Подготовка rAAV9 к гиперэкспрессией или Нокдаун Гены в мышиных сердец

Контроль экспрессии или активности специфических генов в различных биологических системах стала ценной стратегией при изучении функции гена ^1. Прямым средством достижения этой цели является манипулировать нуклеотидные последовательности и генерируют мутантные аллели. Несмотря на то, что делает точные, целенаправленные изменения в геном живых клеток по-прежнему отнимающий много времени и трудоемкая практика, развитие мощных инструментов Talen и Crispr / cas9 открыл новую эру редактирования генома ^2-5. Более рутинной лабораторный метод для генных манипуляций была сосредоточена на введении генетических материалов (ДНК и РНК , содержащих кодирующие последовательности или миРНК / shRNAs) в клетках , чтобы выразить или нокдауна ген (ы) интерес ^1,6.

Во многих случаях основным сдерживающим генная инженерия является доставка ДНК, РНК или белка в клетки. Что касается исследований в лабораторных условиях , эффективного transfectiв системах, были установлены во многих культивируемых клеточных линий. Тем не менее, в мышиной модели , в частности, в естественных условиях доставки гена является более сложной задачей. Есть целый ряд внеклеточном и внутриклеточном барьеров, которые необходимо обойти для достижения эффективного клеточного поглощения экзогенных реагентов. Дополнительные препятствия включают быстрый клиренс и короткую продолжительность поставляемого материалов ^7,8. Одна из стратегий , чтобы обойти эти проблемы является использование вирусных векторов в качестве "носителей" или "транспортные средства" для в естественных условиях доставки генов. Естественно-эволюционировали свойства трансдукции вирусов позволяют эффективную доставку интересующего гена в клетки ^7,9,10. Известны многочисленные типы вирусных векторов, были разработаны и позволяют гибко в естественных условиях манипуляции генов в различных типах клеток и органов у мышей.

Наиболее часто используемые вирусные системы включают ретровирусов, лентивирусов, аденовирусы и адено-ассоциированный вирус (AAV) <sдо> 11. Ретровирусы одноцепочечных РНК – вирусы и могут ввести свой генетический материал в геном клетки – хозяина в стабильном состоянии во время митотического деления, обеспечивая потенциал для непрерывного экспрессии генов в трансдуцированных клеток – мишеней и органов ^12-14. Тем не менее, многие виды ретровирусов инфицируют только делящиеся клетки, и их эффективность в непролиферирующих клетках очень низкий ^15. Это ограничивает их полезность для доставки генов. Лентивирус является род семейства ретровирусы. В отличие от других ретровирусов, Лентивирус может заражающие как разделительные и не делящиеся клетки и широко используется для переноса генов в постмитотическими и высоко дифференцированных клеток ^16. Жизненный цикл Лентивирус также включает в себя интеграцию векторной ДНК в геном хозяина. Таким образом, Лентивирус-опосредованной доставки генов обеспечивает стабильную и длительную экспрессию трансдуцированных генетических элементов ^16-18. Тем не менее, эта функция может представлять собой двойную-еdged меча в использовании этих вирусов манипулировать экспрессию генов, а интеграция векторной ДНК, может привести к инсерционного мутагенеза в клетках-хозяевах и может вызвать артефактного эффекты. Аденовирус является еще одним широко используемой системой доставки генов. В отличие от ретровирусов и лентивирусов, аденовирусов неинтегрированы и не мешают геномного целостности клеток – хозяев , ^8,10,11,19. Кроме того, аденовирусы могут трансфекцию ДНК во многие типы клеток, и инфекция не зависит от активной клеточного деления ^19. Другой важной характеристикой аденовирусов является легкость очистки вектора, как вирусные векторы имеют возможность быть воспроизведен ^19,20. Тем не менее, основной нюанс этой системы является то, что аденовирус – инфекция может вызвать сильный иммунный ответ в клетках – мишенях и органов ^19, ограничивающей его применение во многих исследованиях, в частности , в исследованиях по генной терапии.

По сравнению с этими различного типаs вирусных векторов, рекомбинантный аденосателлитные вирус (Раав) , как представляется , система доставки ^21,22 идеальным гена. Он обладает минимальной иммуногенность и патогенность ^23,24. Кроме того, Раав инфицирует широкий спектр типов клеток, в том числе и как разделяющего непролиферирующих клеток. В большинстве случаев Раав не интегрируется в хост геномов; Таким образом, риск нежелательных генетических или геномных изменений в клетках – мишенях является низким ^22.

В последнее время системы Раав были успешно использованы для доставки в естественных условиях ДНК , кодирующей белки, микроРНК, shRNAs и Crispr-gRNAs в сердечной мышцы мыши ^23,25-29. Эта методика способствовала фундаментальных исследований и исследований генной терапии в области сердечно-сосудистых исследований. Здесь подробная процедура генерации векторов rAAV9, которые эффективно сверхэкспрессируют или нокдауна генов, представляющих интерес в сердцах мышей было описано. Протокол обеспечивает простой и эффективный методманипулируя экспрессию генов сердца в мышиных экспериментальных моделях.