ヒト好中球由来の巨大食細胞の新規亜集団の開発および同定<em>インビトロ</em

プロトコルは、ヘルシンキ宣言に従ってローカル人権委員会によって承認され、すべての参加者は、インフォームドコンセントフォームに署名しました。 1.好中球の単離および培養におけるGφの開発注：すべてのステップは、バイオセーフティ層流フード内で滅菌組織グレードのリポポリサッカライド（LPS）フリー・ソリューションを使用して実行する必要があります。ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）-1640培地に抗生物質、サイトカインまたは成長因子を追加しないでください。 無菌頭皮静脈セットを使用して、若い健康な成人から少なくとも40ミリリットルを静脈血を入手します。エチレンジアミン四酢酸K 3塩（K 3 EDTA）を含有するバキュテナーチューブに血液を描画し、穏やかに混合します。室温で血液を保管してください。 1.119および1.077グラム/ mlでポリスを使用して2段階の不連続密度勾配により好中球を分離します。使用する前に室温にソリューションを持参してください。 注：遠心分離の間に、赤血球細胞（赤血球）が急速ポリスや堆積物によって集約されます。好中球はポリス-1077 / 1119インタフェース（ 図2を参照）で、ちょうど赤血球の上に発見されたのに対し、単核細胞（単球/リンパ球）は、上部プラズマとの間に見出される/、-1077インタフェースをポリス。このメソッドは、同じ個体から単核細胞および好中球の同時分離を可能にします。 図2：ヒト全血からの好中球の単離。 1.077グラムでのポリスクロースは、/ mlを慎重に不連続勾配を形成するために、ポリスクロース、1.119グラム/ミリリットルの上に階層化されています。希釈された全血はその後ポリス-1.077の上に階層化されています。チューブは、すぐにブレーキなしで、室温で、30分間、700×gで遠心分離に供されます。三つの異なるバンドが注目されます。 （A）単核細胞を、（B）、多形核細胞（PMN）チューブの底部に、および（C）赤血球（RBC）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 50ミリリットル滅菌ポリプロピレンコニカル遠心管の底に12ミリリットルポリスクロース-1119を追加します。 慎重ポリス-1119にポリスクロース-1077の12ミリリットルをレイヤー。 2％熱不活性化ウシ胎児血清（HI-FCS）を含有するイオンを含まないリン酸緩衝生理食塩水で24血液mlの最終容量（PBS）、12 mlの全血 – 10を希釈します。慎重にチューブの上部勾配に希釈した全血の24ミリリットルをレイヤー。 ブレーキなし – （24°C 20）、室温で30分間、700×gで遠心分離します。 注：より低い温度での遠心分離は、細胞凝集と貧しい回復をもたらすことができます。 慎重に遠心分離機からチューブを取り外しwithoutは、勾配を乱します。二つの不透明な層が観察されるべきである（A：単核細胞およびB：PMN、 図2に示されています）。 吸引し、チューブに層A転送（または廃棄）上記0.5センチメートルこの層からの細胞に流体を捨てるには、「単核」と記されました。 吸引し、層B上記0.5センチメートル「PMN」と表示されたチューブに、この層から細胞を転送するには、残りの流体アップを廃棄します。 プールの各2勾配管からのPMN及びPBS 30 mlの最終体積に2％HI-FCSを含む洗浄します。 200×gで12分間遠心し、上清を除去し、廃棄します。 静かに1ミリリットルの無菌ピペットチップで内外に描画することによってペレットを再懸濁しながら、赤血球（RBC）を、汚染を取り除くために、低張0.2％の氷冷滅菌のNaClの3ミリリットルを追加します。 30秒間、氷上で保管してください。 30秒後、チューブに滅菌1.6％氷冷のNaClの3ミリリットルを追加することによって、等張性を復元します。 等張食塩水の6ミリリットルに、6メートルを追加2％HI-FCSと12分間250×gで遠心分離を補っ予め温めた（37℃）RPMI-1640培地のリットル。上清を捨てます。 PMNペレットは、RBC汚染のクリーンでなければなりません。 注：RBCによって汚染された場合は、PMNペレットは赤みがかっを表示されます。 いくつかの汚染RBCが残っている場合、繰り返しは9と10回以上繰り返します。 10％HI-FCSを添加した4ミリリットルRPMI-1640中で細胞ペレットを再懸濁し、トリパンブルー排除によってその濃度及び生存率を決定するために、細胞をカウントします。 1.25濃度調整- 1.5×10 6 PMN / mlの（実験的なニーズに応じて）、および1.0 mLの/ウェルで24ウェルプレートをプレート。 注：月グリューネ・ギムザ染色し、光学顕微鏡により評価されるように顆粒球集団における好中球の純度は常に95％を超えました。 播種後、内のセルを配置 37℃、加湿5％CO 2インキュベーター。 そっとの半分を吸引することによって、3日毎に培地交換してください培地および10％HI-FCSを補充した新鮮なRPMI-1640培地を同じ体積を加えます。 HI-FCSで使用LPSを含まない溶液と化合物と低LPSレベル（0.05 ngの/ ml以下）。 注：文化の中で発展Gφは、しっかりと培養皿に付着しない、激しい洗濯も開発し、細胞を洗い流すことができるので、穏やかな培地交換が不可欠です。血液ドナーに応じて、PMN培養後4日 – Gφの外観は3で顕著です。 Gφのサイズが非常に大きい場合、培養中で7日 – ここに記載の分析およびアッセイのほとんどは、6との間で行われています。 RPMI-1640培地に10ng / mLのLPS文化の中でGφ発展に影響を与えなかった – 1の添加があることに留意されたいです。 14 2.共焦点レーザー走査顕微鏡新たに単離した好中球からの、および7日に開発Gφ培養物からのサイトスピン16を準備します（セクション1で調製しました）。 注：静かに培地の半分を除去し、様々な分析のための皿にGφの濃度を増大させるために。 Gφは、光学顕微鏡下での媒体を調べることによって除去培地中に検出されていないことを確認してください。そして、集中的に軽く付着しGφを除去するために、残りの培地をピペット。 200×gで10分間、培地を遠心分離し、そして100でペレットを再懸濁 – 120μlの培地。 各スライドのための細胞を含む培地120μlの – 100を使用してください。各治療から重複または三重スライドを準備します。 84×gで7分間スピン。 紡糸セルを乾燥し、化学フード下で10分間室温で4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定。 PBSで洗浄3回（1回の洗浄あたり数秒〜100マイクロリットル）。細胞内染色のために、室温で10分間0.5％トリトンX-100 PBS中で細胞を透過処理し、PBSで5回洗浄します。 注：すべての段階で、適切な緩衝液/液voluを使用私は、スライド上の細胞の周囲をカバーします。細胞の周囲を決定するための疎水性のバリアペンを使用してください。 注意：パラホルムアルデヒドは有毒です。皮膚や眼との接触を避けます。適切な個人保護具を着用します。 RPMI-1640培地中で、10％正常ヤギ血清でブロック細胞と4ºCで、または40分間、室温で一晩インキュベートします。 PBSで洗浄します。 100希釈（〜100μl）を：単一の抗体（Ab）または1で、マウスおよびウサギ一次抗体（ABS）の組み合わせでインキュベートします。 4°Cで – （20時間18）で一晩インキュベートします。 注：ここでは、マウスモノクローナルAbは含ま：抗CD14、抗CD63、抗CD66b、抗CD1c、抗CD15、および抗チトクロームB-245軽鎖（p22- phoxの識別 ）。ウサギポリクローナルAbは含ま：抗CD68、抗CD36、抗LC3B、抗ミエロペルオキシダーゼ、抗好中球エラスターゼ（NE）、および抗のNox2 / gp91- PHOXの腹筋を。アイソタイプコントロールは、精製マウスIgG1およびIgG2、およびウサギIgGが含まれていました。 Prepar製造元の指示に従ってABS及びeは細胞の周囲をカバーするために、適切な容量（約100μl）を使用します。 細胞を洗浄し、1/400二次抗体Cy2と-CF（488A）結合ヤギ抗ウサギIgG（緑）でインキュベート/またはCy5（CF 647）結合ヤギ抗マウスIgG 40室温で（赤）分。 注：製造元の指示に従って腹筋を希釈し、準備します。 洗浄後、核染色のために4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含む、マウンティング培地の一滴でスライドをマウントし、すぐにカバースリップを置きます。 蛍光顕微鏡およびプランアポ40X液浸油の対物レンズを用いて共焦点レーザー走査システムによってスライドを分析します。スライドの調製後2時間に30分以内に分析を実行するか、または4℃で一晩おきます。 セル領域とイメージングソフトウェア（ 例えばイメージJ）を用いて蛍光強度を算出します。共局在、資格のためのMandersオーバーラップ係数（MOC）17を用いてソフトウェアによってntify。 注：MOCと細胞のみ> 0.6は、有意な共局在と細胞とみなすことができます。 内皮細胞アクロスPMNの3遊出：巨大食細胞に対するIL-8の影響（Gφ）の形成注：使用して24ウェル透過性細胞培養は、細胞遊出アッセイのために挿入されます。 コートを50μg/ mlの濃度で150μlのフィブロネクチンとのインサートの上部チャンバを、室温で30分間保ちます。 上部チャンバーに追加5×10 4 EA.hy926内皮細胞/ウェル、策定ダルベッコ改変イーグル培地（完全増殖培地）150μlの中に再懸濁しました。 注：内皮単層は、使用前にコンフルエントであることを確認してください。 下部チャンバーに、完全増殖培地の700μLを追加します。 透過性を配置細胞培養は5％CO 2中で37℃でクラスタトレイ培養2日間EA.hy926内皮細胞に挿入します。 注：（セクション1で説明したように）並行して、二日目に新鮮なPMNを準備します。 2日後、インサートの下部及び上部チャンバーに培地を交換してください。 下部チャンバーに、50 nMの/ mlの最終濃度で10％IH-FCSおよびインターロイキン（IL）-8を補充したRPMI-1640培地を加えます。下部チャンバーを制御するために、IL-8を追加しないでください。 各上部チャンバーに、10％IH-FCSを補充したRPMI-1640培地100μlで10 6の新鮮なPMNを追加します。 90分間、5％CO 2中で37℃でクラスタトレイをインキュベートします。 90分間のインキュベーション後、別々に上部及び下部チャンバーから細胞を除去し、それぞれの亜集団を数えます。追加された全細胞の割合として各チャンバ内の細胞を発現します。 注：慎重上位CHAMBから細胞を除去内皮細胞を除去回避し、滅菌チューブに転送するために、穏やかにピペッティングすることにより、小胞体。ピペットで下部チャンバーから細胞を取り出して、第二の滅菌チューブに500μlの転送と下部チャンバーを洗浄します。 プールの手順14で指定された成長因子を含まない7日間transmigrating（下室）と非遊走（上室）PMN画や文化それぞれのいくつかのウェルから10 6個の細胞- 16（セクション1）。 スライド16上に細胞をスピンし、セクション2に記載されているように、共焦点顕微鏡によって各培養条件で開発した細胞を分析します。