SAXS 빔라인에 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토 그래피

D5 삭제 단백질 1. 오프라인 준비에 대한 설명 및 샘플 생성 참고 : 18 바와 같이 D5 323-785 구조 (도 1a)의 클로닝 발현 및 정제 하였다. pProEx HTB 벡터에 구조를 복제 제조자의 권고 다음 5'- GCGCCATGGGTAATAAACTGTTTAATATTGCAC-3 '와 5'-ATGCAAGCTTTTACGGAGATGAAATATCCTCTATGA-3'프라이머 및 효소와 PCR 반응 혼합물을 사용 D5R상에서 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행한다. 제조자의 권고에 따라 스핀 컬럼을 통해 PCR 단편을 정제 하였다. 버퍼 조성물 및 배양 시간에 대한 제조자의 권장 사항에 이어 PCR 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단하고, 제한 효소로 소화 플라스미드. , 0.5X TAE 완충액 1 % 아가 로스 겔에서 단편 (20 mM 트리스, 10 mM의 아세트산을 실행0.5 mM의 EDTA) 및 DNA의 염료로 젤을 염색. 자외선에 젤을 노출. 주의 : 개인 안전 장비를 착용! 제조자의 권고에 따라, 분해 된 PCR 단편의 밴드 분해 된 플라스미드를 절단하고 겔 정제 스핀 컬럼 키트를 사용하여 DNA를 정제. , 빠르고 라이 게이션 키트를 사용하여 제조자의 권장 사항에 따라 플라스미드로 정제 된 PCR 단편을 결찰. 플라스미드 증폭에 최적화 능력 세균에 연결 반응에서 열 쇼크를 통해 제품을 변형. 박테리아의 유리 병에 결찰 제품의 절반을 추가합니다. 얼음에서 20 분 동안 반응 튜브 인큐베이션. 30 초 동안 42 ° C에서 튜브를 품어. 2 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. 1 루리아 베르 타니의 ㎖ (LB) 국물 (밀러) 항생제없이 추가하고 세포를 1 시간 동안 37 ° C에서 복구 할 수 있습니다. 16,100 XG FO에서 세포를 스핀 다운R 3 탁상 마이크로 튜브 원심 분리기에서 s와 매체의 대부분을 제거합니다. 암피실린 (50 μg의 / ML의 최종)와 함께 LB 한천 플레이트에 세포를 확산하고 식민지 하룻밤 37 ° C에서 성장 할 수 있습니다. 암피실린 (50 μg의 / ML의 최종)와 LB의 3 mL의에 식민지를 넣고 하룻밤 동안 160 rpm으로 떨고, 37 ° C에서 문화를 성장. 플라스미드를 추출 할 수있는 미니 프렙 키트의 지시 사항을 따르십시오. 시퀀싱을위한 플라스미드의 샘플을 보내 돌연변이의 부재에 대한 올바른 삽입 순서를 분석 할 수 있습니다. pProEx HTB D5 323-785 단백질 발현에 최적화 된 박테리아로 구성 (1 μL를 사용하여 단계 1.1.7의 단계를 따릅니다) 변환. 암피실린 (50 μg의 / ML의 최종)와 함께 LB 한천 플레이트에 박테리아를 확산. 시작 문화를 만들려면, 암피실린 (50 μg의 / ML의 최종)와 LB 300 mL에 하나의 식민지를 넣고 160 R 진탕, 37 ° C에서 박테리아를 성장오후 하룻밤. 암피실린의 존재 LB의 12 × 1 L 접종 (50 μg의 / mL의 최종), 37 ° C에서 pProEx HTB D5 323-785 세균 스타터 문화의 20 mL를 각각 OD까지 600 = 0.3에 도달한다. 18 ° C까지 온도를 줄이고 1 mM의 IPTG와의 OD 600 = 0.5에서 발현을 유도. 160 rpm으로 18 ° C에서 밤새을 떨고, 문화를 품어. 50,000 XG에서 30 분 동안 4 ℃에서 원심 분리하여 균체를 수확. (50mM 트리스 – 염산 [pH를 7], 150 mM의 NaCl을 5 밀리미터의 MgCl 2, 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % 글리세롤) 1X 프로테아제 억제제와 25 단위 (용해 완충액 약 150 ㎖의 세균 펠렛을 재현 탁 U) / 10 ㎖ DNase의. 얼음에 초음파를 Lyse 통해 박테리아 (1 인치 프로브, 50 % 전력, 0.5의 펄스, 0.5의 일시 정지, 3 배에서 5 분). 니켈 친 화성 칼럼 (니켈 열, 1.5 mL의 침대 볼륨)에 뜨는을로드하고, (b)의 10 열 볼륨 (CV)로 세척버퍼 inding (50mM 트리스 – 염산 [pH를 7], 150 mM의 NaCl을 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % 글리세롤), 세척 완충액 10 CV (50mM 트리스 – 염산 [pH가 7, 1 M의 NaCl, 10 MM의 β 머 캅토 에탄올, 10 % 글리세롤)과 이미 다졸 워시 10 CV (50mM 트리스 – 염산 [pH를 7], 150 mM의 NaCl을 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % 글리세롤, 30 mM의 이미 다졸). D5 323-785 용출 (20 mM 트리스 – 염산을 [pH를 7], 150 mM의 NaCl을 10 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 10 % 글리세롤, 200 mM의 이미 다졸). 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) -polyacrylamide 겔 전기 영동 (PAGE)을 통해 다른 정제 단계를 검사한다. 의로드 2-20 μL 각 정제 단계 흐름을 통해 1 배 로딩 염료와 혼합 : 10에 (배 4 % SDS, 20 % 글리세롤, 120 mM 트리스 – 염산 [pH가 6.8, 0.02 % 중량 / 블루 볼륨 브로 모 페놀) % SDS 젤 버퍼를 실행 배속 램 믈리 200 V에서 실행할 (25 mM 트리스, 0.192 M 글리신, 0.1 % SDS). 즉시 사용 쿠마시 블루 용액으로 염색 겔. EXChange 제조업체의 설명서에 따라 탈염 컬럼을 사용하여 버퍼를 바인딩 용출 된 단백질의 버퍼. 단백질 용액에 담배 식각 바이러스 핵 포함-A 엔도 펩티다아제 (TEV 단백질 1 밀리그램 / 100 mg)을 첨가하여 그 태그를 절단. 실온에서 밤새 인큐베이션. SDS-PAGE를 수행하여 소화를 체크한다 (단계 1.5 참조) 바인딩 버퍼의 니켈 열 평형. 단백질 용액이 통과하여 관류를 수집하는 동안 이미 다졸 세척 완충액 2 CV으로 비드 세척하자. 0.5 ㎖의 최종 부피로 원심 농축기를 이용하여 단백질을 농축시킨다. 겔 여과 완충액으로 평형화 크기 – 배제 컬럼에 집중된 단백질을 주입 (20 mM 트리스 – 염산 [pH를 7], 150 mM의 염화나트륨, 10 % 글리세롤, 1 mM의 디티 오 트레이 톨 [DTT). 0.5 ㎖의 분획에 흐름을 모아서 연결. 피크 샘플에 ​​의해 단백질의 존재를 확인 및 순도SDS-PAGE를 수행한다 (단계 150 참조). D5 323-785의 용출 피크의 분수를 결합합니다. 20 mM 트리스 – 염산 [pH를 7], 150 mM의 염화나트륨, 10 % 글리세롤, 1 mM의 DTT의 단백질 용액 5 ㎖에 대해 (일정 트리스 및 DTT 농도를 유지하면서 25 mM의 염화나트륨을 시료 5 % 글리세롤 묽은 제 20 mM 트리스 – 염산 [pH가 7 및 1 mM의 DTT 5 mL를 첨가 한 후 20 mM 트리스 – 염산 [pH가 7, 5 % 글리세롤, 1 mM의 DTT) 20 ㎖를 추가한다. 이온 교환 컬럼에 샘플을로드합니다. 버퍼 사용 A (20 mM 트리스 [pH가 7, 25 mM의 염화나트륨, 5 % 글리세롤, 1 mM의 DTT) 및 완충액 B (20 mM 트리스 [pH가 7, 1 M의 NaCl, 5 % 글리세롤, 1 mM의 DTT) 25 mM 내지 1 M.하는 염 구배를 형성 1.5 ㎖의 분획에 용출 된 단백질을 수집한다. SDS-PAGE를 수행하여 피크 샘플에서 단백질의 존재 및 순도를 확인한다 (단계 150 및도 1b 참조) 0.5 ㎖의 최종 부피로 원심 농축기에서 단백질 용액을 Reconcentrate. ReruN 겔 여과 버퍼 크기 – 배제 컬럼에 단백질 농축 (20 mM 트리스 – 염산 [pH를 7], 150 mM의 염화나트륨, 5 % 글리세롤, 1 mM의 DTT는 단계 1.11 참조). 2. 데이터 수집 참고 : 가능한 한 빨리 요청 빔 시간. ESRF의 경우, 사용 가능한 액세스 유형에와 신청서를 제출하는 방법에 대한 가이드 라인에서 찾을 수 있습니다 : http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying . 제안의 수용과 실험에 초대 한 후, 모든 참가자들은 안전 교육을 완료해야합니다. 훈련의 검증 후, 샘플에 필요한 안전 정보와 함께 실험에 대한 빔라인을 방문 연구자를 선언합니다 (ESRF 사용자 포털을 통해) "A 형"을 작성하십시오. 실험을 논의하기 위해 지역 담당자에게 문의하십시오. SEC-SAXS 데이터 수집 참고 : ONL에 대한오프라인 정제, BM29에 설치된 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 시스템을 사용한다. 이 시스템은 인라인 탈기, 이진 펌프, 버퍼 선택 및 그라디언트, 오토 샘플러, 자외선 VIS 배열 photospectrometer 및 conductometer위한 밸브로 구성되어 있습니다. 이는 직접 SAXS 노출 부 (19)의 유출을 통해 모세관에 부착된다. 옆 겔 여과 버퍼의 1 mL를 넣습니다. 증권 거래위원회 (SEC) 시스템에 버퍼 병을 연결합니다 (기본값은 포트 A)입니다. 사용되는 컬럼에 따라 유량을 선택. 주 : 여기에서 사용되는 크기 – 배제 컬럼의 경우, 유속은 0.1 mL / 분이다. 칼럼의 최대 압력을 정의 배압을 기록해, 적어도 1.2 CV에 수집 시간을 설정합니다. 은 "자동 제거"기능을 통해 펌프 및 상류 튜브를 플래시합니다. 시스템이 버퍼로 채워질 때까지 기다렸다가 열을 연결합니다. 적어도 1.5 CV를 전달하여 열 평형. 연동송아지와 때문에 방사선 손상에 신호의 변화를 제어하는 ​​시료 교환기를 사용하여, 단계 2.1.1 방치 버퍼를 측정한다. 버퍼에는 방사선 손상이없는 경우에만 계속한다. HPLC 모드 빔라인 제어 시스템을 전환. 프레임 당 1 초에 200 프레임을 수집, 버퍼의 테스트 실행을합니다. 합산 된 강도 음모에 검출기에 의해 주어진 카운트 수를 기록합니다. 주 : 신호가 이전에 측정 된 버퍼 일치해야하고 시간의 합산 된 세기는 일정하게 유지한다. 신호가 일치하지 않거나 일정하지 않을 경우, 시스템의 이상 평형이 요구된다. 적어도 10 분 동안 탁상 마이크로 튜브 원심 분리기에서 13,000 XG에서 샘플을 스핀 다운. (제공)을 HPLC 호환 유리 병에 시료를 입력하고 자동 분사기에 넣어. 잘 위치를합니다. 사용자 안전 교육에 설명 된대로 표준 절차를 사용하여 실험 허치을 연동. 에 로그인하고 빔라인 제어 소프트웨어를 통해 데이터 저장을위한 폴더를 만듭니다. "빠른 배치"기능을 사용하여 HPLC 시스템을 프로그래밍합니다. 2.1.10 단계에서 생성 된 폴더의 UV 데이터의 저장 위치를 ​​설정한다. 같은 폴더에 ASCII 파일을 저장, 자외선 데이터의 자동 ASCII 변환을 활성화해야합니다. 사출 볼륨과 잘 위치를 선택합니다. "시작"버튼을 눌러 대기열에 측정을 추가합니다. 이 소프트웨어는 일괄 처리를 저장 요청합니다. 저장하기위한 준비하지만,이 자동으로 측정을 시작으로, "저장"버튼을 누르지 마십시오. 빔라인 제어 소프트웨어에서 데이터 수집 매개 변수를 설정합니다. 총 데이터 수집 시간 단계 2.1.2에서 정의 된 획득 시간 약간 초과되도록 프레임의 수를 선택한다. 안전 셔터를 열고 빔라인 제어 소프트웨어를 사용 SAXS 데이터 수집을 시작한다. 데이터 코르 있는지 확인치구 인수했다. 단계 2.1.6에서 수집 된 데이터에 새로 수집 된 데이터를 비교하고 요약 강도 계수의 수는 최소 100 프레임에 대해 일정하게 유지 단계 2.1.6에서 값과 일치하는지 확인합니다. 단계 2.1.11 제조 같이 SEC가 "저장"버튼을 누름으로써 실행 시작하고, 사출 완료 UV 및 데이터 수집이 시작되면 camserver 소프트웨어에 표시되는 프레임 번호를 기록. 데이터 수집 후, 오픈 "데이터 수집"탭을 ISPyB 데이터베이스 (20)를 열고 데이터 세트 및 자동 분석 (21)의 결과에 액세스하려면 "이동"버튼을 누릅니다. IEC-SAXS 데이터 수집 NOTE 대신 일반적 IEC 실험에인가되는 연속적인 선형 구배, 완충액 B의 양이 미리 설정 한 단계 씩 증가시키는 단계적 구배를 사용한다. SAMPL에 대한 HPLC 프로그램 만들기전자 무료 버퍼 실행. 단계적 구배 0 % B 완충액에서 시작하여 버퍼 (B)의 100 %에 도달 할 때까지 두 CV 후 5 % 포인트 증가하는 프로그램. 옆으로 각 버퍼의 일부를 넣습니다. 포트 A에 저염 버퍼 A와 포트 B에 높은 소금 버퍼 B와 하나 병을 연결합니다 유량을 선택하고, 컬럼의 압력 한계 아래로 유지 (본 예에서는, 1 mL / 분). 단계 2.1.3에서와 같이, "자동 제거"기능을 이용하여 펌프 상류 튜브를 세척. 저염 완충액 A에서 평형화 시스템 (단계 1.15 참조) 이온 교환 컬럼을 연결한다. 열이 완전히 (적어도 1.5 CV)를 평형 될 때까지 기다립니다. 단계 2.1.5에서와 같이, 샘플 체인저를 사용하여 방사선 손상에 대한 버퍼 A와 B를 검사하는 단계 2.2.2에서 따로 버퍼를 사용합니다. 버퍼 단계 2.1.6에서와 같이 열 나오는 확인합니다. 단계 2.2.6 기록 버퍼 (A)의 신호에 신호를 비교한다. 다시 참고합산 된 강도 음모의 카운트 수입니다. 버퍼 실행을위한 데이터 저장을위한 폴더를 만듭니다. HPLC 시스템 모드에서 설정 데이터 수집. 총 데이터 수집 시간이 IEC 런의 총 시간을 초과하도록 프레임의 수를 선택한다 (단계 2.2.1 참조). 안전 셔터를 열고 SAXS 데이터 수집을 시작합니다. 제대로 진행되었는지 확인하고 요약 강도가 최소 100 프레임에 대해 단계 2.2.7에서 언급 한 값으로 일정하게 유지 한 번 확인. HPLC를 소프트웨어의 "단일 실행"기능을 사용하여 단계 2.2.1에 프로그래밍 된 단계적 그라데이션을 시작합니다. 주사의 경우,이 단계에서 어떤 샘플을 주입하지하기 위해 -1로 바이알 수를 설정합니다. 프로그램이 시작으로 획득 한 프레임 수를 기록합니다. 샘플 실행을위한 HPLC 프로그램을 만듭니다. (버퍼 B. 추정의 0 % 단계 1.1.5에서 오프라인 측정 된 각각의 피크 버퍼 B의 비율부터 단계적 그라데이션을 프로그램 <str옹> 그림 1B). 정확히 1 % 포인트 아래에 1.5 점 관심의 봉우리보다 최소한 3 단계, 2.5 CV (그림 1C) 각을 설정합니다. 2.5 CV 100 % 완충액 B에서의 마지막 단계를 추가한다. 적어도 10 분 동안 탁상 마이크로 튜브 원심 분리기에서 13,000 XG에서 샘플을 스핀 다운. 20 mM 트리스 – 염산 [pH가 7, 10 % 글리세롤, 1 mM의 DTT로 혼합하여 완충액 A (25 mM)을의 염 농도로 희석 D5 323-785. 컬럼에 수동으로 샘플을로드합니다. 기포의 형성을 방지하기 위해 펌프를 일시 중지 한 후 희석 된 샘플의 버퍼에게 입력 튜브를 넣는다. 직접 흐름을 통해 열에서를 수집 탐지기에서 열을 분리합니다. 샘플 용기는 거의 비어있는 경우, (상기 튜브를 이동시키면서 다시 펌프 일시) 완충액 A에 입력 튜브 돌아가서 컬럼 튜브에서 샘플을 전송하는 완충액 A 펌핑 재시작. 전체 샘플되면로드 버퍼 A의 2 CV를 통과하고 검출기에 열을 다시 연결합니다. 샘플 실행을 위해, 데이터 저장을위한 폴더를 만듭니다. 안전 셔터를 열고 SAXS 데이터 수집을 시작합니다. 데이터 수집이 제대로 진행되는지 확인하고 합산 강도가 최소 100 프레임에 대해 단계 2.2.7에서 언급 한 값으로 일정하게 유지 한 번 확인. 단계 2.2.12에 프로그래밍 된 단계적 그라데이션을 시작 HPLC 소프트웨어의 "단일 실행"기능을 사용합니다. 주사의 경우,이 단계에서 어떤 샘플을 주입하지하기 위해 -1로 바이알 수를 설정합니다. 프로그램이 시작으로 획득 한 프레임 수를 기록합니다. 열기 ISPyB (20)의 "데이터 수집"하고 Enter 키를 눌러 데이터 세트 및 자동 분석 (21)를보고 "이동". 은 "Postrun 분석"소프트웨어를 통해 ASCII 형식으로 HPLC 시스템에서 UV 데이터를 내 보냅니다. 삼.SEC-SAXS 데이터 감소 및 분석 은 "이동"버튼을 눌러 ISPyB 데이터 수집의 데이터를 연다. SAXS 데이터 수집 프레임 개요에서 결정은 용리 피크에 대응한다. 선회 반경이 피크에 걸쳐 안정적인지 확인합니다. 자동 버퍼 보정이 제대로 수행되었는지 확인합니다. 22 파일들을 평균 SAXS 실험 데이터로 조작을 수행하는 프로그램에 피크의 중앙 부분으로부터로드 프레임. 그리고, 자동으로 생성 된 버퍼 파일을로드하고 평균 프레임의 높은 Q 지역 버퍼 프레임 일치 여부를 확인한다. 정량적 CORMAP 테스트 (23)를 사용하여 피크에 걸쳐 획득 프레임을 비교한다. 관심 영역을 덮는 프레임의 자동 생성 감산 (* _sub.dat 파일)을로드. 은 "스케일"버튼을 누름에 의해 서로 이들을 규모. 비교 예"데이터 비교"기능을 사용하여 전자. 피크에 걸쳐 프레임 사이에 체계적인 변화가 없어야합니다. 관심의 모든 * -_ sub.dat 프레임을 열고 "병합"버튼을 사용하여 병합 및 .DAT 형식으로 병합 된 파일을 저장합니다. 저해상도의 데이터 이후 자르기위한 기니 어 범위에서 첫 번째 데이터 점을 주목 프로그램의 "관성 반경"공구 선회 반경을 결정한다. 프로그램에서 "거리 배포"도구를 사용하여 한 쌍의 거리 분포 함수를 결정하고 gnom.out 같은 결과이 .out 파일을 저장합니다. 4. 순이 론적 모델링 유닉스 시스템에서, 대칭 제한없이 40 X 순이 론적 모델 재건 프로그램을 실행합니다. 새 폴더를 만들고에 gnom.out 파일을 복사합니다. 다음과 같이 프로그램을 실행합니다 : 대한 ((I = 1; 전 = 40 <; 내가 ++)); gnom.out -ms -p dammifp1_ $ 내가 dammif 할; 디하나 유사하게, 두 번째 폴더의 6 배 대칭에 대한 대칭 제한이있는 순이 론적 모델 재건 프로그램을 실행 : 대한 ((I = 1; 전 = 40 <; 내가 ++)); 할 일 dammif gnom.out -ms -s P6 -p dammifp6_ $ 내가; 끝난 모든 AB 론적 모델 재건 프로그램 출력 파일을 정렬 (* -1.pdb). 단계 4.1 및 4.2에서 두 개의 폴더에서 damaver -a * -1.pdb를 실행합니다. 모든 모델 (damaver.pdb)뿐만 아니라 적절한 분자 시각화 소프트웨어 (26)의 올바른 볼륨 (damfilt.pdb)에 필터링 된 모델의 조합을 열고을 비교합니다. 텍스트 편집기에서 damsel.log 파일을 엽니 다. 파일의 아래쪽의 "기준"으로 표시된 모델은 가장 대표적인 모델이다. 5. IEC-SAXS 데이터 감소, 분석 및 모델링 실험 SAXS 데이터 파일 (22) 조작을 수행하는 과정에서, 약 50 SAXS의 각각 혼합 공정으로부터 프레임로드버퍼 실행은 "AVERAGE"버튼을 눌러 결과를 저장합니다. ISPyB 통해 제공 자동 처리 결과에 기초하여, 실험의 프레임 식별 단백질의 용출에 대응하고 관성의 (예비) 반경 피크 걸쳐 안정적인지 확인. 실험 SAXS 데이터 파일 조작 프로그램 (22)에 프레임을로드하고 버퍼 프레임 (단계 5.1 참조) 수행으로,이를 평균. 다음, 단계 5.1에서 생성 된 버퍼 파일을로드하고, 피크 평균 일치 버퍼를 찾는 (4.2 내지 -1 이상) 높은 Q 영역을 비교한다. 주 : 피크와 버퍼의 평균 사이의 오프셋 체계적인이 없어야합니다. 샘플 곡선이 두 버퍼 곡선 사이에 떨어질 것 같으면, 평균을 계산하여 곡선을 보간. 피크 분획의 평균 산란 커브의 베스트 매치로 식별되는 버퍼를 빼고 얻어진 subtr 저장행동 파일입니다. 또한, 감산 에러 마진을 추정하기 위해 이전 및 다음 단계에서 혼합 평균 버퍼 곡선을 감산하여 곡선을 생성한다. 반복 피크의 좌측 및 우측 반부에 대해 각각 5.3 및 5.4 단계 피크에 걸쳐 신호의 안정성을 확인하기 위해 단계 5.4에서 이들의 결과를 비교. 단계 단계 5.4에서 세 공제 곡선 3.5 및 3.6을 따르십시오. 세 공제 곡선의 결과를 비교한다. 참고 : 뺄셈의 오차 한계 내에서 강력한 유지 만 결과를 신뢰할 수 있습니다. 의 단계 5.3에서 확인 된 가장 감산 4.1 및 4.2 단계로 모델링을 수행합니다. 모델을 정렬 4.5 4.3 단계로 가장 대표적인 하나를 식별하십시오. 결과 6. 비교 증권 거래위원회 (SEC)의 대표 모델 12 3D 구조를 중첩하는 프로그램을 실행 (4.5 단계)을P6 대칭 D IEC-SAXS 데이터 (5.9 단계) : supcomb model_sec.pdb model_iec.pdb model_sec.pdb 및 분자 시각화 소프트웨어에 model_iec-r.pdb를 가져옵니다. modelsec.pdb의 .fir 파일 및 스프레드 시트에서 modeliec-r.pdb를 열고 실험과 계산 산란 곡선의 2 차원 그래프를 만들 수 있습니다.