JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bio-ingénierie

Синтез катионизированные Magnetoferritin для сверхбыстрое НАМАГНИЧЕННОСТИ клеток

Published: December 13, 2016
doi:
10.3791/54785
, , , , ,
1Bristol Centre for Functional Nanomaterials,University of Bristol, 2Department of Materials,Imperial College London, 3Self Assembly Group,CIC nanoGUNE, 4Ikebasque, Basque Foundation for Science, 5School of Cellular and Molecular Medicine,University of Bristol, 6H.H. Wills Physics Laboratory,University of Bristol

Summary

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Abstract

Многие важные биомедицинские приложения, такие как изображения клеток и дистанционного манипулирования, может быть достигнуто путем мечения клеток с наночастицами суперпарамагнитных оксида железа (SPIONs). Достижение достаточного клеточного поглощения SPIONs является вызовом, который традиционно встречает подвергая клетки повышенных концентраций SPIONs или продлевая время экспозиции (до 72 ч). Тем не менее, эти стратегии могут опосредовать токсичности. Здесь мы представляем синтез белка на основе Spion magnetoferritin, а также протокол функционализирующее легкое поверхности, что обеспечивает быструю клеточную намагниченность, используя низкие концентрации воздействия. Spion Ядро magnetoferritin состоит из кобальта, легированного оксида железа со средним диаметром частиц 8,2 нм, минерализуемого внутри полости селезенки лошади апо-ферритина. Химическая катионирования из magnetoferritin произвел роман, высоко-активные мембраны Spion, что намагниченные мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSCs), используя в качестве времени инкубацииКороче говоря, как одна минута и железа концентрациях, как минимумы 0,2 мм.

Introduction

Поверхность связывания или интернализации наночастиц суперпарамагнитных оксида железа (SPIONs) позволило намагниченность различных типов клеток для таких приложений, как визуализация и дистанционное манипулирование. 1 Однако достижение достаточной клеточной намагниченность может быть проблемой, особенно , когда взаимодействие между Spion и поверхностью клеток является слабым. 2 В прошлом длительной экспозиции или высокой концентрации Spion были использованы в качестве стратегии для преодоления этой проблемы. 3,4 Тем не менее, эти стратегии являются проблематичными , поскольку они увеличивают токсичность 5,6 и имеют очень ограниченный успех в типах клеток с низким уровнем интернализации, таких как лимфоциты. 7 Для усиления клеточного поглощения SPIONs, несколько поверхностных подходов функционализации были изучены. Например, антитела , которые были использованы для содействия опосредованного рецептором эндоцитоза, 8 в то время как неспецифическое поглощение может быть достигнуто с помощью трансфекции Aджентльмены 9,10 или клеточные проникающие виды, такие как ВИЧ – ТАТ-пептида. 11,12 Однако антитела и пептида функционализации подходы ограничены дорогостоящих реагентов и сложного синтетического препарата, в то время как трансфекцию агенты могут вызвать осаждение наночастиц и отрицательно влияют на функции клеток. 13,14

Мы недавно описали синтез химически катионизированного magnetoferritin, новый Spion, который был очень эффективен в намагничивающих мезенхимальных стволовых клеток человека (hMSCs) с использованием времени инкубации максимально коротким одной минуты. 15 Magnetoferritin синтезируется воссоздания Spion внутри деминерализованной полости белка ферритина хранения железа. 16 Этот белок на основе Spion сочетает в себе множество свойств , которые делают его хорошо подходит для клеточной намагниченности, такие как контроль над магнитными свойствами магнитного сердечника, 17-19 и биосовместимость и растворимость в воде , предоставляемых белковой оболочки. В дальнейшемБолее того , поверхность функционализации легко достигается благодаря адресуемых аминокислот , которые могут быть химически или генетически 20-22 модифицированы. 23-25 , мы показали , что химические катионирования кислых аминокислотных остатков белковой оболочки создает стабильные наночастицы , которые легко взаимодействовали с анионными доменами на клеточной поверхности , что приводит к быстрому и персистирующей клеток намагниченности. Эта процедура исключает необходимость в кропотливой функционализации и длительных протоколов инкубации, а также из-за неспецифического механизма маркировки эта быстрая стратегия намагничивания должна найти широко распространенный применение в других типах клеток. Здесь мы представляем в глубокий доклад сверхбыстрым методом мечения клеток, в том числе подробные протоколы синтеза, очистки и поверхностной функционализации катионизированного magnetoferritin.

Protocol

Человеческие мезенхимальные стволовые клетки (hMSC) собирали из проксимального отдела бедренной кости костного мозга пациентов, перенесших остеоартритом тотального эндопротезирования тазобедренного сустава, в полном соответствии с рекомендациями Southmead больницы Исследовательский комитет по этике Бристоль (ссылка # 078/01) и после было получено согласие пациента. 1. Magnetoferritin Синтез и очистка Основные пометки Выполните синтез magnetoferritin в герметичную, с двойной рубашкой реакционный сосуд при 65 ° С в атмосфере азота, чтобы ограничить окисление металла предшественников. Вводят растворы солей металла и перекиси водорода через порты доступа в крышке в реакционный сосуд с помощью шприца насоса. После синтеза magnetoferritin, очистки белка с помощью анионообменной хроматографии (смотри раздел 1.4), чтобы удалить наночастицы, не помещенные в полости белка с последующей вытеснительной хроматографии (см раздел 1.5) с выделением белка мономеров. Deделяют концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда (смотри раздел 1.6). Подготовка перед синтезом Обескислороживание 500 мл деионизированной воды, поместив трубку, соединенную с баллоном с азотом газа в воде, запечатывая сосуд с липкой пленкой и барботированием через газообразный азот в течение приблизительно 60 мин. Нагревают на водяной бане, соединенный с двойной рубашкой, реакционном сосуде до 65 ° С. Добавить 75 мл 50 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) буфера (рН 8,6) в реакционный сосуд, запечатать сосуд, и Обескислороживание барботированием газообразного азота через буферный раствор в течение приблизительно 20 мин. В то же время, размешать буферный раствор с использованием магнитной мешалки. После того, как деоксигенирующий буферного раствора Hepes, вынуть трубку подачи газообразного азота из буфера и держать его подвешивают в сосуде для поддержания атмосферы азота. Добавить апо-ферритина для достижения конечной концентрации 3 мг / мл. Продолжить перемешивании магнитной мешалкой, но снижают скорость перемешивания, если происходит вспенивание. Готовят 25 мМ маточного раствора сульфата кобальта гептагидрата путем растворения 0,19 г в 50 мл обедненной кислородом деионизированной воды. Готовят 25 мМ раствора аммония железа раствора сульфата гексагидрата путем растворения 0,98 г в 100 мл обедненной кислородом деионизированной воды. Удалить 2,5 мл аммония железа раствора сульфата гексагидрата и заменяют 2,5 мл гептагидрата сульфата кобальта. Готовят 8,33 мМ раствора перекиси водорода в очищенном от кислорода деионизированной воды сначала добавлением 965 мкл раствора пероксида водорода (30% вес / вес) до 9 мл обедненной кислородом деионизированной воды, а затем добавлением 1 мл этого к югу от запаса до 99 мл венозная деионизированной воды. синтез Magnetoferritin Вводят 10,1 мл как предшественника железо-кобальт и перекиси водорода одновременно в апо-ферритина раствора (магнитно-stirred) при скорости потока 0,15 мл / мин, с использованием двух шприцевой насос (общий объем инъекции: 20.2 мл). В течение периода впрыска, Обескислороживание еще 500 мл деионизированной воды. Примечание: Содержимое реакционного сосуда постепенно принимают темно-коричневый цвет, как протекает реакция. Незадолго до завершения первой инъекции, подготовить еще 100 мл предшественника железо-кобальт и раствором перекиси водорода с использованием свеже венозная деионизованной воды. Повторите операцию подачи, описанный в разделе 1.3.1, используя свежеприготовленные растворы железо-кобальт и перекиси водорода. В течение периода впрыска, Обескислороживание еще 500 мл деионизированной воды и действуйте, как описано в разделе 1.3.3 и 1.3.4. После третьей инъекции, оставить раствор созревать в течение 15 мин при перемешивании. Добавить 1,5 мл раствора цитрата натрия 1 М в реакционный сосуд в хелат свободных ионов металла в растворе. Удалить раствор из реакциисосуд, в 50 мл центрифужные пробирки, центрифуги в течение 30 мин при 4350 XG и передать супернатанта через шприцевой фильтр 0,22 мкм. На данном этапе, отфильтрованный супернатант можно хранить при температуре 4 ° С до очистки. Ионообменная хроматография Загрузить образец на колонку (диаметром 2,5 см, длиной 20 см), содержащей катионный матрицу с использованием перистальтического насоса при скорости потока 10 мл / мин. Промыть колонку с приблизительно 100 мл рабочего буфера (50 мМ трис (гидроксиметил) аминометан (Трис) буфера, рН 8,0) с использованием градиента насоса, при скорости потока 10 мл / мин. Для элюирования белка, промыть колонку со скоростью 10 мл / мин с увеличением концентраций хлорида натрия (NaCl) в Трис-буфере: 150, 500 и 1000 мМ конечной концентрации NaCl, 150 мл каждой концентрации. Как белок элюировался при концентрации NaCl 500 мМ, собирают его в долях по 50 мл с использованием автоматического коллектора фракций. Примечание: ДляПодробный протокол ионообменной хроматографии консультации ранее опубликованных протоколов. 26 Вытеснительной хроматографии Концентрируют 150 мл magnetoferritin до объема примерно 2 мл с использованием 15 мл центробежный фильтрующий блок, за которым следует блок объемом 4 мл. Обратитесь к инструкциям производителя центробежных блоков фильтров (см список материалов) для детального протокола этой процедуры. Нагрузка Концентрированный образец на колонку для гель-фильтрации с использованием цикла впрыска. Промыть колонку с рабочим буфером (50 мМ трис-буфера, рН 8,0, содержащем 150 мМ NaCl) при скорости потока 1,3 мл / мин. Соберите 6 мл фракции с использованием автоматического коллектора фракций. Белковые мономеры вымывается в прошлом. В этот момент, очищенный magnetoferritin можно хранить при температуре 4 ° С до катионных. ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробного протокола вытеснительной хроматографии с использованием колонки гель-фильтрации консультации Previously опубликованы протоколы. 27 Определение концентрации белка Готовят стандарты ферритина 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 и 1 мг / мл в 50 мМ трис-буфера с использованием коммерчески доступного лошади ферритин селезенки. Примечание: Концентрация белка коммерчески доступного ферритина указывается на бутылке. Если нет, то обратитесь к поставщику для получения этой информации. Развести образцы magnetoferritin неизвестной концентрации в 50 мМ трис-буфера, пока цвет раствора не будет соответствовать примерно цвет 0,5 мг / мл стандарта. Запишите коэффициент разбавления. Добавьте 10 мкл каждого стандартного и magnetoferritin образца в трех повторах в лунки 96-луночного планшета. Добавить 200 мкл готового реагента Брэдфорда в каждую лунку (см список материалов для Бредфорд деталей анализа реагентов). Инкубируют при комнатной температуре в течение 8 минут. Измерьте оптическую плотность при λ = 595 нм , используямикропланшет читатель. Участок среднего значения абсорбции ферритина стандартов в зависимости от концентрации белка, и с помощью наклона и отрезок, отсекаемый линейной аппроксимацией для расчета концентрации образца magnetoferritin. Примечание: Примите во внимание коэффициент разбавления, который был использован для регулировки образца magnetoferritin к стандартной кривой. 2. Magnetoferritin катионных Основные пометки Примечание: Для magnetoferritin катионных, N, N – диметил-1,3-пропандиамин (УД) был соединен с аспарагиновой и глутаминовой кислотных остатков на поверхности ПВ с использованием N – (3-диметиламинопропил) – гидрохлорид -ethylcarbodiimide N '(ДХЭ). Проводить реакцию при комнатной температуре при перемешивании. Протокол , приведенная ниже для катионных 10 мг magnetoferritin в общем объеме 5 мл (концентрация белка 2 мг / мл). Тем не менее, масштаб вверх или внизсохраняя белок: УД: EDC коэффициенты соответствуют, а также объемы буферного раствора и magnetoferritin. Перед реакцией катионных, диализировать образцы magnetoferritin в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7), содержащем 50 мМ NaCl. Это очень важно, чтобы удалить Трис буфера для элюции и избежать нежелательных реакций между амином Трис и ВДГ-активированных остатков карбоновых кислот. Определить концентрацию белка после диализа и регулировать его до 4 мг / мл перед катионизации. протокол катионных Взвесить 374 мг УД и растворяют в 2,5 мл 200 мМ 2- (N -morpholino) этансульфоновой кислоты (MES) буфера. Отрегулируйте рН раствора до приблизительно 7 с помощью концентрированной (6 М) соляной кислоты (HCl). ВНИМАНИЕ: Выполните этот шаг в вытяжном шкафу, так как добавление кислоты к УД выпускает токсичные пары! Добавить 2,5 мл раствора magnetoferritin в дозе 4 мг / мл (конечная концентратрация MES составляет 100 мМ, конечная концентрация magnetoferritin составляет 2 мг / мл, общее количество белка составляет 10 мг). Добавьте магнитную мешалку и перемешивают в течение 2 ч для уравновешивания. Тщательно регулировать рН раствора до 5,0 с помощью 1 М HCl. Добавить 141 мг порошка EDC к раствору УД / magnetoferritin. Продолжайте перемешивание в течение 3,5 ч. Фильтруют раствор через шприцевой фильтр 0,22 мкм для удаления осадка. Добавить раствор в диализной трубке с 12-14 кДа молекулярной массой отсечением и диализ против 4 л 50 мМ фосфатного буфера (рН 7), содержащем 50 мМ NaCl в течение 2 дней при температуре 4 ° С, заменяя буфер диализный по крайней мере три раз в этот период. Примечание: На данный момент, в катионную magnetoferritin можно хранить при температуре 4 ° С до дальнейшего использования. 3. мезенхимальных стволовых клеток Этикетировочное с катионизированные Magnetoferritin Основные пометки <lя> Выполнить все культуры клеток, используя класс II шкафы ламинарного потока и увлажненной инкубаторы при 37 ° С и 5% атмосфере диоксида углерода. Культура клеток в качестве монослоя с использованием 175 см 2 колбах и 20 мл культуральной среды, который был пополнен через каждые 3 – 4 дня. Питательная среда состояла из Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM), содержащий 1000 мг / л глюкозы, 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки, 1% (об / об) раствор пенициллина / стрептомицина, 1% (об / об) л -alanyl-L-глутамин раствора и 5 нг / мл свеже дополненной фактором роста фибробластов человека. Магнитная маркировка hMSC с катионизированные magnetoferritin Семенной 150000 hMSCs в 25 см 2 колбы и оставляют на ночь придерживаться при 37 ° С. Фильтр стерилизовать катионизированные magnetoferritin через 0,22 мкм шприц-фильтр и определяют концентрацию белка. Хранение стерильных условиях, подготовить 0,5 мкМ раствора катионизированные magnetoferriолово в фосфатном буферном растворе (PBS). Хранить ограничен в стерильной культуре капюшоном до использования. Мыть нанесенное клетки с 2 мл PBS при комнатной температуре. Добавить 1 мл стерилизованного раствора катионизированного magnetoferritin к посеянных клеток и инкубируют в течение требуемого периода времени (1 мин до 1 ч). Промыть клетки с PBS, а затем урожай клеток путем добавления 0,5 мл трипсина / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и инкубирования при 37 ° С в течение 5 мин. Добавить 1 мл культуральной среды для инактивации трипсина / EDTA, Переносят раствор в 15 мл центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 524 х г. Жидкость над осадком сливают и вновь приостановить осадок клеток в 0,5 мл буфера магнитной сепарации, состоящую из 0,5% (вес / об) фетальной сыворотки теленка и 2 мМ ЭДТА в PBS. Разделение магнитной ячейки Прикрепите магнит к многоканальному подставке, и добавьте магнитную разделительную колонну к магниту. Поместите фильтр предварительного разделения на гое колонки. Поместите 0,5 мл буфера магнитного разделения в фильтре предварительной сепарации и дайте ему поработать как через фильтр и колонки, чтобы вымыть и замочить их. Поместите центрифужную пробирку объемом 15 мл в колонке. Добавьте 0,5 мл клеточной суспензии в фильтре резервуара колонны магнитной сепарации. Когда резервуар пуст, добавьте 0,5 мл буфера магнитного разделения. Когда резервуар пуст, добавить еще 0,5 мл буфера магнитного разделения. Повторите еще один раз (общий объем буфера магнитного разделения, используемого для промывки должна быть 1,5 мл). Этот этап промывки вымывается все без намагниченные клетки из колонки (фракции клеток не-намагниченной). Удалить столбец из магнита и поместите его в свежем 15 мл центрифужную пробирку. Удалить фильтр из резервуара колонны. Добавить 1 мл буфера магнитного разделения в резервуар и немедленно протащить через колонну с помощью плунжера, подаваемое от производствар. Это элюируется намагниченного клетки из колонны в центрифугу трубку (намагниченные клеточной фракции). Центрифуга обе пробирки в течение 5 мин при 524 х г. Жидкость над осадком сливают и вновь приостановить гранул клеток в 0,3 мл PBS. Подсчитайте количество чисел клеток в каждой фракции, используя гемоцитометра. Определить долю намагниченных клеток, М (%), используя следующее уравнение: где N (М) число клеток в намагниченной фракции и п (М + НМ) является суммой количества ячеек в намагниченных и не намагниченных фракций. Подготовка hMSCs , меченные катионизированные magnetoferritin для железа количественной оценки с использованием индуктивно связанной плазмой оптического эмиссионной спектроскопии (ICP-OES) Примечание: Протокол может должны быть адаптированы для других инструментов ICP-OES. Желательно проконсультироваться с реТехник ответственна. Центрифуга известное число клеток в течение 5 мин при 524 х г. Удалить супернатант PBS и добавляют 0,25 мл 50% (об / об) азотной кислоты. Vortex смешивать подкисленной клеточной суспензии. Инкубируют при комнатной температуре в течение ночи. Добавить 4,75 мл дистиллированной воды для каждого образца и вихревой смеси. Анализ с ICP-OES. 28 Осуществить нормировку измеренное содержание железа в количестве ячеек для определения значения для содержания клеточного железа.

Representative Results

ТЭМ использовали для подтверждения наночастицами минерализацию внутри Апоферритина полости и определить средний размер сердечника (Фигуры 1А и 1В). Анализ изображений неокрашенных образцов magnetoferritin дало средний диаметр сердцевины, равный 8,2 ± 0,7 нм, и ауротиоглюкоза пятно подтвердили наличие наночастиц внутри клетки белка. Обратите внимание, что изображения показывают образец magnetoferritin, который дополнительно очищали с помощью магнитной сепарации для выделения однородных ядер наночастиц. Magnetoferritin образцы, которые не были очищены магнитно имеют немного более широкое распределение размеров активной зоны. 29 Анализ структуры ядра magnetoferritin с использованием отдельных междугородним дифракции электронов указывает на возможное наличие структуры обратной шпинели на основе магнетита (Fe 3 O 4) и / или маггемит (γ-Fe 2 O 3), а также как шпинель структура из – за CO 3 </к> O 4. Кроме того, спектры комбинационного рассеяния показали пики , приписываемые Fe 3 O 4, небольшое количество гамма-Fe 2 O 3 и феррита кобальта (рис 1 C). ИСП-OES анализ magnetoferritin показал в среднем 102 мкг железа и 0,9 мкг кобальта на миллиграмм magnetoferritin. Схематическое включен, иллюстрирующий последующий этап катионных (рисунок 2 А). Гидродинамический диаметр magnetoferritin и катионизированного magnetoferritin составила 11,8 ± 1,1 нм и 12,5 ± 1,4 нм, соответственно, как определено методом динамического светорассеяния. Эффективность катионирования ковалентной ПОУД-соединения с magnetoferritin оценивали с использованием дзета потенциометрии и матричной лазерной десорбцией ионизации время пролета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Дзета-потенциал изменяется от -10.5 мВ для MF до + 8,3 мВ для катионизированные magnetoferritin, что подтверждаетизменение поверхностного потенциала от отрицательного к положительному (таблица 1). Массовые эксперименты спектрометрии обнаружили субъединицу молекулярную массу 20,1 кДа для родной апо-ферритина и 21,1 кД для катионизированного апо-ферритина (рис 2 B). Это увеличение массы соответствует приблизительно 12 связанных молекул ДМПА на субъединицы белка, а также катионных 288 остатков по всему белка 24-субъединиц. Магнитная восприимчивость насыщения и измеряли с помощью SQUID магнитометрии, а поперечные и продольные релаксивность измеряли с помощью магнитно-резонансной томографии. Магнитные свойства были похожи на magnetoferritin и катионизированного magnetoferritin, указывая , что катионирования имели незначительное влияние на магнитные свойства приложенном Spion (таблица 1). Кроме того, эти свойства аналогичны свойствам других наночастиц на основе оксида железа, 19,30 демонстрируя , что катионную Магнеtoferritin будет столь же пригодны в качестве обычных Spion на основе МРТ контрастных агентов в повышении контрастности изображения. После 30-минутной экспозиции, клеточная поверхность была густо покрыта катионизированного magnetoferritin (рисунок 3 А). Тем не менее, после одной недели, не наночастицы не были найдены на поверхности клетки (рис 3 В). Катионизированные magnetoferritin был удивительно эффективен при магнитно-маркировки hMSCs. Следует отметить, что воздействие на клетки к катионизированного magnetoferritin в течение одной минуты привело к намагничивании 92% популяции клеток и доставки 3,6 пг железа на клетку. Увеличение времени инкубации до 15 мин приводило к намагниченности всей популяции клеток (рис 3 C). Рисунок 1: Характеристика magnetof erritin сердечники, легированный 5% кобальта. ПЭМ – изображения magnetoferritin окрашивали ауротиоглюкоза (А) и неокрашенным (В). Врезка показывает соответствующий дифракции электронов с индексами магнетита. Шкала бар: 20 нм. (C) Спектр комбинационного рассеяния для magnetoferritin. Стрелки указывают основные режимы комбинационного рассеяния колебаний для феррита кобальта (T 2 г), магнетит и маггемитом (оба A 1g). 31,32 Длина волны лазера использовали 532 нм. (Изображение взято из Окуда и др. 18). Обратите внимание, что этот magnetoferritin образец был дополнительно очищен с помощью магнитной сепарации, который изолирован равномерно нагруженные частицы magnetoferritin. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 785fig2.jpg "/> Рисунок 2: катионных из magnetoferritin. A) доступных для растворителя площадь поверхности представления , показывающие распределение кислых (красный) и основные (желтые) аминокислотных остатков на поверхности белка. Magnetoferritin (1) модифицируют для катионизированного magnetoferritin (2) сшиванием карбодиимид-опосредованного УД кислых аминокислотных остатков на протеине поверхности (3). Б) Масс – спектрометрия анализ апо-ферритина и катионной апо-ферритина субъединиц. Масс-к заряду (м / г) спектр апоферритина (ApoF) и катионной апоферритина (кат-ApoF), порожденную MALDI-TOF. Увеличение массы от 20,1 кДа до 21,1 кДа наблюдается после катионных. (Изображение взято из Коррейя Каррейра и др. 15) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <p class="jove_content" fo:keер-together.within-страница = "1"> Рисунок 3: Магнитная маркировка и разделения клеток из hMSCs , инкубированных с катионизированные magnetoferritin. А) по методу ПЭМ изображение hMSCs после 30-минутной инкубации с катионизированного magnetoferritin. Стрелка указывает на наличие magnetoferritin ядер плотно упакованных на поверхности клетки. Шкала баров: 200 нм. B) ПЭМ – изображение hMSC одной недели после маркировки. Поверхность клеток ясно из катионизированного magnetoferritin. С) Исследование быстроты магнитной маркировки: 92% популяции клеток были намагничены после того, как в течение одной минуты экспозиции с 0,5 мкМ катионизированных magnetoferritin, и вся популяция клеток намагничивался в течение 15 минут. Содержание железа в клетки определяли с помощью ICP-OES. Среднее значение и стандартное отклонение от трех биологических повторностях показаны. (Изображение взято из Коррейя Каррейра и др. 15) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. MF кот-MF Гидродинамический диаметр [нм] 11,8 ± 1,1 12,5 ± 1,4 Дзета – потенциал [мв] (-) 10,4 ± 0,2 8,3 ± 0,7 Магнитный момент насыщения [Am 2 кг -1] 54,9 ± 1,6 55,3 ± 1,4 Масс – восприимчивость [х 10 4 м 3 кг -1] 1,75 ± 0,08 1,75 ± 0,07 Продольная релаксивность [мм – 1 с -1] 2,6 ± 0,1 2,3 ± 0,1 Поперечная релаксивность [мм – 1 с -1] 44,6 ± 1,0 52,8 ± 0,8 Таблица 1: Физико – химические характеристики magnetoferritin (MF) и катионной magnetoferritin (кат-MF). (Таблица заимствована из Коррейя Каррейра и др. 15)

Discussion

TEM образцов magnetoferritin окрашенных ауротиоглюкоза показал успешную минерализацию наночастиц внутри клетки белка. Электронная дифракция и анализ комбинационное ядра наночастицами показали наличие феррита кобальта, что указывает на успешное легирование ядра наночастицы с кобальтом. Это свидетельствует о том, что наночастицы смешанного оксида могут успешно быть минерализованной в апо-ферритина полости. Кроме того, мы показали ранее, что кобальт легирование может изменяться путем изменения количества предшественника кобальта добавляют к реакционной смеси, что дает возможность настройки магнитных свойств. 18

Magnetoferritin синтез может быть выполнен в различных сосудах, до тех пор , как они плотно закрывающуюся и имеют порты доступа , через которые реагирующие вещества могут быть введены (например, три-горлую круглодонную колбу). Температура реакции должна поддерживаться на уровне 65 ° C, либо путем размещения сосуда ва / в масляной ванне воды или с использованием двойной рубашкой сосуд. Здесь мы использовали установку с двойной рубашкой электрохимического элемента для проведения синтеза. Для того, чтобы гарантировать успешный синтез, поддержание правильного рН и предотвращения загрязнения кислорода в водных растворах имеет решающее значение. Растворов солей металлов всегда должны быть готовить непосредственно перед употреблением, а не заранее. Кроме того, коммерческие решения апоферритина могут различаться по качеству и влияют на результат синтеза (например., Размер наночастиц основной минерализованной). Это может помочь диализировать раствор Апоферритина в 50 мМ HEPES-буфера (рН 8,6) до синтеза для удаления остатков восстановитель, используемый производителем. Полезно сделать отметку пакетного номер апо-ферритина раствора, используемого для синтеза, поэтому он может быть специально запросить у производителя следует дополнительный материал, должны быть куплены. Кроме того, концентрация белка коммерчески доступного апо-ферритина должно быть указано на бутылке, которая можетиспользоваться для расчета объема апо-ферритина раствора, необходимого для синтеза. Если это не так, обратитесь к поставщику для получения этой информации.

Преимущество постепенного добавления солей металлов и перекиси водорода – как представлено здесь и в предыдущих докладах – это то , что минерализация ядра наночастицы можно регулировать таким образом, что различные факторы нагружения (то есть, с наночастицами размеров) может быть достигнуто. 33 Кроме того, можно очистить magnetoferritin далее , используя магнитную разделительную колонну, например, колонки , заполненной порошком из нержавеющей стали , закрепленной внутри электромагнита. 34 Таким образом, сильно монодисперсные сердечники из наночастиц может быть выделен из объемного образца magnetoferritin. Тем не менее, для магнитной маркировки клеток, как представлено здесь, это не требуется. Ограничением синтеза magnetoferritin является относительно низкий выход синтез около 10%, а относительно высокая стоимость коммерческой апо-Ferritin решения. Тем не менее, апо-ферритина также могут быть получены из доступных дешево селезенки лошади ферритин, следуя установленным протоколам де-минерализация. 16

Катионных из magnetoferritin достигалось путем добавления мольного соотношения 250 молекул УД и 50 молекул EDC на отрицательно заряженный остаток (расчеты на основании аминокислотной последовательности лошади ферритин селезенки). Этот избыток реагента над белком приводит к высокой эффективности катионных, сопоставимы также сообщалось ранее результаты для катионных ферритина. 35 Для анализа MALDI-TOF, апоферритина и катионизированного апоферритина были использованы из-за чрезмерной молекулярной массы ядра magnetoferritin. Для того, чтобы дать высокую эффективность катионных, оптимальное значение рН также имеет решающее значение. ВДГ-опосредованной сшивание наиболее эффективен в слабокислой среде, и мы обнаружили, что рН 5 дало оптимальные результаты катионных для magnetoferritin. Тем не менее, для других белков Cationization рН может должны быть оптимизированы. Катионизации на уровне или близко к изоэлектрической точки белка следует избегать, так как это может привести к серьезным осадков.

Стволовой клетки намагниченности с катионизированные magnetoferritin была очень эффективным и может быть достигнуто с использованием времени инкубации значительно ниже 30 минут. Даже за одну минуту инкубации приводит к ячеистой содержанием железа 3,6 пг, которая находится в пределах указанного диапазона, необходимого влиять T2 и T2 * контраст для МРТ. 36,37 Примечательно также , что эта эффективная маркировка достигается при низких концентрациях внеклеточного железа. Например, предыдущие исследования с использованием анионных наночастицы сообщают уровни железа 10 пг на клетку после 30-минутного периода инкубации с 5 мМ железа. 38 Для сравнения, инкубация с катионизированного magnetoferritin раствора , содержащего 0,5 мкМ белка соответствует инкубации с приблизительно 0,2 мМ железа , а также дает примерно 10 мкг железа на CELл через 30 минут. Мы были не в состоянии четко определить любые эндоцитозного везикулы с помощью ПЭМ. Тем не менее, предыдущие исследования с использованием катионизированные ферритина обнаружили, что интернализация произошло в течение первых десяти минут воздействия. 39,40 катионизированные ферритина может быть локализован в пузырьках с покрытием, что указывает на клатрин или Кавеолин-зависимого эндоцитоза. В этом же исследовании также сообщил, что через 30 минут инкубации, в катионную ферритина еще присутствует на поверхности клеток, а также в многопузырьковые тел, напоминающих лизосомы.

Другие области применения могут включать в себя катионных апо-ферритина клеток , нагруженных другими наночастицами и / или функциональными молекулами, такими как противораковые наркотиков 41 или квантовые точки 42. Катионных этих ферритина конструкций может привести к более быстрой и более эффективной доставки своего груза к клеткам.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was financed through the Bristol Centre for Functional Nanomaterials, sponsored by the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC grant code EP/G036780/1).

Materials

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific BPE310-1 powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis!
apoferritin from equine spleen Sigma Aldrich A3641 we used LOT# 081M7011V
cobalt sulfate heptahydrate  Sigma Aldrich C6768 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
ammonium iron sulphate hexahydrate  Sigma Aldrich F1543 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
hydrogen peroxide solution (30%) Sigma Aldrich 216763 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
sodium citrate Sigma Aldrich S1804 powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months
Millex GP filter unit, 0.22 micron Merck Millipore SLGP033RS syringe filter
Trizma base Sigma Aldrich T1503 powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use
sodium chloride Sigma Aldrich 31434 poweder; add to buffers as required
Centriprep centrifugal filter units Merck Millipore 4310 Ultracel YM-50 membrane, 12 mL volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 mL to 20 mL
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis Merck Millipore UFC801024 Ultracel-10 membrane, 4 mL volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 mL to 2 mL
ANX Sepharose 4 Fast Flow GE Healthcare 17-1287-04 we packed this column ourselves
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column  GE Healthcare 17-1196-01 this column was bought ready packed
ÄKTA purifier system GE Healthcare 28406264
sample pump P-960 GE Healthcare 18-6727-00 load sample at a flow rate of 10 mL/min
automated fraction collector Frac-950 GE Healthcare 18-6083-00
Bradford assay reagent Sigma Aldrich B6916 solution ready to use
Ferritin, Type I: from horse spleen Sigma Aldrich F4503 prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) Sigma Aldrich 308110 CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma Aldrich E6383 keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle
 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) AppliChem A0689,0500 powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5
dialysis tubing cellulose membrane Sigma Aldrich D9652 soak 10 min in deionized water before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1000 mg/L glucose Sigma Aldrich D5546 warm in 37 °C  water bath before use
fetal bovine serum Sigma Aldrich F7524 add to stock DMEM bottle, 10 % (v/v) final concentration
penicillin/streptomycin solution Sigma Aldrich P0781 add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration
glutamax solution Gibco 35050-087 add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration
human fibroblast growth factor PeproTech 100-18B add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/mL
phosphate buffered saline Sigma Aldrich D8537 sterile solution, for cell cultrue
trypsin/EDTA solution Sigma Aldrich E5134 keep in freezer and defrost in 37 °C  water bath before use
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E5134 powder; make a 2 mM solution in PBS 
bovine serum albumin Sigma Aldrich A7030 add 0.5 % (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter
MACS multi stand  Miltenyi Biotec 130-042-303 for attachment of MACS magnet
MACS MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201 disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100 % ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches
MiniMACS separator magnet Miltenyi Biotec 130-042-102 can be bought as a starter kit, together with columns and stands
MACS column pre-separation filter Miltenyi Biotec 130-041-407 30 mm filter
Nitric acid solution, 64-66% Sigma Aldrich 7006
Titrando 907, syringe pump Metrohm 2.907.0020
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin
SpectraMax M5 Molecular Devices Used to measure absorbance in the Bradford assay
JEM 1200 EX JEOL Used for TEM imaging of magnetoferritin
InVia Raman spectrometer Renishaw Used for Raman spectroscopy
Torus DPSS laser Laser Quantum Used for Raman spectroscopy
Bruker UltrafleXtreme Applied Biosystems Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin
ZetaSizer Nano-ZS Malvern Instruments Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin
Magnetic Property Measurement System Quantum Design Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility
Magnetom Skyra Siemens Used to determine longitudinal and transverse relaxivity 
Tecnai 12 BioTwin Spirit FEI Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin
710 ICP-OES Agilent Used to determine iron content in cells
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26 (18), 3995-4021 (2005).
  2. Decuzzi, P., Ferrari, M. The role of specific and non-specific interactions in receptor-mediated endocytosis of nanoparticles. Biomaterials. 28 (18), 2915-2922 (2007).
  3. Cunningham, C. H., et al. Positive contrast magnetic resonance imaging of cells labeled with magnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53 (5), 999-1005 (2005).
  4. Song, H. T., et al. Surface modulation of magnetic nanocrystals in the development of highly efficient magnetic resonance probes for intracellular labeling. J. Am. Chem. Soc. 127 (28), 9992-9993 (2005).
  5. Daldrup-Link, H. E., et al. Targeting of hematopoietic progenitor cells with MR contrast agents. Radiology. 228 (3), 760-767 (2003).
  6. Singh, N., Jenkins, G. J., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Rev. 1, (2010).
  7. Dodd, S. J., et al. Detection of single mammalian cells by high-resolution magnetic resonance imaging. Biophys. J. 76 (1), 103-109 (1999).
  8. Ahrens, E. T., Feili-Hariri, M., Xu, H., Genove, G., Morel, P. A. Receptor-mediated endocytosis of iron-oxide particles provides efficient labeling of dendritic cells for in vivo MR imaging. Magn. Reson. Med. 49 (6), 1006-1013 (2003).
  9. Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104 (4), 1217-1223 (2004).
  10. Bulte, J. W. M., et al. Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells. Nat. Biotechnol. 19 (12), 1141-1147 (2001).
  11. Josephson, L., Tung, C. H., Moore, A., Weissleder, R. High-efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-tat peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 10 (2), 186-191 (1999).
  12. Lewin, M., et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat. Biotechnol. 18 (4), 410-414 (2000).
  13. Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv. Drug Delivery Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
  14. Montet-Abou, K., Montet, X., Weissleder, R., Josephson, L. Cell internalization of magnetic nanoparticles using transfection agents. Mol. Imaging. 6 (1), 1-9 (2007).
  15. Correia Carreira, ., S, , et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. 8 (14), 7474-7483 (2016).
  16. Meldrum, F. C., Heywood, B. R., Mann, S. Magnetoferritin: in vitro synthesis of a novel magnetic protein. Science. 257 (5069), 522-523 (1992).
  17. Klem, M. T., et al. Synthetic control over magnetic moment and exchange bias in all-oxide materials encapsulated within a spherical protein cage. J. Am. Chem. Soc. 129 (1), 197-201 (2007).
  18. Okuda, M., Eloi, J. C., Sarua, A., Jones, S. E. W., Schwarzacher, W. Energy barrier distribution for dispersed mixed oxide magnetic nanoparticles. J. Appl. Phys. 111 (7), (2012).
  19. Uchida, M., et al. A human ferritin iron oxide nano-composite magnetic resonance contrast agent. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1073-1081 (2008).
  20. Danon, D., Skutelsk E, M. a. r. i. k. o. v. s. Y., Goldstei, L. Use of Cationized Ferritin as a Label of Negative Charges on Cell Surfaces. J. Ultrastruc. Res. 38 (5-6), 500-510 (1972).
  21. Valero, E., et al. Magnetic Nanoparticles-Templated Assembly of Protein Subunits: A New Platform for Carbohydrate-Based MRI Nanoprobes. J. Am. Chem. Soc. 133 (13), 4889-4895 (2011).
  22. Zborowski, M., et al. Immunomagnetic isolation of magnetoferritin-labeled cells in a modified ferrograph. Cytometry. 24 (3), 251-259 (1996).
  23. Ikezoe, Y., et al. Growth of Giant Two-Dimensional Crystal of Protein Molecules from a Three-Phase Contact Line. Langmuir. 24 (22), 12836-12841 (2008).
  24. Uchida, M., et al. Targeting of cancer cells with ferrimagnetic ferritin cage nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 128 (51), 16626-16633 (2006).
  25. Yamashita, K., et al. Selective nanoscale positioning of ferritin and nanoparticles by means of target-specific peptides. Small. 2 (10), 1148-1152 (2006).
  26. Williams, A., Frasca, V., Coligan, J. E. UNIT 8.2 Ion-Exchange Chromatography. Current Protocols in Protein Science. , (2001).
  27. Hagel, L., et al., Coligan, J. E., et al. UNIT 8.3 Gel-Filtration Chromatography. Current Protocols in Protein Science. , (2001).
  28. Hou, X., Jones, B. T. Inductively coupled plasma-optical emission spectrometry. In Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R.A. ed. , 1 (2000).
  29. Correia Carreira, S., et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. , (2016).
  30. Simon, G. H., et al. T1 and T2 relaxivity of intracellular and extracellular USPIO at 1.5 T and 3T clinical MR scanning. Eur. J. Radiol. 16 (3), 738-745 (2006).
  31. Jubb, A. M., Allen, H. C. Vibrational Spectroscopic Characterization of Hematite, Maghemite, and Magnetite Thin Films Produced by Vapor Deposition. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (10), 2804-2812 (2010).
  32. Wang, Z. W., et al. High-pressure x-ray diffraction and Raman spectroscopic studies of the tetragonal spinel CoFe2O4. Phys. Rev. B. 68 (9), (2003).
  33. Wong, K. K., Douglas, T., Gider, S., Awschalom, D. D., Mann, S. Biomimetic synthesis and characterization of magnetic proteins (magnetoferritin). Chem. Mater. 10 (1), 279-285 (1998).
  34. Okuda, M., et al. Fe3O4 nanoparticles: protein-mediated crystalline magnetic superstructures. Nanotechnology. 23 (41), 415601 (2012).
  35. Perriman, A. W., Cölfen, H., Hughes, R. W., Barrie, C. L., Mann, S. Solvent-Free Protein Liquids and Liquid Crystals. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (34), 6242-6246 (2009).
  36. Billotey, C., et al. T-cell homing to the pancreas in autoimmune mouse models of diabetes: in vivo MR imaging. Radiology. 236 (2), 579-587 (2005).
  37. Smirnov, P., et al. In vivo cellular imaging of lymphocyte trafficking by MRI: a tumor model approach to cell-based anticancer therapy. Magn. Reson. Med. 56 (3), 498-508 (2006).
  38. Wilhelm, C., et al. Magnetic control of vascular network formation with magnetically labeled endothelial progenitor cells. Biomaterials. 28 (26), 3797-3806 (2007).
  39. MacLean, I., Sanders, E. Cationized ferritin and phosvitin uptake by coated vesicles of the early chick embryo. Anat. Embryol. 166 (3), 385-397 (1983).
  40. Van Deurs, B., Nilausen, K., Faergeman, O., Meinertz, H. Coated pits and pinocytosis of cationized ferritin in human skin fibroblasts. Eur. J. Cell Biol. 27 (2), 270-278 (1982).
  41. Xing, R. M., et al. Characterization and cellular uptake of platinum anticancer drugs encapsulated in apoferritin. J Inorg Biochem. 103 (7), 1039-1044 (2009).
  42. Wong, K. K., Mann, S. Biomimetic synthesis of cadmium sulfide-ferritin nanocomposites. Adv. Mater. 8 (11), 928-932 (1996).

Tags

MagnetoferritinMagnetic NanoparticlesCell MagnetizationMRIMagnetic Cell SeparationApoferritinIron-cobalt PrecursorHydrogen PeroxideCationic MatrixSodium ChlorideTris Buffer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Correia Carreira, S., Armstrong, J. P., Okuda, M., Seddon, A. M., Perriman, A. W., Schwarzacher, W. Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells. J. Vis. Exp. (118), e54785, doi:10.3791/54785 (2016).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image