率的第二共振峰， 见图1A）。当调整悬臂，只需选择第二本征而不是主共振并继续执行步骤5.4。注意，当悬臂在第二本征模式驱动的InvOLS将是不同的;典型地在步骤5.2的矩形悬臂测量InvOLS的〜1/3

该技术的主要限制是它要求在样品的表面上的稳定的溶剂化景观。样品应足够健壮以允许扰动界面液体而不诱导样品本身的显著变形。这可以是非常柔软的，不稳定的样品，例如大生物分子具有挑战性。另外，小幅度AFM这里描述无法获取有关在p机械信息样品roperties，作为悬臂刀片花费在界面流体的大部分其时间。对于这一点，可能是有益的是使用其它方法如定量纳米机械制图⁸⁰或利用悬臂运动的高次谐波。 ^83，可同时提供地形和样品^25,81的刚度^{– –}流体成像时（以低质量的因素^）29,81较高的口琴一般都增强了^84，但他们一般是不利的高分辨率。固有所有扫描探针显微技术的其它局限性仍然有效这里，特别是这一事实的结果不可避免地包含有关测量芯片的信息。使用小幅度也是不理想的大高度变化的样品;反馈回路将不可避免地做出反应更慢时高度的变化比成像幅度较大，因此，冒着样品和尖端的损害。使用Ø˚F柔和悬臂减轻这个问题在一定程度上。

这里提出的方法的主要优点是，它提供了最高的图像分辨率可能的原子力显微镜中的液体，但可以在任何商业的AFM来实现，只要该机器的噪音水平是足够低的事实。在商用仪器相媲美的分辨率通常是在接触模式在FM-AFM僵硬悬臂实现，或者偶尔为之。在AM-模式，并以相对较软的悬臂工作允许的样品更广泛的选择，是很容易，FM-AFM实现在大多数系统上。该方法依赖于利用现有的任何固体和液体之间的界面的溶剂化力以增强分辨率和获得本地化学信息。它可以在原则上在环境条件下使用，仅仅靠由于空气的湿度最表面上建立的水层（通常为几纳米厚）。基本的原则高分辨率策略保持不变，但最前端的是在空气中，仅与尖端顶点和样品⁸⁵之间的毛细管桥梁。高分辨率已在这些条件下^86,87被证明在硬的样品。成像条件是但比浸没液体的不同，由于悬臂的振荡的高Q因子。实际上，我们发现难以实现稳定操作软的或不规则的样本，大概是由于毛细管桥的时间变化和增加Q因数对于给定的悬臂刚度。

本文描述的协议提供了用于在液体中与大多数现代商业的AM-原子力显微镜获得的样品的分子水平的分辨率的图像的方法。我们提供我们所选择的成像参数背后的科学原理，强调溶解力的作用。我们还讨论共同的问题，特别是污染。具体针尖 – 样品的相互作用CAÑ具体大大取决于成像溶液，悬臂几何形状和材料，和样品化学的内容。扫描过程中存在的主导力量的性质的实际理解因此，必须适应这个协议到新系统，并确保可靠的结果。当优化，实验方法是强大的现场获得的样品地方分子水平的见解在溶液中。