مراقبة المكانية الفصل في استعمار سطح الميكروبية السكان
Summary
دور نفسك (الفصل المكاني) في سيناريوهات التطور يمكن فحصها باستخدام أنظمة الميكروبية بسيطة في المختبر التي تتيح التحكم تعديل التوزيع المكاني. عن طريق تعديل كثافة الخلية مؤسس، ومختلف مستويات متنوعة يمكن تصور استخدام سلالات بكتيرية fluorescently المسمى في الأغشية الحيوية مستعمرة العصوية الرقيقة.
Abstract
Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.
Introduction
في العقود الأخيرة، وقد تم الاعتراف الميكروبات كما المجتمعات الاجتماعية المرتبطة مختلف النظم الإيكولوجية على الأرض 1،2. وعلى النقيض من الثقافات العوالق المستخدمة في الممارسة المخبرية العامة والجراثيم في البيئة تظهر مجموعة متنوعة من هياكل المجتمع المكانية اعتمادا على الإعداد البيئي. ويمكن استخدام أنظمة الميكروبية بسيطة لفهم ذلك من البنى المكانية على تطور التفاعلات الاجتماعية 3،4. أبرزت المنشورات في السنوات الماضية 2-3 استخدام كلا النظامين نموذج حقيقية النواة وبدائية النواة تأثير البنى المكانية على استقرار التعاون داخل السكان الميكروبية 5-8. بالإضافة إلى ذلك، تلزم التفاعل بين الميكروبات، مثل التمثيل الغذائي عبر الرضاعة، قد تغير أيضا التوزيع المكاني للشركاء التفاعل 9-11. يتم فحص تأثير الهيكل المكاني في هذه الدراسات معظمها باستخدام سطح المرفقة خلايا اطئة تسكن ذلكالأغشية الحيوية -called أو في المستعمرات تنمو على سطح سيلة أجار. الانجراف الوراثي الناتجة عن تشكيلة مكانية عالية ويمكن ملاحظة في المستعمرات الجرثومية حيث نضوب المغذيات في حافة النتائج التوسع انقسام الخلايا بوساطة في سلسلة من الاختناقات الوراثية التي تسبب ارتفاع احتمال تثبيت المحلي لبعض linages نسيلي 12. الانجراف الوراثي يمكن بالتالي استخدامها لدراسة دور الفصل المكاني في المستعمرات الجرثومية.
في البيئة، والأغشية الحيوية هي مجتمعات متعددة الأنواع وتحيط بها الذات المنتجة مصفوفة البوليمرية (13). هيكل بيوفيلم، وظيفة والاستقرار تعتمد على شبكة معقدة من التفاعلات الاجتماعية حيث إشارات الصرف البكتيريا، مكونات المصفوفة والموارد، أو التنافس على الفضاء والمواد الغذائية باستخدام السموم والمضادات الحيوية. العصوية الرقيقة هو التربة مسكن والبكتيريا استعمار الجذر الذي يطور درجة عالية من التنظيم المجتمعات بيوفيلم 14. قياسا لالاجتماعيةالحشرات، B. الخلايا الرقيقة توظيف قسم من استراتيجية العمل وتطوير جزء من السكان المنتجين خارج الخلية المصفوفة وأكلة لحوم البشر، وخلايا متحركة، بكتيريا كامنة وأنواع أخرى من الخلايا 15،16. عملية التمايز هو دينامية، ويمكن تعديلها من قبل الظروف البيئية 17،18.
استراتيجيات الاستعمار السطح بواسطة البكتيريا يمكن التلاعب بها بسهولة تحت ظروف المختبر عن طريق تعديل تركيز أجار في وسائل الإعلام نمو. عند مستويات منخفضة أجار (0.2-0.3٪)، والبكتيريا إيواء سياط نشطة قادرة على السباحة، في حين شبه صلبة أجار (0،7-1٪ أجار) يسهل تنتشر السوط المدفوعة باعتبارات المجتمعات المحلية، ودعا يحتشدون 19-21. في حالة عدم وجود السوط، وبعض سلالات بكتيرية قادرة على نقل أكثر المتوسطة شبه صلبة عن طريق انزلاق، أي النمو والتوسع السكاني يعتمد سهلت مصفوفة exopolysaccharide وغيرها من المركبات hydrophobin يفرز 22-24. وأخيرا، والبكتيريا التي هي capabl(ه) من شكل تطوير بيوفيلم مستعمرات معقدة معماريا على وسط أجار الصلب (1.2-2٪) 14،17،25. في حين يتم فحص هذه الصفات في المختبر عن طريق تعديل على وجه التحديد الظروف، في الموائل الطبيعية هذه الاستراتيجيات الانتشار السطح قد عبور تدريجيا من واحدة إلى أخرى تبعا للظروف البيئية 26. بينما واحدة حركية على الخلايا أمر بالغ الأهمية خلال الشروع في تطوير بيوفيلم في واجهة الهواء السائل في البكتيريا إيجابية الجرام على حد سواء و-سلبية 27، الأغشية الحيوية مستعمرة معقدة من B. لا تتأثر الرقيقة بالحذف من سوطي الحركة 28. ومع ذلك، التنظيم المكاني خلال تطوير B. الرقيقة الأغشية الحيوية مستعمرة تعتمد على كثافة من اللقاح البكتيري يستخدم لبدء بيوفيلم 8.
هنا، ونحن نستخدم B. الرقيقة لإظهار أن الفصل المكاني أثناء الاستعمار سطح يعتمد على آلية motili مستوى السكانتاي (أي يحتشدون أو الانزلاق)، والتنمية مستعمرة بيوفيلم يعتمد على كثافة الخلية مؤسس. نقدم أداة المجهر الفلورسنت التي يمكن تطبيقها لمراقبة باستمرار نمو الجراثيم بيوفيلم والاستعمار السطحية ومتنوعة على المستوى الكلي. وعلاوة على ذلك، يتم تقديم وسيلة القياس الكمي لتحديد وفرة سلالة النسبية في عدد السكان.
Protocol
Representative Results
Discussion
توافر الأدوات الفلورية للبكتيريا يسهل ليس فقط دراسة التعبير الجيني غير متجانس 30،31 والبروتين توطين 32، ولكن أيضا لتحليل التوزيع المكاني للسلالات داخل الكتلة السكانية 8. علامات الفلورسنت مع مختلف بما فيه الكفاية الإثارة وانبعاث موجات تسمح لتوطين بوضوح سلالتين التي لا يمكن تمييزها إلا من بعضها البعض عندما مختلطة. بروتوكول صفها ويمكن استخدام لمراقبة ديناميات السكان في ثقافات متباينة، على سبيل المثال تجارب المنافسة أو التآزر بين السلالات أو الأنواع. لا يقتصر القدرة على تحديد فرة نسبية وصفت من fluorescently سلالات في يقطنها خليط سكاني على السطح يحتشدون المرفقة، انزلاق، أو المستعمرات بيوفيلم، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لأنظمة بيوفيلم متعددة الخلايا الأخرى، بما في ذلك المغمورة، وتدفق خلية أو الهواء المتوسط واجهة الأغشية الحيوية 27،33-35.
_content "> في حين أن التقنية التي جرى طرحها هي أداة قوية للكشف عن التوزيع المكاني للسلالات والتجارب مسابقة التصميم، كما أنه يسمح التالية التجانس التعبير الجيني في مستعمرات في التوسع. تنطبق الشروط زراعة وصفها هنا ل B. الرقيقة والمعلمات الدقيق للتوسع في أجار قد تتطلب وسائل الإعلام الأمثل للأنواع أو سلالات 20 أخرى. وضع العينات في غرفة الحضانة في حين يسمح التصوير المجرب لمتابعة ديناميات السكان في الوقت المناسب، على الرغم من أن وينبغي إيلاء الاهتمام لمستوى الرطوبة داخل الغرفة أثناء الحضانة.تتطلب تقنيات وصفها هنا أيضا التعديل الوراثي للسلالات بكتيرية فحص بحيث سلالات تعبر عن علامات الفلورسنت التي يمكن تمييزها عن بعضها البعض. وعلاوة على ذلك، بالاضافة الى وجود الإثارة متميزة والأطياف الانبعاثات، فمن المستحسن أن اثنين من علامات الفلورسنت اختار لها ضليع في الرياضيات مماثلةغلة أم (أي نسبة من الفوتونات تمتص التي تنبعث) ويتم التعبير في مستوى مماثل. وبالإضافة إلى ذلك، والتغيرات الكثافة النسبية في وقت يمكن قياسها وتطبيع إلى وقت نقطة في وقت مبكر من تجربة. الزيادة أو الانخفاض النسبي يمكن بعد ذلك مقارنة بين fluorophores مختلفة مع كفاءات الكم مختلفة. وبالنسبة للنظام التجريبي المقدمة، تم اختبار مختلف البروتينات الأخضر- وأحمر فلوري سابقا 36،37 لاختيار لأزواج الفلورسنت المثلى التي يمكن الكشف عنها في B. الرقيقة. ينبغي تحديد وقت التعرض الأمثل لكل بروتين فلوري وعينة. قد تكون هناك حاجة الكثافة خلية معينة أو طبقات متعددة من الخلايا للكشف عن إشارة بكفاءة بين السكان. قد يكون بعض البروتينات الفلورية كثافة منخفضة في الخلايا البكتيرية بسبب التعبير غير فعالة و / أو الترجمة من البروتين، وبالتالي انخفاض العائد الكم. هذه علامات الفلورسنت غير فعالة يمكن صاستخرج حساسية النظام وتمديد الوقت اللازم للكشف عن سلالات بكتيرية وربما أدى إلى السمية الخلوية التي كتبها ضوء الإثارة. شدة الفلورسنت يمكن وفقا لذلك تعديل عن طريق تغيير المروج تستخدم للتعبير عن مراسل ترميز الجين الفلورسنت. مستوى التعبير التي هي مرتفعة جدا يمكن أن يؤدي إلى الإفراط في الإنتاج غير الضروري من البروتين الفلوري مما يؤدي إلى تكاليف اللياقة البدنية الضارة للبكتيريا. عند إجراء التجارب المنافسة، ينبغي للمرء النظر في تكلفة معين إنتاج بروتين فلوري في الخلايا. تجارب السيطرة، حيث يتم تبديل علامات الفلورسنت بين سلالات تنافس أو حيث تنافس اثنين من سلالات إسوي تختلف فقط في علامات من الفلورسنت ضد بعضها البعض، هناك حاجة دائما لتحديد أي انحياز علامة واحدة. وعمر من البروتينات الفلورية داخل الخلايا قد تؤثر أيضا على كثافة يقاس. بالإضافة إلى ذلك، تألق ذاتي من بعض مسكوكة البكتيريةالصورة قد تتطلب استخدام علامات الفلورسنت مختلفة أخرى من وصفها هنا.
لتحديد بالضبط التوزيعات وفرة المكانية من السلالات البكتيرية واضحة، وإشارة الخلفية التي تنشأ من أول بروتين فلوري أثناء استخدام فلتر مضان للعلامة فلوري الثانية والعكس بالعكس ينبغي اختبار فردي على عينات الأحادية (التي تحتوي على البكتيريا المنتجة فقط علامة واحدة ). وهذا يسمح للالطرح تداخل شدة إشارة الفلورسنت. الأهم من ذلك، كما يسجل مجهر تشريحي إشارة مضان من فوق مستعمرة التوسع، وبروتوكول المعروضة مريحة لتحديد الترتيب المكاني في بعدين. العمارة من السكان البكتيرية توسيع يمكن أن يؤدي إلى تفاوت مستويات مضان (قد تحتوي على هياكل أي مثل تجعد أكثر من الخلايا التي تظهر أعلى كثافة مضان المحلية). ولذلك، فإن تحليل ووصف الصور دetermines التوزيع المكاني، ولكن ليس وفرة من السلالات داخل موقع معين. ووصفت البروتوكولات السابقة إعداد نموذج ليحتشدون 20 أو التصوير مضان من ديناميات السكان في المستعمرات البكتيرية 38، ولكن لدينا بروتوكول يجمع بين هذه التقنيات. تقنيات المجهر الأخرى التي تسمح للمراقبة من ثلاثة قرار الابعاد من التركيبة السكانية (مثل ليزر متحد البؤر المجهر 39،40 أو منظم إضاءة المجهر 41) يمكن تطبيقها للحصول على عينات مع زيادة التعقيدات الهيكلية. هذه التقنيات إضافية تدعم أيضا الكشف عن خلية واحدة على أساس من سلالات 31 غير متوفرة باستخدام المجسمة.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل منحة KO4741 / 3-1 من جمعية الألمانية للبحوث (DFG). وعلاوة على ذلك، تم دعم مختبر Á.TK من قبل ماري سكلودوفسكا كوري التكامل الوظيفي منحة (PheHetBacBiofilm) وتمنح KO4741 / 2-1 من DFG. TH، AD، RG-M.، وكانت مدعومة من قبل EM المدرسة الدولية ماكس بلانك للأبحاث، الكسندر فون همبولت الأساس، المجلس الوطني لCiencia بحوث والتكنولوجيا الألمانية للتبادل الأكاديمي (CONACYT-DAAD)، والزمالات JSMC، على التوالي.
Materials
| Lennox Broth (LB) | Carl Roth GmbH | X964 | |
| Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH | 5210 | |
| Petri dish (90 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Petri dish (35 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Difco Nutrient Broth | BD Europe | 234000 | |
| KCl | any | NA | |
| MgSO4 7H2O | any | NA | |
| Ca(NO3)2 4H2O | any | NA | |
| MnCl24H2O | any | NA | |
| FeSO4 | any | NA | |
| D-Glucose | any | NA | |
| Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | see bellow detailed description | |
| AxioZoom V16 Microscope body | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435080 9030 000 | |
| Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9020 000 | without eyepieces |
| Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9060 000 | |
| Controller EMS 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435610 9010 000 | |
| System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435611 9010 000 | |
| Reflector module Z | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9160 000 | For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3 |
| Filter set 38 HE eGFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489038 9901 000 | EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 |
| Filter set 63 HE mRFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489063 0000 000 | EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62 |
| Mount S | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435402 0000 000 | |
| Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114mm | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435280 9050 000 | 164mm parfocal length; M62x0.75 thread at front |
| Coarse/fine drive with profile column | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435400 0000 000 | 490 mm, 10kg load capacity, compatible with stand bases 300/450 |
| Stand base 450 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435430 9902 000 | |
| Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435700 9000 000 | |
| CAN-bus cable | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 457411 9011 000 | 2.5 m length |
| Slit-ring illuminator | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417075 9010 000 | d=66 mm |
| Flexible light guide 1500 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417063 9901 000 | 8/1000 mm |
| Illumination Adapter for light guide | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 1370 927 | |
| Lightguide HXP with liquid fill | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 0482 760 | ø3mm x 2000mm |
| Camera Adapter 60N-C | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426113 0000 000 | 2/3" 0.63x |
| High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426509 9901 000 | |
| AxioCam FireWire Trigger Cable Set | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426506 0002 000 | for direct shutter synchronization |
| ZEN pro 2012 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410135 1002 120 | Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit |
| ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410136 1031 110 | |
| Standard Heating Stage Top Incubator | Tokai Hit | INUL-MS1-F1 | |
| Zeiss Stereo Microscope Base Adapter | Tokai Hit | MS-V12 | |
| Softwares | |||
| Image J | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | v 1.49m | |
| BioVoxxel plugin | BioVoxxel | http://www.biovoxxel.de/development/ |
References
- Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).
- West, S. A., Griffin, A. S., Gardner, A., Diggle, S. P. Social evolution theory for microorganisms. Nat Rev Microbiol. 4 (8), 597-607 (2006).
- Kovács, &. #. 1. 9. 3. ;. T. Impact of spatial distribution on the development of mutualism in microbes. Front Microbiol. 5, 649 (2014).
- Martin, M., Hölscher, T., Dragoš, A., Cooper, V. S., Kovács, &. #. 1. 9. 3. ;. T. Laboratory evolution of microbial interactions in bacterial biofilms. J Bacteriol. , (2016).
- Drescher, K., Nadell, C. D., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Solutions to the public goods dilemma in bacterial biofilms. Curr Biol. 24 (1), 50-55 (2014).
- Momeni, B., Waite, A. J., Shou, W. Spatial self-organization favors heterotypic cooperation over cheating. Elife. 2, e00960 (2013).
- van Dyken, J. D., Müller, M. J., Mack, K. M., Desai, M. M. Spatial population expansion promotes the evolution of cooperation in an experimental Prisoner’s Dilemma. Curr Biol. 23 (10), 919-923 (2013).
- van Gestel, J., Weissing, F. J., Kuipers, O. P., Kovács, &. #. 1. 9. 3. ;. T. Density of founder cells affects spatial pattern formation and cooperation in Bacillus subtilis biofilms. ISME J. 8 (10), 2069-2079 (2014).
- Momeni, B., Brileya, K. A., Fields, M. W., Shou, W. Strong inter-population cooperation leads to partner intermixing in microbial communities. Elife. 2, e00230 (2013).
- Müller, M. J., Neugeboren, B. I., Nelson, D. R., Murray, A. W. Genetic drift opposes mutualism during spatial population expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (3), 1037-1042 (2014).
- Pande, S., et al. Privatization of cooperative benefits stabilizes mutualistic cross-feeding interactions in spatially structured environments. ISME J. 10, 1413-1423 (2016).
- Hallatschek, O., Hersen, P., Ramanathan, S., Nelson, D. R. Genetic drift at expanding frontiers promotes gene segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (50), 19926-19930 (2007).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 157-168 (2013).
- Lopez, D., Kolter, R. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 34 (2), 134-149 (2010).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 152-163 (2009).
- Mhatre, E., Monterrosa, R. G., Kovács, &. #. 1. 9. 3. ;. T. From environmental signals to regulators: Modulation of biofilm development in Gram-positive bacteria. J Basic Microbiol. , (2014).
- Zhang, W., et al. Nutrient depletion in Bacillus subtilis biofilms triggers matrix production. New J Physics. 16, 015028 (2014).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. J Vis Exp. (98), (2015).
- Angelini, T. E., Roper, M., Kolter, R., Weitz, D. A., Brenner, M. P. Bacillus subtilis spreads by surfing on waves of surfactant. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (43), 18109-18113 (2009).
- Grau, R. R., et al. A Duo of Potassium-Responsive Histidine Kinases Govern the Multicellular Destiny of Bacillus subtilis. MBio. 6 (4), e00581 (2015).
- Park, S. Y., Pontes, M. H., Groisman, E. A. Flagella-independent surface motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1850-1855 (2015).
- van Gestel, J., Vlamakis, H., Kolter, R. From cell differentiation to cell collectives: Bacillus subtilis uses division of labor to migrate. PLoS Biol. 13 (4), e1002141 (2015).
- Abee, T., Kovács, &. #. 1. 9. 3. ;. T., Kuipers, O. P., van der Veen, S. Biofilm formation and dispersal in Gram-positive bacteria. Curr Opin Biotechnol. 22 (2), 172-179 (2011).
- Kovács, &. #. 1. 9. 3. ;. T. Bacterial differentiation via gradual activation of global regulators. Curr Genet. 62 (1), 125-128 (2016).
- Hölscher, T., et al. Motility, chemotaxis and aerotaxis contribute to competitiveness during bacterial pellicle biofilm development. J Mol Biol. 427 (23), 3695-3708 (2015).
- Seminara, A., et al. Osmotic spreading of Bacillus subtilis biofilms driven by an extracellular matrix. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1116-1121 (2012).
- Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis do not exhibit swarming motility. J Bacteriol. 191 (22), 7129-7133 (2009).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), e3145 (2011).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. (60), (2012).
- Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
- Barken, K. B., et al. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10 (9), 2331-2343 (2008).
- Oliveira, N. M., et al. Biofilm formation as a response to ecological competition. PLoS Biol. 13 (7), e1002191 (2015).
- Wang, X., et al. Probing phenotypic growth in expanding Bacillus subtilis biofilms. Appl Microbiol Biotechnol. 100, 4607-4615 (2016).
- Detert Oude Weme, R. G., et al. Single cell FRET analysis for the identification of optimal FRET-pairs in Bacillus subtilis using a prototype MEM-FLIM system. PLoS One. 10 (4), e0123239 (2015).
- Overkamp, W., et al. Benchmarking various green fluorescent protein variants in Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, and Lactococcus lactis for live cell imaging. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6481-6490 (2013).
- Stannek, L., Egelkamp, R., Gunka, K., Commichau, F. M. Monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains. J Vis Exp. (83), e51196 (2014).
- Bridier, A., Briandet, R. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).
- Khajotia, S. S., Smart, K. H., Pilula, M., Thompson, D. M. Concurrent quantification of cellular and extracellular components of biofilms. J Vis Exp. (82), e50639 (2013).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
