JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Комбинированный прижизненной микроскопии и повысить контрастность УЗИ задних конечностей мыши для изучения инсулин индуцированной вазодилатацию и мышечная перфузия

Published: March 20, 2017
doi:
10.3791/54912
, , , , ,
1Laboratory for Physiology, Institute for Cardiovascular Research (ICaR-VU),VU University Medical Center, 2Department of Internal Medicine, Institute for Cardiovascular Research (ICaR-VU),VU University Medical Center

Summary

Инсулин индуцированной вазодилатацию регулирует мышечная перфузия и увеличивает микрососудистой площадь (микрососудистой набора) для вещества обмена между кровью и тканью интерстиция. Комбинированные прижизненной микроскопии и повысить контрастность УЗИ представляется одновременно оценить действия инсулина на более крупных судов и микроциркуляции в vivo.

Abstract

Было продемонстрировано, что инсулин в сосудистой действия способствуют регуляции чувствительность инсулина. Влияние инсулина на мышцы перфузии регулировать постпрандиальной доставки питательных веществ и гормоны инсулин чувствительных тканей. Здесь мы опишем технику для объединения прижизненной микроскопии (IVM) и повысить контрастность УЗИ (CEUS) приводящей отсек мыши задних конечностей одновременно визуализировать артерий сопротивление мышц и перфузии микроциркуляции в vivo. Одновременно оценить эффект инсулина на нескольких уровнях сосудистой дерева имеет важное значение для изучения взаимосвязи между несколько вазоактивных эффекты инсулина и мышечная перфузия. В этом исследовании были эксперименты на мышах. Во-первых хвост вен канюля вставляется для инфузии анестезии, вазоактивное соединений и УЗИ контрастного вещества (липид инкапсулированное микропузырьков). Во-вторых небольшой разрез в области паха подвергать артериальной дерево отсеке приводящей мышцы. Ультразвуковой датчик затем располагается в контралатеральной верхняя задних конечностей для просмотра мышцы в поперечном сечении. Для оценки исходных параметров, оценивается артериальной диаметр и впоследствии микропузырьков переплетаются с постоянной скоростью, чтобы оценить поток крови в мышцы и объем микрососудистой крови (MBV). При применении до и во время hyperinsulinemic-euglycemic зажим, комбинированные КБПБ и CEUS позволяют оценку инсулин индуцированных изменений артериальной диаметр, микрососудистой мышечная перфузия и чувствительность инсулина всего тела. Кроме того может быть определена количественно временные отношения между ответы микроциркуляции и артерии сопротивление инсулина. Это также возможно для последующей мышей продольно в время, делает его ценным инструментом для изучения изменений в чувствительность инсулина сосудистой и всего тела.

Introduction

В ответ на повышение уровня глюкозы крови поджелудочная железа вырабатывает инсулин в кровоток, где она быстро распространяется в его тканях-мишенях таких скелетных мышц, через сопротивление артерий и капилляров. Скелетная мышца отвечает за ~ 80% постпрандиальной Глюкоза поглощения1. Доставки инсулина в скелетной мышце интерстиция было показано, быть ограничение шаг для метаболических действия инсулина, способствующих глюкозы в распоряжении2,,34скорости. В течение 10-15 мин инсулина увеличивает объем капиллярной крови (микрососудистой вербовка), эффект, который возникает прежде всего кровотока увеличивается в5,6. Микроваскулярная набора расширяет эндотелиальной площадь поверхности для обмена питательных веществ (и инсулина)7,8. Инсулин опосредованной микрососудистой найма предшествует и независимо связаны с изменениями в скелетных мышцах Глюкоза поглощения8,9. Влияние инсулина на сосудистую назвал «чувствительность сосудистой инсулина».

Было показано, что инсулин опосредованной микрососудистой набора и инсулин индуцированной вазодилатация нарушаются в ожирением Цукер крыс10,11. Кроме того худой мышей с сокращением плотность капиллярной отображения мышцы инсулин сопротивление12. В их влиятельных работы Кубота et al. показал, что нарушение инсулин сигнализации в эндотелиальных клетках вызвало сокращение в инсулин индуцированной микрососудистой набора, который сократился приблизительно 40%13поглощение глюкозы в скелетных мышцах. Эти ненормальности в функции микрососудистой не происходят только в мышцы, но и в нескольких других тканей и органов, как сердце, сетчатки и почки14,,1516. Эти примеры и другие исследования17,18,,1920 предположить, что сосудистые эффекты инсулина являются важным механизмом в физиологии (патолого) сопротивление инсулина и его осложнения.

Хотя есть существенные доказательства того, что инсулина увеличивается объем микрососудистой крови (MBV) в скелетных мышцах5,6, механизмы, посредством которых это происходит, не полностью понял9. Эндотелий зависимой вазодилатация имеет важное значение во многих аспектах сосудистых инсулина чувствительность21,,2223 на различных уровнях сосудистую. Чувствительность сосудистой инсулина может проявляться релаксации индуцированного инсулина сопротивления артерий и релаксации предварительно капиллярного артериол увеличить площадь поверхности перфузии микрососудистой обмен7,24, 25.

Прижизненной микроскопии (IVM) был использован в различных ткани препаратов, включая складки палат мыши спинку26, брыжейка крыс и мышей27, модели ишемии конечности в мыши28 и мешочек щеку хомяка 29. повысить контрастность УЗИ (CEUS) является другой Тепловизионная техника, которая позволяет оценки микроциркуляции в сердца30 , а также скелетных мышц31. Он использует заполнены инертным газом микропузырьков, которые ведут себя rheologically, как красные кровяные клетки и остаются полностью в пределах просвета сосудов. Эти микропузырьков внутривенно infused с постоянной скоростью, для достижения устойчивого состояния. Затем, волны ультразвук высокой энергии, может использоваться для уничтожения микропузырьков. Скорость пополнения микропузырьков в регионе интереса (ROI) представляет скорость потока (MFV). Интенсивности сигнала общий контраст изображения представляет MBV. CEUS могут выполняться неоднократно (в людях), и она имеет расширенный понимания сосудистые дисфункции, которая происходит в стойкий инсулин государствах (обсуждается в Barrett et al. 32).

В текущем исследовании мы опишем новый метод для изучения регуляции кровоснабжения мышц, путем одновременного использования КБПБ и CEUS. Здесь мы сосредоточены на сосудистой действия инсулина в отсеке приводящей мыши задних конечностей. Этот отсек является одним из крупнейших групп скелетных мышц в мыши, позволяя исследования местных Глюкоза поглощения в репрезентативный мускул. Этот отсек идеально подходит для КБПБ как подготовка и визуализация артерий были легко доступны по стандартной хирургической процедуры28. Кроме того наши собственные группы и другие показали, что CEUS могут использоваться в этом отсеке33,34.

Преимуществом метода комбинированного КБПБ и CEUS является возможность оценить эффект инсулина на уровне больших артериол (корма или сопротивления артерии) и микроциркуляцию (капиллярные кровати) в одной и той же группы мышц. Кроме того одновременное применение двух методов обеспечивает проницательность в височной действие инсулина на уровнях сопротивления артерий и микроциркуляцию. Это комбинированный КБПБ и CEUS техника также может осуществляться в других областях сосудистая биология. Например роль различных белков и некоторых патофизиологических условий, влияющих на эндотелий можно изучать с помощью модели нокаут. Кроме того оба метода может использоваться в одной мыши в нескольких точках времени, сократить время и стоимость исследований.

Protocol

Все эксперименты на животных были одобрены местных животных ухода и этического Комитета. Весь протокол от индукции анестезии в мыши до конца зажим hyperinsulinemic-euglycemic занимает около 2 ч. 1. микрохирургическая подготовка Побудить анестезии наряду с анальгезии в мужской мыши, весом 20-25 g после 14 h или ночь поста с внутрибрюшинного введения фентанила (0,31 мг/кг), мидазоламом (6,25 мг/кг) и Acepromazine (6,25 мг/кг) (FMA анестезии) и поместите его на ректальной температуры гомойотермных Отопление pad, который поддерживает температуру тела при 37 ° C. Продезинфицируйте таблице операции и оборудование, несколько раз с помощью решения на основе спирта. Придаем 27 G иглы 10 см трубка длиной полиэтилена (PE-20) и Подсоедините трубку к 4-контактный разъем. Вставить иглу в Вену хвост и зафиксировать его с помощью ткани клейкие гелевые. Этот катетер будет использоваться для инфузии микропузырьков, инсулин, глюкозы и анестезии.Примечание: Добавление гепарина (5 ед/мл) в стерильного физиологического раствора при катетеризации процесс очищать вен хвост (приблизительно 10 мкл) уменьшает возможность засорения канюли. Течение хирургических процедур и протоколов для экспериментальных работ поддержание анестезии путем непрерывного внутривенного вливания FMA анестезии через канюлю вен хвост скоростью 33,75 мкл/кг/мин. Поместите курсор мыши с вентральной стороне вверх и исправить с помощью термостабильные ленты подвергать области бедро ноги. Используйте небольшое exorotation тазобедренного сустава (задних конечностей лапами вверх) и 40-60° угол в коленном суставе стандартизировать растянуть мышцы в отсеке приводящей бедра. Удаление волос в области паха и бедро на двусторонней основе с использованием депиляционный крем. Соберите все распущенные волосы с влажным ватным тампоном. Поместите курсор мыши под стереомикроскопом и выполнять следующие хирургические шаги с помощью 10 X до 16 X увеличение. Сделайте 2 см разрез кожи ножницами, проходящей параллельно к паховой связки, просто сбоку брюшной искривления (рис. 1). Примените тяги в дистальной части разрез дистально с помощью бульдог зажим (рис. 1 d). Это поможет настроить окна по мере необходимости и помочь провести парафинового масла (описанный в 1.12). Вскрыть жировой ткани от брюшной стенки. Чтобы избежать кровотечения, Осторожно отделите жировой ткани от стены вместо рассекает непосредственно через панель. Нежной тяги в жировой ткани в дистальном направлении будет способствовать процессу (рис. 1 c). Идентифицировать бедренной артерии и следовать ему до первых крупных филиалов (эпигастральной артерии и артерии gracilis) (Рисунок 2). Gracilis артерии является первым крупным филиал бедренной артерии, работающие на Магнус мышца и затем запускает глубоко в мышцу gracilis. Gracilis артерия будет использоваться для КБПБ. Идентифицировать прозрачной глубокой фасции мышцы и сосуды. Используя острые щипцы, потяните вверх фасции и сократить его с помощью microscissor. Покрытие подвергается мышц с падением (200 мкл) лекарственных жидкого парафина (комнатной температуре, или предварительно разогретую до 37 ° C) для предотвращения высыхания подготовленной ткани. Убедитесь, что падение нефти не приводили к утечке прочь. Отрегулируйте складки кожи разреза с помощью зажима бульдог для создания небольшой полости провести парафинового масла, который омывает судов. Поместите курсор мыши под микроскопом ранее калиброванные (16 X оптическим увеличением) таким образом, что артерии gracilis вертикальные на экране компьютера. Прикрепить микроскоп камера и компьютер на основе анализа системы, которая может извлечь диаметр судов из набора данных изображения. Диаметр — это расстояние между двумя сторонами Люминал судна. Непрерывный мониторинг и измерения диаметра артерии является желательным. Место источник света на достаточном расстоянии (минимум 20 см) от задних конечностей для уменьшения головной проводимости от света. Нанесите гель трансдукции подогретую УЗИ к верхней контралатеральной задних конечностей. Место ультразвуковой зонд перпендикулярно длинной оси бедренной кости. Тщательно Отрегулируйте угол и направление ультразвуковой зонд, чтобы получить вид поперечного сечения группы приводящей мышцы. Позаботьтесь, чтобы держать конюшню сохранить тот же самолет изображений для измерения базовых и hyperinsulinemic положение ультразвуковой зонд относительно указателя мыши. Пусть мыши стабилизации за 30 мин. Диаметр артерии gracilis должно быть стабильным за 10 мин до документирования базовый диаметр. 2. базовые и Hyperinsulinemic измерения Убедитесь, что базовый диаметр gracilis артерии сохраняется по компьютерной программы, используемые для КБПБ. Подготовьте микропузырьков заранее как описано35 и count Коултер счетчика к концентрации 2,5 х 109 пузыри/мл непосредственно перед экспериментом. Как микропузырьков можно просматривать только в режиме контраста машины УЗИ, контроля параметров, которые влияют на изображение и собранные данные контраст (описано в разделе 2.3.1) и использование последовательно во время приобретения. Используйте следующие настройки на УЗИ машины: Усиление контраста в 35 дБ; время получить компенсацию в OFF; Плотность линии до МАКСИМУМА; Количество фокуса зон в мире; Передавать мощность до 4%; Передавать ширина луча стандарту; Ворота SV-4; Чувствительность к 1; Сохранение в OFF. Уровень расположение зон координационным центром региона интерес. Сохранить короткий (5 s) клип. Это будет использоваться для расчета фонового сигнала. Встряхните флакон, содержащий микропузырьков вручную, чтобы иметь единый подвеска. Начните, вливая микропузырьков, с помощью канюли вен хвост со скоростью 5 мкл/мин. Место инфузии трубки на вибрирующие вихря (200 x / мин) для поддержания единообразного подвеска микропузырьков. Разрешить 5 мин непрерывной инфузии микропузырьков, так, что будет достигнут уровень устойчивого состояния. Продолжите с получением кривые времени интенсивности пузырей, используя функцию destruct СРТ (MBD) на машине УЗИ на 5 мин и 10 мин после начала инфузии микропузырьков (рис. 3A). Возьмите Средний сигнал этих двух измерений для получения исходных данных перфузии. После получения исходных данных, запустите зажима hyperinsulinemic-euglycemic как описано34. Для администрирования инсулина и глюкозы (и анестезии) используйте канюлю хвост (помещается в 1.3). Короче говоря, побудить государство hyperinsulinemic путем введения болюса инсулина 200 му/кг, следуют инфузии непрерывной инсулина (7,5 му/кг/мин) 60 мин использования переменной инфузии 20% D-глюкозы сохранить euglycemia. Оценить уровень глюкозы в крови из вен хвоста каждые 5 мин с устройством контроля глюкозы и поддерживать на 5 мм, регулируя скорость инфузии переменной глюкозы. Определите чувствительность инсулина путем усреднения скорости инфузии среднее глюкозы в течение последних 30 мин. Убедитесь, что диаметр артерии gracilis документирован в нужное время периоды (например, на 10, 30 и 60 мин) начала зажим hyperinsulinemic-euglycemic с компьютерной программы. После 25 минут и/или 55 мин инсулина зажима начало второго измерения (hyperinsulinemic) CEUS для документирования MBV в 30 или 60 мин, соответственно. Выполните те же шаги, описанные в 2.4 и 2.5. Отсоединение и использовать порт анестезии 4-контактный разъем на настаиваться микропузырьков. Присоедините трубку анестезии после окончания инфузии микропузырьков. После завершения КБПБ и CEUS измерения 60 мин после начала инфузии инсулина отозвать крови от мыши процедурой пункции сердца для последующего анализа. Это также будет усыпить мышь. Тщательно анализировать gracilis и бедренной артерии и хранить их для дальнейшего желаемого экспериментов (для например, западных помарки, иммуногистохимия, ex vivo давления миография эксперименты36,37, 38). 3. автономный анализ Примечание: Анализ КБПБ и CEUS измерения должны выполняться в автономном режиме ослепленный следователем. CEUS предлагает возможность различать микроциркуляцию от более крупных судов, временно разрушать микропузырьков, высокой интенсивности ультразвуковых волн, используя функцию MBD. Сигнал (измеряется в произвольных единицах (а.у)) в более крупных судов восстанавливается быстрее, чем те в микроциркуляцию за скорость микропузырьков в соответствующих судов. Использование автономных рабочих станций или программное обеспечение на компьютере УЗИ делать анализы. Нарисуйте область интересов (ROI), чтобы включить микроциркуляцию. Извлечь отдельный ROI включить больше бедренных сосудов (рис. 3A). Дублировать микроциркуляцию и более крупных судов трансформирования для фона, базовые и hyperinsulinemic измерений, используя функцию копирования ROI, построен в программном обеспечении. Вычтите интенсивности сигнала измерения фон от базовой линии и hyperinsulinemic измерений. Разделите интенсивности сигнала микроциркуляции, интенсивность сигнала бедренных сосудов. Теперь можно сравнить базовые и hyperinsulinemic MBVs.

Representative Results

Скорость инфузии глюкозы во время hyperinsulinemic-euglycemic зажим (чувствительность инсулина) был 180.21 ± 19,81 мкмоль/кг/мин местного применения парафинового масла на отсеке приводящей мышцы для стабилизации судна не изменить средний базовый диаметр артерий (73,6 ± 29,0 мкм против 68,8 ± 17,9 мкм; p = 0,58) но помогла уменьшить вариации животных испытания (рис. 4A). Инсулин последовательно увеличен диаметр артерии gracilis (14.58 ± 6,2% в 60 мин; N = 9) который был значительно отличаются (p < 0.0001) от диаметра изменения, вызванные солевые вливания (-6.3 ± 4,9%; N = 6). Инсулин индуцированной вазодилатация был ощутимый после 10 мин (10.09 ± 5,1%; p = 0,002) и достиг примерно 95% его максимальной вместимости проволочек после 30 мин. С помощью CEUS, инсулин последовательно увеличилось мышцы MBV (Рисунок 5A) на 33,5% (± 31.04%, N = 7; p = 0,0009) по сравнению с солевые вливания (-10.63 ± 27.87%, N = 6) (Рисунок 5B). Представленные данные являются интенсивность сигнала мышцы MBV разделены, в бедренных сосудов. Это уменьшает экспериментальные различия между различными измерениями и между различными мышей (данные не показаны). Интенсивность сигнала в бедренных сосудов соответствует линейно с концентрацией микропузырьков в обращении (рис. 3 c). Исправление для сигнала бедренных сосудов теоретически корректирует различия в концентрации микропузырьков используется (рис. 3D). Данные представлены в этом разделе, как означает ± стандартное отклонение. Рисунок 1: Хирургическая экспозиция приводящей отсек задних конечностей. (A) надрез производится на пах, параллельно направлению паховой связки. (B) нежной тяги в жировой ткани в дистальном направлениях (черные стрелки) представит соединительной ткани (*) между жировой ткани и брюшной стенки. (C) кожи складок разреза можно отрегулировать с помощью зажима бульдог для создания небольшой полости провести парафинового масла, который омывает судов. (D) ультразвуковой зонд располагается на контралатеральной задних верхних конечностей после подготовленный gracilis артерии рассматривается с помощью калиброванного микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: Прижизненной микроскопии задних конечностей мыши. Бедренная артерия (A) порождает эпигастральной артерии (B) и артерию gracilis (C), которая пробегает приводящей мышцы группа (D). Gracilis артерия используется для КБПБ, с помощью калиброванного микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: Сигнал интенсивности повысить контрастность УЗИ в объем микрососудистой крови в мышцы и бедренных сосудов. (A) вид нелинейных контраста изображений режим цифровой обработки изображений платформы во время постоянной инфузии микропузырьков в мужской мыши верхний задних конечностей. Правая панель: два ROIs рисуются представлять мышц MBV и бедренных сосудов. Только для поверхностной части отсека приводящей мышцы входит в ROI как сигнал с глубиной уменьшается интенсивность. Левая панель: время интенсивности кривой от мышц MBV ROI. Вертикальные линии представляют собой уничтожение микропузырьков (MBD) с высокой энергии волн. Сразу же после MBD не контрастное вещество присутствует в плоскости изображения, которая начинает постепенно заполняют микропузырьков. После 10-15 сек был достигнут пик повышение контрастности. (B-D) После того, как был достигнут устойчивого состояния сигнала, скорость инфузии 2,5 х 109 пузыри/мл был в два раза (5, 10, 20 мкл/мин). Интенсивность сигнала от мышечной MBV (B) и бедренных сосудов (C) параллельно удвоения концентрации СРТ в циркуляции. (D) исправление мышц MBV для сигнала бедренных сосудов удаляет изменчивость в интенсивности сигнала, вызванные различными микропузырьками концентрации (N = 9;-погрешностей представляют собой стандартное отклонение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4: Измерения прижизненной микроскопии артерии Gracilis. (A) парафиновое масло уменьшает колебания gracilis артерий различных животных (которая 29.0 мкм без парафин против 17,9 мкм после применения масла) при сохранении стабильной средний базовый диаметр (73,6 мкм против 68,8 мкм; p = 0,58). (B) артериальной диаметров на базовом и после 60 мин инфузии инсулина или физиологического раствора. Инсулин после 60 мин инфузии последовательно расширенные артерии gracilis (p < 0.0001) по сравнению с солевые вливания. (C) инсулин индуцированной вазодилатация происходит в 10 мин после начала инфузии (p = 0,002) и достигает 95% максимум на 30 мин погрешностей представляют собой стандартное отклонение; непарные студент T-тест используется для статистики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5: Микрососудистых кровь объем измерений с помощью повысить контрастность УЗИ приводящей мышцы отсек мыши задних конечностей. (A) инсулина в результате последовательное увеличение MBV 30 мин после начала инфузии инсулина. (B) разница между hyperinsulinemic и базовые измерения (изменение MBV) обозначается как инсулин опосредованной микрососудистой вербовки. Инсулин индуцированной 33,5% (± 31.04%, p = 0.016; N = 7) микрососудистой найма по сравнению с солевые вливания (-10.63 ± 27.87%, N = 6). Ошибка бары представляют собой стандартное отклонение; непарные студент T-тест используется для статистики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Мы разработали технику одновременно оценить сосудистой действия инсулина на крупных артериях (с помощью IVM) и скелетных мышц микроциркуляцию (с помощью CEUS). Важнейшие шаги для успешных и надежных измерений являются: 1) правильно подвергая gracilis артерии без кровотечения; 2) предотвращение утечки нефти парафин, купание в артерии; 3) имеют патент венозного доступа (хвост вен канюли) для инфузии вазоактивных соединений (инсулина) и контрастного вещества (микропузырьков).

Изучение Микроваскулярная дисфункция в мышцах набирает внимание в контексте ожирения и инсулин сопротивление14,25,,3940. Негативные последствия ожирения и инсулин сопротивление на функции сосудистого проявляется на различных уровнях сосудистой дерева. Отныне для оценки этих изменений требуются разные подходы. Комбинированное использование методов КБПБ и CEUS в том же мышь обеспечивает мощный инструмент для количественной оценки эффекты инсулина на различных уровнях сосудистую. IVM позволяет прямой визуализации и количественный анализ сопротивления артерии и CEUS позволяет для оценки инсулин индуцированных изменений в мышцы перфузии.

Изучая приводящей мышцы отсек имеет несколько преимуществ. Артерии были легко доступны и поверхностный характер разрез делает возможным закрыть разрез кожи с 5.0 рассасывающиеся шовные стерильные после завершения эксперимента. Животные были вводят подкожно с бупренорфином после экспериментов как анальгетик в дозе 0,1 мг/кг и позволили восстановить в теплой среде. Мышей мириться процедура очень хорошо и мы испытали никаких потерь животных, ни инфекции задних конечностей в более чем 35 животных изучены. Это делает возможным проследить или изучения животных в продольные моды. Животных, используемых в этих экспериментах, однако, были под наркозом с использованием изофлюрановая 1,8% вдыхании, сбалансированный с кислородом, течет в 0,4 Л/мин хотя маски анестезии. В отличие от изофлюрановая анестезии41,42FMA анестезии не беспокоить чувствительность периферических инсулина. Будущий план заключается в изучении, как хорошо мышей оправиться от FMA анестезии.

Приводящей мышцы отсека также является полезным с различные вазоактивные соединений, посредничество местных и вниз по течению сосудистые эффекты могут быть оценены. Например возможно, с использованием superfusion методов28 или хирургических манипуляций и имплантации наркотиков элюирующие манжеты, окружающих судов43актуальным применение этих соединений в ткани-мишени. Кроме того gracilis артерии могут изолированные и учился в myograph давления. Наша группа и другие собрали значительные экспериментальные доказательства, используя давление myograph документально эффекты инсулина и других вазоактивных соединений на этом артерии ex vivo36,,3738.

Ограничение для использования метода IVM является хирургическое экспозиция мышцы и применение парафинового масла для стабилизации судов. Не ясно, было ли эти действия влияют родной среде артерии. Однако Рисунок 3A показывает, что базовый диаметр артерии gracilis, купались в парафинового масла существенно не меняется. Было также показано, что минеральное масло успешно препятствует диффузии кислорода, защищая ткани от hyperoxic условий44. Кроме того масло помогает уменьшить различия в базовых диаметр артерий. Именно поэтому мы выступаем за использование парафиновое масло и пусть остальные подготовку по крайней мере 30 минут. Следует отметить использование буферизации физраствора вместо масло или масло не на всех-привело к высоко вариабельные диаметров и сужения сосуда (данные не показаны). Кроме того, в конце экспериментов, изолированные артерий gracilis – купались в парафиновое масло – и испытания их реактивности в myograph давление ex vivo. Парафин нефти купались артерий отреагировали аналогичным образом контролировать артерий при стимуляции с инсулина и ацетилхолин (сосудорасширяющее) (данные не показаны). Последовательное инсулин индуцированной вазодилатация ясно показывает, что протокол КБПБ, описанный в настоящем исследовании производит надежные результаты.

Преимущество применения обоих методов в том же мыши преодолевает некоторые внутренние ограничения одного метода другим: CEUS оценкам MBV в нетронутой мышц в естественных условиях, но не может рассматриваться в отдельных судов; IVM делает его можно увидеть отдельных судов, хотя он не может оценить MBV. Будущий план состоит в использовании КБПБ микроскопии cremaster мышц в сочетании с CEUS мышца на контралатеральную сторону. Эта модификация может обеспечить оценку MBV (с помощью CEUS) и прямой оптический доступ к капилляров (с помощью IVM). Протокол может быть далее изменен; 4-контактный разъем для хвоста канюля может быть переключена на 5-контактный разъем. При этом мы можем избежать отсоединения трубки анестезии при выполнении второго измерения CEUS (описанный в пункте 2.9). По нашему опыту мышей хорошо переносится текущий протокол. Еще одно изменение, которые могут быть сделаны к настоящему Протоколу ставка инсулина зажим используется. Мы использовали 7,5 зажим му/кг/мин скорость, который считается выше физиологические. В зависимости от исследования могут использоваться более низкий уровень инсулина зажим (к примеру 3 му/кг/мин).

Хотя мы нашли описывается протокол надежного, существуют конкретные ограничения, которые требуют внимания. Существуют ситуации, когда измерение артериального диаметр не является оптимальным. Выполнение подготовительных действий требует некоторый опыт работы с моделью. Важно, что парафиновое масло не приводили к утечке из среды судна как дополняющего ее с новой нефти будет беспокоить судна и изменять диаметр, что делает необходимым позволить артерии отдыха еще 30 мин. Кроме того отражения света (описано в шаге 1.14 Протокола) на поверхности парафинового масла иногда было слишком ярким, что делает его трудным для просмотра артерии. Это может противодействовать путем направления источника света так, что свет падает под углом к парафинового масла поверхности и параллельно артерии.

В заключение сочетание методов КБПБ и CEUS описанные в данном исследовании делает возможным количественно оценить различные эффекты инсулина на различных уровнях сосудистую. IVM gracilis артерии обеспечивает проницательность в вышестоящий сосудистых изменений, способствующих течению микрососудистой перфузии, измеряется с помощью CEUS. Мы выступаем за сочетание нескольких экспериментальных методов в том же мышь лучше оценить функцию сосудов.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Ing. Дункан Ван Groen для программирования изображения анализа программного обеспечения (ImageGrabber), используемые в данном исследовании. Финансирование этого исследования была предоставлена ВиДи грант от Нидерландов организация научных исследований (Грант 016.136.372).

Materials

C57BL/6 Mice Charles river Mice used were bred in-house
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009 Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Vortex VWR international 58815-234
Heating pad  Pantlab
Freestyle Precision Xceed  Abbott To measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp
Insulin Novorapid Novo Nordisk
Glucose monohydrate  Merck Millipore 1083421000
Buffered saline solution B. Braun 152118062
PE-20 medical tubing Becton, Dickinson and Company 427405
Needle, 27 Gauge  Becton-Dickinson & Co 305109
Medical tape 3M
Ultrasound probe holder Built In-house
Cotton swabs Multiple Equivalent
Creme depilator Multiple Equivalent
Gel tissue adhesive Derma+flex GA30005-2222
Infusion pump Harvard Apparatus Harvard Apparatus PHD 2000
Small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
Needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
Stereomicroscope Olympus SZX12
Camera Basler scA1390-17gc
Image Grabber program Built in-house Image acquisition system
Timer VWR 33501-418
Syringes, 1 ml Fisher 14-817-25
Light source, fiber-optic Schott KL1500 Ideally has adjustable arms
Paraffin oil Multiple Equivalent
Name Company Catalog Number Comments
Microbubbles
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine  Avanti Polar Lipids 850365C
polyoxyethylene stearate   Sigma p3440
perfluorobutane gas  F2 Chemicals C4F10(g)
Decon FS200 ultrasonic bath  Decon Ultrasonics Ltd
Vialmix  Lantheus Medical Imaging 515370-0810
Multisizer Coulter Counter Beckman Coulter Inc
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Rowe, J. W., Andres, R. Glucose intolerance in uremia. Quantification of pancreatic beta cell sensitivity to glucose and tissue sensitivity to insulin. The J Clin Invest. 62, 425-435 (1978).
  2. Chiu, J. D., et al. Direct administration of insulin into skeletal muscle reveals that the transport of insulin across the capillary endothelium limits the time course of insulin to activate glucose disposal. Diabetes. 57, 828-835 (2008).
  3. Herkner, H., et al. Transcapillary insulin transfer in human skeletal muscle. Eur J Clin Invest. 33, 141-146 (2003).
  4. Yang, Y. J., Hope, I. D., Ader, M., Bergman, R. N. Insulin transport across capillaries is rate limiting for insulin action in dogs. J Clin Invest. 84, 1620-1628 (1989).
  5. Clerk, L. H., et al. The vasodilatory actions of insulin on resistance and terminal arterioles and their impact on muscle glucose uptake. Diabetes Metab Res Rev. 20, 3-12 (2004).
  6. Vincent, M. A., et al. Microvascular recruitment is an early insulin effect that regulates skeletal muscle glucose uptake in vivo. Diabetes. 53, 1418-1423 (2004).
  7. Barrett, E. J., et al. The vascular actions of insulin control its delivery to muscle and regulate the rate-limiting step in skeletal muscle insulin action. Diabetologia. 52, 752-764 (2009).
  8. Vincent, M. A., Clerk, L. H., Rattigan, S., Clark, M. G., Barrett, E. J. Active role for the vasculature in the delivery of insulin to skeletal muscle. Clin Exp Pharmacol Physiol. 32, 302-307 (2005).
  9. Clark, M. G., Rattigan, S., Barrett, E. J., Vincent, M. A. Point: There is capillary recruitment in active skeletal muscle during exercise. J Appl Physiol (1985). 104, 889-891 (2008).
  10. Wallis, M. G., et al. Insulin-mediated hemodynamic changes are impaired in muscle of Zucker obese rats. Diabetes. 51, 3492-3498 (2002).
  11. Eringa, E. C., Stehouwer, C. D., Roos, M. H., Westerhof, N., Sipkema, P. Selective resistance to vasoactive effects of insulin in muscle resistance arteries of obese Zucker (fa/fa) rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, 1134-1139 (2007).
  12. Bonner, J. S., et al. Muscle-specific vascular endothelial growth factor deletion induces muscle capillary rarefaction creating muscle insulin resistance. Diabetes. 62, 572-580 (2013).
  13. Kubota, T., et al. Impaired insulin signaling in endothelial cells reduces insulin-induced glucose uptake by skeletal muscle. Cell Metab. 13, 294-307 (2011).
  14. Levy, B. I., et al. Impaired tissue perfusion: a pathology common to hypertension, obesity, and diabetes mellitus. Circulation. 118, 968-976 (2008).
  15. Schelbert, H. R. Coronary circulatory function abnormalities in insulin resistance: insights from positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 53, 3-8 (2009).
  16. Wong, T. Y., et al. Associations between the metabolic syndrome and retinal microvascular signs: the Atherosclerosis Risk In Communities study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 2949-2954 (2004).
  17. Bonadonna, R. C., et al. Role of tissue-specific blood flow and tissue recruitment in insulin-mediated glucose uptake of human skeletal muscle. Circulation. 98, 234-241 (1998).
  18. Ellmerer, M., et al. Reduced access to insulin-sensitive tissues in dogs with obesity secondary to increased fat intake. Diabetes. 55, 1769-1775 (2006).
  19. Ellmerer, M., et al. Physiological hyperinsulinemia in dogs augments access of macromolecules to insulin-sensitive tissues. Diabetes. 53, 2741-2747 (2004).
  20. Vincent, M. A., et al. Mixed meal and light exercise each recruit muscle capillaries in healthy humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, 1191-1197 (2006).
  21. de Jongh, R. T., Serne, E. H., RG, I. J., de Vries, G., Stehouwer, C. D. Impaired microvascular function in obesity: implications for obesity-associated microangiopathy, hypertension, and insulin resistance. Circulation. 190, 2529-2535 (2004).
  22. Ketel, I. J., et al. Obese but not normal-weight women with polycystic ovary syndrome are characterized by metabolic and microvascular insulin resistance. J Clin Endocrinol Metab. 93, 3365-3372 (2008).
  23. Khan, F., et al. Impaired microvascular function in normal children: effects of adiposity and poor glucose handling. J Physiol. 551, 705-711 (2003).
  24. Clark, M. G. Impaired microvascular perfusion: a consequence of vascular dysfunction and a potential cause of insulin resistance in muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295, 732-750 (2008).
  25. Serne, E. H., et al. Impaired skin capillary recruitment in essential hypertension is caused by both functional and structural capillary rarefaction. Hypertension. 38, 238-242 (2001).
  26. Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
  27. Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg Endosc. 17, 939-942 (2003).
  28. Cardinal, T. R., et al. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front Physiol. 2, 91 (2011).
  29. Duling, B. R. The preparation and use of the hamster cheek pouch for studies of the microcirculation. Microvasc Res. 5, 423-429 (1973).
  30. Wei, K., et al. Quantification of myocardial blood flow with ultrasound-induced destruction of microbubbles administered as a constant venous infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
  31. Clerk, L. H., Rattigan, S., Clark, M. G. Lipid infusion impairs physiologic insulin-mediated capillary recruitment and muscle glucose uptake in vivo. Diabetes. 51, 1138-1145 (2002).
  32. Barrett, E. J., Keske, M. A., Rattigan, S., Eringa, E. C. CrossTalk proposal: De novo capillary recruitment in healthy muscle is necessary. J Physiol. 592, 5129-5131 (2014).
  33. Aman, J., et al. Effective treatment of edema and endothelial barrier dysfunction with imatinib. Circulation. 126, 2728-2738 (2012).
  34. Boer, M. P., et al. Globular adiponectin controls insulin-mediated vasoreactivity in muscle through AMPKalpha2. Vascul Pharmacol. 78, 24-35 (2016).
  35. van den Brom, C. E., et al. Myocardial Perfusion and Function Are Distinctly Altered by Sevoflurane Anesthesia in Diet-Induced Prediabetic Rats. J Diabetes Res. 2016, 5205631 (2016).
  36. Meijer, R. I., et al. Perivascular adipose tissue control of insulin-induced vasoreactivity in muscle is impaired in db/db mice. Diabetes. 62, 590-598 (2013).
  37. Meijer, R. I., et al. Insulin-induced changes in skeletal muscle microvascular perfusion are dependent upon perivascular adipose tissue in women. Diabetologia. 58, 1907-1915 (2015).
  38. Sun, D., Kaley, G., Koller, A. Characteristics and origin of myogenic response in isolated gracilis muscle arterioles. Am J Physiol. 266, 1177-1183 (1994).
  39. Jonk, A. M., et al. Microvascular dysfunction in obesity: a potential mechanism in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance and hypertension. Physiology (Bethesda). 22, 252-260 (2007).
  40. Wiernsperger, N., Nivoit, P., De Aguiar, L. G., Bouskela, E. Microcirculation and the metabolic syndrome. Microcirculation. 14, 403-438 (2007).
  41. Horber, F. F., et al. Isoflurane and whole body leucine, glucose, and fatty acid metabolism in dogs. Anesthesiology. 73, 82-92 (1990).
  42. Sui, H., et al. Quantifying insulin sensitivity and entero-insular responsiveness to hyper- and hypoglycemia in ferrets. PLoS One. 9, 90519 (2014).
  43. Pires, N. M., et al. Local perivascular delivery of anti-restenotic agents from a drug-eluting poly(epsilon-caprolactone) stent cuff. Biomaterials. 26, 5386-5394 (2005).
  44. Young, D. A., Chi, M. M., Lowry, O. H. Energy metabolism of skeletal muscle biopsies stimulated anaerobically without load in vitro. Am J Physiol. 250, 813-820 (1986).

Tags

Intravital MicroscopyContrast-enhanced UltrasonographyMouse HindlimbInsulin-induced VasodilationMuscle PerfusionType 2 DiabetesObesityInsulin SensitivityOrgan Blood FlowCD57 BL6 Male MouseAdductor CompartmentFemoral ArteryEpigastric ArteryGracilis ArteryDeep FasciaParaffin Oil

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Turaihi, A. H., van Poelgeest, E. M., van Hinsbergh, V. W. M., Serné, E. H., Smulders, Y. M., Eringa, E. C. Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion. J. Vis. Exp. (121), e54912, doi:10.3791/54912 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image