Масса гистологии к Количественно нейродегенерации<em> Drosophila</em
Summary
Drosophila широко используется в качестве модельной системы для изучения нейродегенерации. Этот протокол описывает метод, с помощью которого вырождение, как определено образованием вакуолей в головном мозге, могут быть определены количественно. Это также сводит к минимуму эффекты, связанные с экспериментальной процедуры по обработке и секционирования контрольных и экспериментальных мух в качестве одного образца.
Abstract
Прогрессивные нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (AD) или болезнь Паркинсона (БП) создает все большую угрозу для здоровья людей во всем мире. Хотя модели млекопитающих предоставили важную информацию о механизмах, лежащих в основе патогенности, сложность систем млекопитающих вместе с их высокой стоимости ограничивают их использование. Таким образом, простой , но хорошо создана модель Drosophila-система представляет собой альтернативу для исследования молекулярных путей, которые страдают при этих заболеваниях. Помимо нарушений поведения, нейродегенеративные заболевания характеризуются гистологические фенотипы, такие как гибель нейронов и аксонопатии. Для количественной оценки дегенерацию нейронов и определить, как он влияет на генетических и экологических факторов, мы используем гистологический подход, который основан на измерении вакуоли в мозге взрослых мух. Чтобы свести к минимуму влияние систематических ошибок и непосредственно сравнивать разделы из-под контроля и ехрerimental мух в одном препарате, мы используем метод «воротник» для парафиновых срезов. Нейродегенерации затем оценивали путем измерения размера и / или количества вакуолей, которые развились в летучей мозге. Это может быть сделано путем сосредоточения внимания на конкретной области, представляющей интерес, или анализируя весь мозг путем получения серийных срезов, которые охватывают полную голову. Таким образом, этот метод позволяет измерять не только тяжелой дегенерации, но и относительно умеренные фенотипы, которые могут быть обнаружены только в нескольких секциях, как это происходит во время нормального старения.
Introduction
В связи с увеличением продолжительности жизни, нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона стала растущая угрозу для здоровья населения в целом. По данным Национального института здравоохранения, 115 миллионов человек во всем мире, согласно прогнозам, будут затронуты слабоумия в 2050 году Несмотря на значительный прогресс был достигнут в идентификации генов и факторов риска, связанных с по крайней мере, некоторые из этих заболеваний, для многих из них, лежащие в основе молекулярные механизмы до сих пор неизвестны или не очень хорошо понял.
Простые беспозвоночные модельные организмы , как Caenorhabditis Элеганс и дрозофилы предлагают множество экспериментальных преимуществ для изучения механизмов нейродегенеративных заболеваний, в том числе за короткий жизненный цикл, большое количество потомства, а также наличие устоявшихся , а иногда и уникальных генетических и молекулярных методов 1 -12. Кроме того, эти организмы поддаются несмещеннойЭкраны взаимодействия, которые могут идентифицировать факторы, способствующие этим заболеваниям их отягчающих или улучшающее воздействие на нейродегенеративных фенотипов.
Анализ таких генетических взаимодействий и оценки эффектов старения требует количественных протоколов для обнаружения нейродегенера- и измерить его тяжесть. Эта оценка может быть сделано относительно легко при измерении поведенческих аспектов в дрозофилы, такие как обучение, обонятельной отрицательные geotaxis, или быстрой фототаксиса, которые обеспечивают числовое значение производительности 13-21. Кроме того, можно определить влияние на выживание нейронов путем подсчета нейронов. Тем не менее, это возможно только при фокусировке на конкретной группе населения, которая четко определить, как дофаминергические нейроны, которые затронуты в ПД, и даже тогда, результаты были противоречивыми 22-24.
Протокол, описанный здесь используется метод воротник для выполнения парафиновые серийных срезов, методкоторый был первоначально разработан Гейзенберга и Böhl, которые использовали его для выделения анатомическими мутантов мозга у дрозофилы 25. Использование метода воротниковой впоследствии был адаптирован, в том числе в криосрезах, vibratome секции и пластмассовых секций 26-28. Здесь этот метод используется для получения последовательных секций всей головы летучей, который затем может быть использован для измерения вакуоли , которые развиваются у мух с нейродегенеративными фенотипов 16,21,29-32. Эти измерения можно сделать в определенных областях мозга, или может покрывать весь мозг; последний подход позволяет выявить даже слабые дегенеративные фенотип, как это наблюдалось во время старения. И, наконец, при использовании воротники, до 20 мух могут быть обработаны, как один препарат, который не только занимает меньше времени, но также позволяет проводить анализ контрольных и экспериментальных мух в том же препарате, сводя к минимуму артефактов из-за небольших изменений подготовка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный способ обеспечивает средство для количественной оценки нейродегенерации в мозге дрозофилы. В то время как другие методы, такие как подсчет определенного типа клеток, может быть использован для идентификации нейродегенерации, преимущество этого способа состоит в том, ч…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants to D.K. from the Medical Research Foundation of Oregon and from NIH/NINDS (NS047663). E.S. was supported by a training grant from the NIH (T32AG023477).
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | |
| Collar | Genesee Scientific | TS 48-100 | We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html |
| Rubber ice cube tray for embedding | Household store | The size can be made to fit by glueing in additional walls | |
| Crystallizing dish | Fisher Scientific company | 08-762-3 | |
| Ether | Fisher Scientific Company | E138-1 | |
| Ethanol | Decon Laboratories Inc. | 2701 | |
| Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
| Methylbenzoate | Fisher Scientific Company | M205-500 | Distinct Odor |
| Use in fume hood | |||
| Low Melting Point Paraffin Wax | Fisher Scientific Company | T565 | Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath |
| Microtome | Leica Biosystems | Reichert Jung 2040 Autocut | |
| Microscope Slide | Fisher Scientific Company | 12-550D | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific Company | 12-545-M | |
| SafeClear | Fisher Scientific Company | 314-629 | Three different containers for washes |
| Vertical Staining Jar with Cover | Ted Pella Inc. | 432-1 | |
| Permount | Fisher Scientific Company | SP15-500 | |
| Poly-L-lysine Solution | Sigma Life Science | P8290-500 |
References
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
- Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
- Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
- Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
- Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
- Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
- Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
- Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
- Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer’s disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
- Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer’s disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. , (2011).
- Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. , e50339 (2013).
- Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. , (2015).
- Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
- Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
- Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
- Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer’s model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
- Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson’s disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
- Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson’s disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
- Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
- Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
- Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
- Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
- Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
- Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
- Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
- Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
- Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
- Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
- Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
- Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
- Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
- Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
- Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).
