Drosophile est largement utilisé en tant que système modèle pour étudier la neurodégénérescence. Ce protocole décrit un procédé par lequel une dégénérescence, comme déterminé par la formation de vacuoles dans le cerveau, peuvent être quantifiés. Il minimise également les effets dus à la procédure expérimentale par le traitement et le contrôle sectionner et les mouches expérimentales comme un échantillon.
maladies progressives neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer (AD) ou la maladie de Parkinson (PD) sont une menace croissante pour la santé humaine dans le monde entier. Bien que les modèles de mammifères ont fourni des informations importantes sur les mécanismes sous-jacents de la pathogénicité, la complexité des systèmes de mammifères ainsi que leurs coûts élevés limitent leur utilisation. Par conséquent, le modèle système Drosophila simple mais bien établie offre une alternative pour étudier les voies moléculaires qui sont affectés dans ces maladies. Outre les déficits comportementaux, les maladies neurodégénératives sont caractérisées par des phénotypes histologiques tels que la mort neuronale et axonopathy. Pour quantifier la dégénérescence neuronale et de déterminer comment elle est affectée par des facteurs génétiques et environnementaux, nous utilisons une approche histologique qui est basé sur la mesure des vacuoles dans le cerveau des mouches adultes. Pour minimiser les effets de l'erreur systématique et de comparer directement les sections de contrôle et expmouches erimental dans une préparation, nous utilisons la méthode du «col» pour des coupes en paraffine. La neurodégénérescence est ensuite évaluée par la mesure de la taille et / ou le nombre de vacuoles qui se sont développées dans le cerveau de mouche. Cela peut être fait en se concentrant sur une région d'intérêt spécifique ou en analysant l'ensemble du cerveau en obtenant des coupes en série qui couvrent la tête complète. Par conséquent, cette méthode permet de mesurer non seulement la dégénérescence sévère, mais aussi des phénotypes relativement douces qui ne sont détectables que dans quelques sections, comme cela se produit au cours du vieillissement normal.
Avec l'augmentation de l'espérance de vie, les maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer ou de Parkinson sont devenus une menace pour la santé de plus en plus pour la population générale. Selon les instituts nationaux de la santé, 115 millions de personnes dans le monde sont prévus d'être affectées par la démence en 2050. Bien que des progrès significatifs ont été réalisés dans l'identification des gènes et des facteurs de risque impliqués dans au moins certaines de ces maladies, pour beaucoup d'entre eux, le sous-jacent mécanismes moléculaires sont encore inconnus ou mal compris.
Organismes modèles invertébrés simples comme Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster offrent une variété d'avantages expérimentaux pour étudier les mécanismes des maladies neurodégénératives, y compris un cycle court de la vie, un grand nombre de descendants, et la disponibilité des méthodes génétiques et moléculaires bien établies et parfois uniques 1 -12. En outre, ces organismes se prêtent à impartialeécrans d'interaction qui permettent d'identifier les facteurs qui contribuent à ces maladies par leurs effets aggravants ou améliorer sur phénotypes neurodégénératives.
L'analyse de ces interactions génétiques et évaluer les effets du vieillissement nécessite des protocoles quantitatifs pour détecter la neurodégénérescence et de mesurer sa gravité. Cette évaluation peut se faire relativement facilement lorsque l'on mesure les aspects comportementaux chez la drosophile, tels que l' apprentissage olfactif, géotaxie négative, ou phototaxie rapide, qui fournissent une valeur de performance numérique 13-21. Il est également possible de déterminer les effets sur la survie neuronale en comptant les neurones. Cependant, ceci est seulement possible lorsqu'on se concentre sur une population spécifique qui est clairement identifiable, comme les neurones dopaminergiques qui sont affectés dans la MP, et même alors, les résultats ont été controversés 22-24.
Le protocole décrit ici utilise la méthode du collier pour effectuer des coupes en série de paraffine, un procédéqui a été à l' origine développé par Heisenberg et Böhl, qui sert à isoler des mutants du cerveau anatomiques chez la drosophile 25. L'utilisation de la méthode du collier a été ensuite adapté, y compris dans cryocoupes, vibratome sections, et les sections en plastique 26-28. Ici, cette méthode est utilisée pour obtenir des coupes en série de la tête de la mouche entière, qui peut ensuite être utilisé pour mesurer les vacuoles qui se développent dans les mouches avec des phénotypes neurodégénératives 16,21,29-32. Ces mesures peuvent être effectuées dans des zones spécifiques du cerveau ou peuvent couvrir l'ensemble du cerveau; cette dernière approche permet d'identifier même faibles phénotypes dégénératives, comme observé au cours du vieillissement. Enfin, lors de l'utilisation des colliers, jusqu'à 20 mouches peuvent être traités comme une préparation, ce qui est non seulement moins de temps, mais permet également à l'analyse de contrôle et les mouches expérimentales dans la même préparation, en minimisant les artefacts dus à de légers changements dans la préparation.
Le procédé décrit fournit un moyen pour quantifier la neurodégénérescence dans le cerveau de la drosophile. Alors que d'autres méthodes, telles que le comptage d'un type de cellule spécifique, peuvent être utilisées pour identifier la neurodégénérescence, l'avantage de cette méthode est qu'elle peut être appliquée de façon plus générale. Le comptage des cellules exige que ces cellules puissent être identifiées de façon fiable en utilisant soit un anticorps spécifique ou l&…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants to D.K. from the Medical Research Foundation of Oregon and from NIH/NINDS (NS047663). E.S. was supported by a training grant from the NIH (T32AG023477).
Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | |
Collar | Genesee Scientific | TS 48-100 | We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html |
Rubber ice cube tray for embedding | Household store | The size can be made to fit by glueing in additional walls | |
Crystallizing dish | Fisher Scientific company | 08-762-3 | |
Ether | Fisher Scientific Company | E138-1 | |
Ethanol | Decon Laboratories Inc. | 2701 | |
Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
Methylbenzoate | Fisher Scientific Company | M205-500 | Distinct Odor |
Use in fume hood | |||
Low Melting Point Paraffin Wax | Fisher Scientific Company | T565 | Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath |
Microtome | Leica Biosystems | Reichert Jung 2040 Autocut | |
Microscope Slide | Fisher Scientific Company | 12-550D | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific Company | 12-545-M | |
SafeClear | Fisher Scientific Company | 314-629 | Three different containers for washes |
Vertical Staining Jar with Cover | Ted Pella Inc. | 432-1 | |
Permount | Fisher Scientific Company | SP15-500 | |
Poly-L-lysine Solution | Sigma Life Science | P8290-500 |