微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

培養培地、半固体寒天およびバイオフィルムプレート、前培養の調製群がるとスライドのための媒体の準備レノックスブロス（LB）を2g、120℃で20分間、100mLのイオン交換水に寒天、オートクレーブを0.7gを溶解します。実験間の再現性を向上させるために、少量（50〜ml）を使用してください。 すぐに殺菌した後、少なくとも2時間、55℃のインキュベーター中で蒸発し、場所を減らすために培地ボトルのキャップを閉じます。 媒体温度が55℃に焼戻しした後、実験室の無菌フード下の90ミリメートルの直径のポリスチレンペトリ皿に寒天LB培地20ミリリットルを注ぎます。時間経過実験のために5mlのを直径35mmのポリスチレンペトリ皿当たり寒天LB培地を注ぎます。 すぐに注いだ後ペトリ皿を閉じて、互いの上にこれ以上4以下のプレートをスタックし、寒天培地は、少なくとも1時間固化させます。 2xSGミディアムPコロニーバイオフィルムのための償い栄養ブロスを1.6g、塩化カリウム0.2gをし、MgSO 4 7H 2 Oを0.05g、及び120℃で20分のための100mlのイオン交換水、オートクレーブ中で寒天を1.5gを溶解。実験間の再現性を向上させるために、少量（50〜ml）を使用してください。 すぐに殺菌した後、少なくとも2時間、55℃のインキュベーター中での蒸発を低減し、ボトルを配置する培地ボトルのキャップを閉じます。 媒体温度が自己調整55°Cまで、1MのCa滅菌0.1 mlのフィルタを追加するには（NO 3）2溶液0.1mlのフィルタ100ミリモルのMnCl 2溶液を滅菌した後、0.1mlのフィルタを、1mMのFeSO 4溶液、0.5mlの滅菌しました滅菌20％グルコース溶液。 実験室で無菌フードでは、90ミリメートルの直径のポリスチレンペトリ皿当たり寒天2倍SG培地20ミリリットルを注ぎます。時間経過実験のために5mlのを直径35mmのポリスチレンペトリ皿当たり寒天LB培地を注ぎます。 クロ電子ペトリすぐに注いだ後、互いの上に板を積み重ね皿ではなく、4つ以上のプレートと、少なくとも1時間固化する寒天培地をしましょう。 スターター培養物の調製注：B.ズブチリス 168は、構成的に以下に記載する方法で使用NCIB 3610誘導体株は緑色または赤色蛍光タンパク質を産生し、8,27前に説明されました。株は、-80°Cの冷凍庫で日常的に保存されます。 3ミリリットルのLB培地中で-80℃のストックからスターター培養物を接種し、水平振とう（225 rpm）しながら37℃で（16-18時間）一晩インキュベートします。 B.の野生分離株として長く18時間よりも文化をインキュベートしないでください。 枯草菌は凝集及び試験管内のバイオフィルムを形成するほとんど傾向があります。 2.拡散表面のための蛍光標識細菌株の同時接種群がるのための半固体寒天プレートの乾燥、Bのスライディング枯草菌 。 接種前に群がって、20分間スライドさせるための乾燥寒天プレート。層流フード内で発見され、乾燥プレート（ 図1参照）。 注：細菌群がるとスライドは、半固形寒天培地の乾燥度に依存します。不十分な乾燥は鞭毛媒介水泳の結果寒天培地上の水の蓄積を可能にします。遊走の欠如で長時間乾燥時間をもたらします。 図1：実験ワークフロー共通の手順は（左から右へ）培養培地、プレートを乾燥させ、接種および蛍光顕微鏡検出の準備を含め、図に描かれている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 共同接種群がるとスライドのための細菌培養物の 600 nmで一晩スターター培養物の光学密度を決定し、Bの密度正規化された緑色および赤色蛍光タンパク質産生株を混ぜます枯草菌 NCIB 3610または1.5ミリリットルの反応管でのΔの魔女誘導体 。例えば、軽度株2.ボルテックス（最大速度で3秒）のμlの（[株2の一晩培養物のOD 600] / 100 * [株1の一晩培養物のOD 600]）のために株を1100μlのを混ぜます均質な分布。 注：B.そのΔの魔女誘導体は、スライドのために使用されている間サブチリス NCIB 3610株は、スウォーミングを観察するために接種します。 スポット予備乾燥プレートの真ん中に混合培養の2μlを（ 図1を参照）、さらに接種後10分間プレートを乾燥させます。 37℃で培養するには、余分な水分が蓋の上にではなく、寒天表面上に凝縮することを可能にするため直立しました。<BR />注：Bのインキュベーション時間群がる枯草菌は、一般的に 8-16時間の間です。一般的に、群れのエッジは、8時間で90ミリメートルペトリ皿の側面に達します。スライディングは遅いプロセスであり、インキュベーションの少なくとも16から42時間を必要とします。 36時間後、スライドフロントは90ミリメートルペトリ皿の側面に達します。 タイムラプス実験のために、37℃に設定した予熱した段階のインキュベーションチャンバーに直径35mmのペトリ皿を置きます。ペトリ皿の蓋は実験期間を通して除去されたままであることを確認してください。インキュベーターの上に水分形成を回避するために40℃にステージインキュベーターのカバーを設定します。 3.異なる初期細胞密度を持つ蛍光標識細菌株の同時接種 B.のコロニーバイオフィルム形成のための寒天プレートの乾燥枯草菌 。 層流にカバーせずにコロニーバイオフィルムの開発のためのプレートを乾燥接種前に15分間のフード。 注：湿度の上昇や水泳や群がる中の不十分な乾燥結果は29可能です。小さな生物膜コロニーに長すぎる結果を乾燥させます。 コロニーバイオフィルム用の10倍希釈のスターター培養物の調製 B.一晩スターター培養物を生産する緑色および赤色蛍光タンパク質100μlのミックス均質な分布のために1.5ミリリットルの反応管内の枯草菌 168と穏やかにボルテックス。 LB培地中で10倍希釈系列を調製します。 スポット2非希釈のμlあるいは10 1、10 2、10 3、10 4は、バイオフィルム誘導培地を含むプレート上で混合培養物を希釈しました。 注：6~9バイオフィルムコロニーをコロニーが互いに等しい距離で分離されていることを考慮して、単一の90 mmのペトリ皿上で開始することができます。 余分な水分が蓋に凝縮することを可能にするために30℃で直立でプレートをインキュベートし、ない寒天表面上。 注：Bのインキュベーション時間枯草菌バイオフィルムは、1〜3日の間です。 B.の一般的に、コロニーバイオフィルム枯草菌は、2日間で、その平均サイズおよび複雑な構造に到達します。 時間経過実験では、直径35mmのペトリ皿の中央に単一の接種物を配置し、30℃に設定した予熱段階のインキュベーションチャンバー内の皿を置きます。ペトリ皿の上部が実験期間を通して除去されたままであることを確認してください。インキュベーターの上に水分形成を回避するために35℃にステージインキュベーターのカバーを設定します。 標識株の4蛍光顕微鏡検出イメージングのための機器の説明。 表面のコロニー形成および蛍光シグナルを検出するために、0.5X PlanApo目的を搭載した電動式蛍光ステレオズーム顕微鏡（ 材料表での詳細なリストを参照）を使用し、2はLED冷光源（蛍光検出、可視光のための1つのための1）、GFP（50分の525 nmで40分の470 nmおよび発光での励起）とMRFP 629で25分の572 nmの発光にて（励起/用フィルターセット62ナノメートル）、及び高解像度の白黒カメラ。 マルチチャンネルとタイムラプスモジュールを含むステレオズーム顕微鏡で利用可能な適切なソフトウェアと画像収集と処理を実行します。時間経過の実験では、アダプタ付きステレオズーム顕微鏡に取り付けられた標準的な加熱ステージインキュベーターを使用しています。 群がるとスライディング拡張のイメージング 90ミリメートルプレートの最大の可能な領域をキャプチャするために、最も低い倍率を使用してください。ラジアル細菌拡張および蛍光を監視するための可視フィールドの隅に接種（90ミリメートルのペトリ皿の中央）の原点を設定します。 蛍光信号の強度に応じて最適な露光時間を調整します。 注：構成的expreについてBのssed蛍光遺伝子枯草菌 、1.5と3秒で緑色及び赤色蛍光の露光時間は、それぞれ、使用することができます。さらに、10ミリ秒の露光時間は、可視光に適しています。 全体のバイオフィルムコロニーの検出を可能にする倍率を使用して、視野の真ん中にコロニーを調整します。 注：バイオフィルムコロニー中で蛍光シグナルを検出するために、最適な露光時間を拡張し群がっスライドとして蛍光タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルに依存します。以下に代表的な結果を得るためには、緑と赤の蛍光は、それぞれ、1及び3秒の露光間隔を使用して検出しました。 タイムラプスイメージングのために、一定の露光時間を用いて、一定の間隔で画像を取得します。 定量的データ分析のためのImageJソフトウェアによって認識されているファイル形式で画像を記録した蛍光実体を保存します。 5.ダット解析それぞれ異なる蛍光標識された菌株の占有面積を分析するために、BioVoxxelプラグインで拡張ImageJソフトウェアへの関心のファイルを開きます。 のみのオプションが選択されていると、「オートスケール」「すべてのシリーズを開き、「どこで」バイオフォーマットインポートオプション」と呼ばれるウィンドウが表示されたら、「OK」をクリックして、ファイルを開きます。 注：ファイルは、3つの画像の積み重ねとして表示され、各チャネル1は、顕微鏡（緑色、赤色蛍光および明視野像）の画像を記録します。 「スタック」 – – 「イメージ」を選択することで、個々のチャンネルの画像にスタックを切り離しImageJのコントロールパネルの「画像にスタック」。 注：画像が表示され、1月3日（グリーンチャンネル）として番号付けされ、2月3日（赤チャネル）および3/3（明視野）。ここで、明視野像は、分析から除外されます。 画像を分析するために、選択することによって、8ビットの画像にそれぞれ変換します「イメージ」 – 「タイプ」 – 「8ビット」。 「スケールの設定」 -ピクセル2の占有面積を決定するには、「分析」を使用して画像のスケールをリセットします。ウィンドウが異なるスケールオプションをポップアップ表示する場合は、「スケールを削除する場合にクリックします」を選択することによりスケールをリセットします。開いているすべての画像のスケールを除去するためのオプション「グローバル」を確認してください。 背景を削除するには、ImageJのコントロールパネルの「オーバル」ツールを使用して蛍光領域の外側の楕円形の領域（関心領域、ROI）を描きます。 背景楕円形のサイズは、すべての分析画像に対して同じであることを確実にするために、キーボードの[t]は、文字を経由してROIマネージャーに追加します。 「保存」オプション – 背景楕円形のROIは、「詳細」を介して保存することができる場所ROI Managerウィンドウが現れます。 「メジャー」 – 背景楕円形のROIが画像上に表示されている場合は、「分析」を選択することにより、領域の強度を測定します。 注：Aの結果とりわけ平均蛍光強度は、「平均」という欄に表示されるウィンドウが表示されます。 「プロセス」をクリックし、背景楕円形のROIの選択を解除することにより、画像から平均バックグラウンドの蛍光強度の値を減算 – "数学" – "引く"と測定値を挿入します。 「調整」 – – 「しきい値」オプションの「イメージ」を介して画像にしきい値を適用します。方法大津と白黒（B＆W）を選択します。 「ダーク背景」オプションをチェックし、「適用」をクリックすることで、閾値を採用。 注：閾値以上の領域が白色で表示され、しきい値を下回る黒で表示されていることを二値画像への画像の変更。 「粒子の分析 "オプション – "分析 "を経由してしきい値以上のすべてのものを選択します。設定されたウィンドウでは、デフォルトのオプションを維持し、「結果の表示」および「Sを保ちますummarize総面積」「結果ウィンドウで要約して表示ラベルされたカラム内の占有面積を表示するには「OK」にチェックオプション。クリックしてください」。