Bir SAXS beamline Online Boyut dışlama ve İyon değişim Kromatografi

Bir D5 Silme Protein 1. Çevrim Hazırlanması açıklaması ve Örnek Nesil Not: 18 tarif edildiği gibi D5 323-785 yapısı (Şekil 1 A), klonlanmış ifade edildi ve saflaştınldı. PProEx HTB vektörüne yapı Clone üreticinin tavsiye Aşağıdaki 5'-GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 've 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3' primerleri polimeraz ile PCR reaksiyon karışımı kullanılarak D5R bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) uygulayın. Üreticinin tavsiye aşağıdaki spin sütunları üzerinden PCR parçaları arındırın. Tampon bileşimi ve kuluçkalama süresi için üreticinin tavsiyelerine uyarak, PCR parçalarını ve Ncol ve Hindlll sınır enzimleri ile plazmid Digest. , 0.5x TAE tamponunda bir% 1 agaroz jeli üzerinde parçaları (20 mM Tris, 10 mM asetik asit başlatve 0.5 mM EDTA) ve DNA boyası ile jel leke. UV ışığına jel Açığa. Dikkat: Kişisel güvenlik ekipmanlarını giyinin! üreticinin tavsiyelerini takip sindirilmiş PCR parçalarının bantları ve sindirilmiş plazmid kesip bir jel saflaştırma spin kolon kiti kullanarak DNA arındırmak. Hızlı bir ligasyon kiti kullanılarak imalatçının talimatları takip edilerek plazmide arıtılmış PCR parçalarını birbirine bağlamak. plazmid amplifikasyon için optimize yetkili bakteri içine ligasyon reaksiyonu ısı şoku üzerinden ürün Transform. bakteri şişeye Ligasyon ürünü yarısı ekleyin. 20 dakika boyunca buz üzerinde, reaksiyon tüpü inkübe edin. 30 sn için 42 ° C 'de tüp inkübe edin. 2 dakika boyunca buz üzerinde tüp yerleştirin. 1 Luria Bertani mL (LB) suyu (Miller), antibiyotikler olmadan ekleme ve hücreler 1 saat boyunca 37 ° C'de geri sağlar. 16.100 xg fo hücreleri aşağı Spinr3 bir masaüstü mikrotüp santrifüj lar ve orta çoğu kaldırın. ampisilin (50 ug / ml nihai) ile LB agar plakası üzerine hücrelerinin yayılmasını ve koloniler, gece boyunca 37 ° C'de büyütülmüştür sağlar. ampisilin (50 ug / ml nihai) ile LB 3 mL içinde bir koloni koyun ve bir gece boyunca 160 rpm'de çalkalanarak, 37 ° C'de kültür büyür. plazmid ayıklamak için miniprep kiti talimatı uygulayın. sıralaması için plazmid bir örnek göndermek ve mutasyonların olmadığı için ve doğru biçimde takılmak üzere dizisini analiz. PProEx HTB D5 323-785 protein ekspresyonu için optimize bakteri içine inşa (1 uL kullanın ve adım 1.1.7 adımları izleyin) Transform. ampisilin (50 ug / ml nihai) ile LB agar plakası üzerine bakterileri. bir başlangıç ​​kültürü oluşturmak için, ampisilin (50 ug / ml nihai) ile LB 300 mL bir koloni koymak ve 160 r çalkalanarak 37 ° C'de bakterileri büyümeyepm gecede. Ampisilin mevcudiyetinde LB 12 x 1 L inoküle (50 ug / ml nihai), 37 ° C de pProEx HTB D5 323-785 bakteri başlatıcı kültürün 20 mL her biri bir OD kadar 600 = 0.3 ulaşılır. 18 ° C'ye düşürülür ve 1 mM IPTG ile OD 600 = 0.5 de ifadesini teşvik eder. 160 rpm ve 18 ° C gecede onları sallayarak, kültürleri inkübe. 50.000 x g'de 30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj ile bakteriler hasat. (50 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI, 5 mM MgCI2, 10 mM β-merkaptoetanol ve% 10 gliserol), 1x proteaz inhibitörü ile ve 25 ünite (lizis tamponu, yaklaşık 150 mL bakteriyel pelet yeniden süspanse U) / 10 ml DNaz. buz üzerinde sonikasyon yoluyla lyse bakteriler (1 inç probu,% 50 güç, 0,5-s nabız, 0,5-s duraklama, 3x 5 dk). nikel afinite sütunu (Ni-kolonu, 1.5 ml yatak hacmi) süpernatanların yerleştirin ve B için 10 kolon hacminde (CV) ile yıkayıntampon INDING (50 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI, 10 mM β-merkaptoetanol ve% 10 gliserol), yıkama tamponu 10 CV (50 mM Tris-HCI [pH 7], 1 M NaCl, 10 mM β-merkaptoetanol ve% 10 gliserol), ve imidazol yıkama 10 CV (50 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI, 10 mM β-merkaptoetanol,% 10 gliserol, ve 30 mM imidazol). D5 323-785 Zehir (20 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI, 10 mM β-merkaptoetanol,% 10 gliserol, 200 mM imidazol). sodyum dodesil sülfat (SDS) -poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile farklı saflaştırma aşamaları kontrol edin. Yük 2-20 uL her bir saflaştırma adımı akış 1x yükleme boyası ile karıştırılmış a, 10 (2x% 4 SDS,% 20 gliserol, 120 mM Tris-HCI [pH 6.8] ve% 0.02 ağırlık / mavi birim bromofenol) % SDS jel ve çalışan tampon 1x Laemmli 200 V'da çalıştırmak (25 mM Tris, 0.192 M glisin, ve% 0.1 SDS) eritilmiştir. hazır kullanımlı Coomassie mavisi solüsyonu ile jel leke. hariçhange, üreticinin kılavuzuna göre bir tuz giderme kolonu kullanılarak bağlama tamponu ile yıkandı protein tamponu. Protein çözeltisine Tütün Etch Virüsü Nükleer dahil-a endopeptidaz (TEV, protein 1 mg / 100 mg) ilave edilerek His-tag bölmektedir. Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. SDS-PAGE gerçekleştirerek sindirim kontrol edin (adım 1.5 bakınız) bağlama tamponu içinde Ni-sütunu dengelenmesi. protein çözeltisi geçmesine ve flow-through toplarken imidazol yıkama tamponu 2 CV ile boncuk yıkayın edelim. 0.5 mL'lik nihai bir hacme kadar bir santrifüj konsantratör kullanılarak protein konsantre edilir. jel filtrasyonu tamponu ile dengelenmiş bir boyut dışlamalı kolonuna yoğunlaştırılmış protein enjekte (20 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI,% 10 gliserol ve 1 mM ditiotreitol [DTT]). 0.5 ml fraksiyonlar halinde akış yoluyla toplayın. pik örnekleri ile protein varlığı ve saflığını kontrolSDS-PAGE performans (adım 1.5 bakınız). D5 323-785 arasında elüt tepe kısımları birleştiriniz. 20 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI,% 10 gliserol ve 1 mM DTT protein çözeltisi, 5 mL için (sabit Tris DTT konsantrasyonlarını tutarken 25 mM NaCI numune ve% 5 gliserol ile seyreltilir, Önce, 20 mM Tris-HCI [pH 7] ve 1 mM DTT 5 mL, ve daha sonra 20 mM Tris-HCI [pH 7], 5% gliserol, 1 mM DTT) 20 ml. bir iyon değişim kolonuna örnek yükleyin. tampon kullanarak (20 mM Tris [pH 7], 25 mM NaCl,% 5 gliserol ve 1 mM DTT) ve tampon B (20 mM Tris [pH 7], 1 M NaCl,% 5 gliserol ve 1 mM DTT) içinde 25 mM ile 1 M'ye bir tuz gradyanı oluşturulması için 1.5 mL parçalara ayrıştırılmıştır proteini toplamak. SDS-PAGE gerçekleştirerek pik örneklerinde protein varlığı ve saflığını kontrol (adım 1.5 ve Şekil 1B'ye bakınız) 0.5 mL'lik nihai bir hacme kadar bir santrifüjlü konsantre protein çözeltisi Reconcentrate. Rerun, jel süzme tamponu içinde bir boyut-eksklüzyon kolonu üzerine konsantre edilmiş protein (20 mM Tris-HCI [pH 7], 150 mM NaCI,% 5 gliserol, 1 mM DTT, adım 1.11 bakınız). 2. Veri Toplama NOT: mümkün olduğunca erken Talebi ışın zamanı. SDBY için mevcut erişim türleri ve bir dilekçe nasıl kılavuzlar bulunabilir: http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . Teklifin kabulü ve deney için bir davetiye sonra, tüm katılımcıların güvenliği eğitimlerini tamamlamak zorunda. Eğitim onaylanmasından sonra, numuneler üzerinde gerekli güvenlik bilgisi ile birlikte deney için beamline ziyaret araştırmacıları beyan etmek (SDBY kullanıcı portalı üzerinden) "Bir-form" doldurun. Denemeyi görüşmek üzere yerel irtibat görevlisine başvurun. SEC-SAXS veri toplama NOT: ONL içinine arıtma, BM29 kurulu yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) sistemini kullanıyoruz. Sistem, bir in-line gaz alıcı, ikili pompa, tampon seçimi ve gradyanlar, bir otomatik numune alıcı, bir UV dizi fotospektrometre ve kondüktivimetre için bir valf içerir. Doğrudan SAXS maruz birimi 19 akış kapiler takılır. kenara jel filtrasyon 1 ml tampon koyun. SEC sistemine tampon şişe takın (varsayılan Liman A). Kullanılan sütun bağlı olarak akış oranını seçin. Not: Burada kullanılan boyut dışlamalı sütun için, akış hızı 0.1 mL / dakikadır. , Sütun için maksimum basıncı tanımlayın geri basınç dikkat ve en az 1.2 CV edinimi süresi ayarlayın. "Otomatik tasfiye" fonksiyonu ile pompa ve yukarı tüpler yıkayın. Sistem tamponu ile dolana kadar bekleyin ve sütun bağlayın. en az 1.5 CV geçerek sütun dengeye. interlokdolap nedeniyle radyasyon hasarı sinyal değişimi kontrol etmek için numune değiştirici kullanırken, adım 2.1.1 kenara tampon ölçün. tampon radyasyon hasar olup olmadığını sadece devam ediyor. HPLC moduna beamline kontrol sistemini açın. kare başına 1 sn ile 200 kare toplama, tampon bir deneme sürüşü yapın. özetlenebilir yoğunluk arsa detektör tarafından verilen sayıyı yazın. NOT: Sinyal önce ölçülen tampon eşleşmesi gerekir, ve zamanla özetlenebilir yoğunluğu sabit kalmalıdır. Sinyal eşleşen ya da sabit değildir takdirde, sistemin daha uzun bir dengeleme gereklidir. En az 10 dakika süreyle bir masaüstü mikrotüp santrifüj 13.000 xg'de örnek aşağı doğru döndürün. (Verilen) HPLC-uyumlu cam şişenin içine örnek doldurun ve otomatik enjektör koydu. kuyu konumuna dikkat edin. Kullanıcı Güvenliği Eğitimi açıklandığı gibi, standart prosedür kullanılarak deneysel baraka kilitlenebilir. giriş yapın ve beamline kontrol yazılımı sayesinde veri depolama için bir klasör oluşturun. "Hızlı toplu" özelliğini kullanarak HPLC sistemi programlayın. Adım 2.1.10 oluşturduğunuz klasöre UV veri depolama konumunu ayarlayın. Aynı klasörde ASCII dosyasını depolamak, UV verilerinin otomatik ASCII dönüşümünü aktive etmek için emin olun. Enjeksiyon hacmi ve iyi pozisyon seçin. "Başlat" düğmesine basarak sıraya ölçümü ekleyin. Yazılım toplu kaydetmek için sorar. kaydetmek için hazırlayın, ama bu otomatik ölçümü başlar, "Kaydet" düğmesine basmayın. beamline kontrol yazılımı veri toplama parametrelerini ayarlayın. Toplam veri toplama süresi aşama 2.1.2 tanımlanan edinim süresi biraz fazla olacak şekilde kare sayısını seçin. Emniyet deklanşör açın ve beamline kontrol yazılımı kullanarak SAXS veri toplama başlar. veri kor olduğundan emin olundüzgün biçimde satın aldı. Adım 2.1.6 toplanan verilere yeni toplanan verileri karşılaştırmak ve toplanır yoğunluğu sayımların sayısı en az 100 kare için sabit kalır ve adım 2.1.6 değeri ile eşleşen olmadığını kontrol edin. Adım 2.1.11 gibi hazırlanan SEC, "Kaydet" düğmesine basarak çalıştırın başlayın, ve enjeksiyon tamamlanmış ve UV veri toplama başlar zaman camserver yazılımında görüntülenen kare numarasını not alın. Veri toplama sonra, Açık'ta "veri toplama" sekmesine ISPyB veritabanını 20 açın ve veri seti ve otomatik analiz 21 sonuçlarını erişmek için "git" düğmesine basın. IEC-SAXS veri toplama Not: Bunun yerine sık IEC deneyleri için sürekli lineer gradyan tampon B miktarı, önceden belirlenmiş farklı aşamalarda artan edildiği bir adım adım gradyanı kullanın. Bir sampl HPLC program oluşturunE-ücretsiz tampon çalıştırın. adım adım gradyanı% 0 tampon B başlayan ve tampon B% 100 ulaşana kadar iki CV sonra 5 puan artarak programlayın. bir kenara, her tampon bazı koyun. port A düşük tuz tampon A ve liman B. yüksek tuz tampon B ile biri ile şişeyi bağlayın akış hızı seçin ve sütun basınç limiti altında kalmak (bu örnekte, 1 mL / dakika). Adım 2.1.3 gibi, "auto-tasfiye" işlevini kullanarak pompa ve yukarı tüp yıkayın. düşük tuz tamponu A sistemi dengeye (adım 1.15) ve iyon değiştirme sütunu bağlayın. Kolon tamamen (en az 1,5 CV) dengelenir kadar bekleyin. Adım 2.1.5 olarak, örnek değiştirici kullanarak radyasyon hasar tamponlar A ve B incelemek için adım 2.2.2 kenara tampon kullanın. tampon adım 2.1.6 gibi sütunun çıkan edin. Aşama 2.2.6 kaydedilen tampon A sinyale Karşılaştırması. tekrar Notözetlenebilir yoğunluk arsa sayımların sayısı. tampon çalıştırmak için veri depolama için bir klasör oluşturun. HPLC sistemi modunda kurmak veri toplama. toplam veri toplama zamanı IEC vadede toplam zamanı aşan böylece kare sayısını seçin (adım 2.2.1 bakınız). Emniyet deklanşör açın ve SAXS veri toplama başlar. doğru ilerler emin olun ve toplanır yoğunluk en az 100 kare için adım 2.2.7 not değerde sabit kalır çift kontrol edin. HPLC yazılımı "Tek Çalıştır" özelliğini kullanın ve adım 2.2.1 programlanmış adım adım degrade başlatın. Enjeksiyon için bu adımda herhangi bir örnek enjekte etmek için -1 şişe sayısını ayarlamak. Program başladığında iktisap edilen kare sayısını yazın. Örnek çalıştırmak için HPLC programı oluşturun. (Tampon B. Tahmini% 0 aşamasında 1.1.5 çevrimdışı ölçülen her zirvede tampon B yüzdesi başlayarak adım adım degrade Program <strong> Şekil 1B). Tam 1 puanlık altında ve 1.5 puan faiz doruklarına üzerinde en az 3 adım, 2.5 CV (Şekil 1C) için her ayarlayın. 2.5 CV% 100 tampon B'de bir son adımı ekleyin. En az 10 dakika süreyle bir masaüstü mikrotüp santrifüj 13.000 xg'de örnek aşağı doğru döndürün. 20 mM Tris-HCI [pH 7],% 10 gliserol ve 1 mM DTT ile karıştırılarak tampon A (25 mM) bir tuzu konsantrasyonu D5 323-785 seyreltilir. kolona elle örnek yükleyin. hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için pompa duraklatma sonra seyreltilmiş numune içine bir tampon bir giriş tüpü koyun. doğrudan akış yoluyla sütundan toplamak dedektörleri sütunu ayırın. Numune kabı boşaldığında, (tüp taşırken yine pompaları duraklatma) tampon A içine girdi tüp dönmek ve sütun tüp örnek aktarmak için tampon A ile pompalama yeniden başlatın. Tüm örnek olmuştur kezYüklenen, tampon A 2 CV geçmek ve daha sonra dedektörleri sütun bağlayın. numune çalışması için, veri depolama için bir klasör oluşturun. Emniyet deklanşör açın ve SAXS veri toplama başlar. veri toplama doğru ilerler emin olun ve toplanır yoğunluk en az 100 kare için adım 2.2.7 not değerde sabit kalır çift kontrol edin. Adım 2.2.12 programlanan adım adım degrade başlatmak için HPLC yazılımı "Tek Çalıştır" özelliğini kullanın. Enjeksiyon için bu adımda herhangi bir örnek enjekte etmek için -1 şişe sayısını ayarlamak. Program başladığında iktisap edilen kare sayısını yazın. Açık ISPyB 20 "veri toplama" ve basın veri seti ve otomatik analizi 21 bakmak için "git". "Postrun Analizi" yazılımı aracılığıyla, ASCII biçimine HPLC sistemine UV verilerini dışa aktarın. 3..SEC-SAXS Veri Azaltma ve Analiz "Git" düğmesine basarak ISPyB veri edinimi verileri açın. SAXS veri toplama çerçeveleri genel belirlemek elüsyon tepe karşılık gelmektedir. dönme yarıçapı zirve boyunca sabit olduğundan emin olun. Otomatik tampon düzeltme doğru olarak yapıldığını doğrulayın. 22 dosyaları ve bunları ortalama deneysel SAXS verilerle manipülasyonlar gerçekleştiren bir programa tepe orta kesiminde yük çerçeveleri. Ardından, otomatik olarak oluşturulan tampon dosyasını yüklemek ve ortalama kare yüksek q bölgeleri ve tampon çerçeveleri maç olmadığını kontrol edin. Kantitatif CORMAP testi 23 kullanılarak zirve boyunca edinilen çerçeveleri karşılaştırın. ilgi bölgeyi kapsayan çerçeve otomatik olarak oluşturulan çıkarmalar (* _sub.dat dosyaları) yükleyin. "Ölçek" düğmesine basarak onları birbirine Scale. karş"Veri Karşılaştırma" özelliğini kullanarak bunları e. zirve boyunca Çerçeveler arasında hiçbir sistematik bir değişiklik olmamalıdır. Tüm ilgi çekici * -_ sub.dat çerçeveleri açın "Birleştirme" düğmesini kullanarak onları birleştirme ve Dat formatında birleştirilmiş dosyayı kaydedin. düşük çözünürlükte veri daha sonra kırpma için Guinier aralıktaki ilk veri noktasını belirterek, programda "Radius dönme" aracı ile dönme yarıçapı belirleyin. Programda "Uzaktan Dağıtımı" aracıyla çift mesafeli dağıtım fonksiyonunu belirlemek ve gnom.out olarak ortaya çıkan .out dosyayı kaydedin. 4. Ab İnitio Modelleme Unix makinada, simetri kısıtlama olmadan 40 x ab initio modeli yeniden programını çalıştırın. Yeni bir klasör oluşturun ve buna gnom.out dosyasını kopyalayın. aşağıdaki gibi programı çalıştırın: için ((i = 1; i = 40 <; i ++)); gnom.out -ms -p dammifp1_ $ i dammif yapmak; dbir Benzer şekilde, ikinci bir klasöre altı kat simetri için simetri kısıtlamaları ile bir ab initio modeli yeniden programı çalıştırın: için ((i = 1; i = 40 <; i ++)); do dammif gnom.out -ms -s P6 -p dammifp6_ $ i; tamam Tüm ab initio modeli yeniden programı çıktı dosyalarını aynı hizaya getirin (* -1.pdb). adımlarda 4.1 ve 4.2 iki klasörlerinde, damaver -a * -1.pdb çalıştırın. Tüm modellerde (damaver.pdb) yanı sıra uygun bir moleküler görüntüleme yazılımı 26 doğru hacmi (damfilt.pdb) süzülmüş modelin birliği açın ve bunları karşılaştırmak. bir metin düzenleyicisinde damsel.log dosyasını açın. Dosyanın altındaki "referans" olarak listelenen modeli en iyi temsil eden bir modeldir. 5. IEC-SAXS Veri Azaltma, Analiz ve Modelleme Deneysel SAXS veri dosyaları 22 manipülasyonu yerine programında, yaklaşık 50 SAXS her karıştırma aşamasından kare yüktampon çalıştırmak, "ORTALAMA" düğmesine basın ve sonuçları kaydedin. ISPyB üzerinden kullanılabilir otomatik işleme sonuçlarına dayanarak, deney çerçeveleri hangi belirlemek protein elüsyon uygun ve dönme (ön) yarıçapı tepe boyunca sabit olduğundan emin olun. Deneysel SAXS veri dosyaları işleme programı 22 içine çerçeveleri yükleyin ve tampon çerçeveleri (bkz: adım 5.1) için yapıldığı gibi, onları ortalama. Ardından, adım 5.1 oluşturulan tampon dosyaları yüklemek ve zirveden ortalamasını eşleşen bir tampon bulmak için (4.2 nm -1 üstünde) yüksek q bölgeleri karşılaştırın. NOT: tepe ve tampon ortalaması arasındaki ofset sistematik olmalıdır. Örnek eğrisi iki tampon eğrileri arasındaki düşmek görünüyorsa, ortalama hesaplayarak kendi eğrileri enterpolasyon. tepe kısmının ortalama saçılma eğrisinin en iyi eşleşme olarak tanımlanan tampon çıkarma ve elde edilen subtr tasarrufhareket dosyası. Buna ek olarak, çıkarma hata marjı tahmin etmek önceki ve sonraki karıştırma adımları ortalama tampon eğrileri kullanılarak Çıkarılmış eğriler oluşturmak. Tekrarlayın tepe sol ve sağ yarısı için ayrı ayrı 5,3 ve 5,4 adımları ve zirve boyunca sinyal istikrarı kontrol etmek için adım 5.4 gelenler sonuçları karşılaştırın. adımları adım 5.4 den üç çıkarılır eğriler için 3.5 ve 3.6 izleyin. Her üç çıkarılır eğriler için sonuçları karşılaştırın. Not: çıkarma hata payı içinde sağlam kalır Yalnızca sonuçlar güvenilir olabilir. adım 5.3 tanımlanan iyi çıkartma için 4.1 ve 4.2 adımları olarak modelleme gerçekleştirin. modelleri hizalamak için 4.5'e 4.3 adım ve en iyi temsil eden bir tespit izleyin. Sonuçların 6. Karşılaştırılması SEC temsilcisi modelleri 12 3D yapılar üst üste bir programı çalıştırmak (adım 4.5) birP6 simetri d IEC SAXS verileri (5.9 adım): supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb model_sec.pdb ve moleküler görüntüleme yazılımı içine model_iec-r.pdb alın. modelsec.pdb ve .fir dosya ve bir e-tabloda modeliec-r.pdb açın ve deneysel ve hesaplanan saçılma eğrileri 2D grafik oluşturmak.