混合リジン型/アルギニン型モノマーおよびそれらの抗リーシュマニア活性の評価とペプトイドの合成のための効率的な方法

ペプトイドの1固相合成注：ペプトイドを手動固相ペプトイド合成のサブモノマーの手順を用いて合成されます。この方法は、高い結合効率と優れた最終製品収率を可能にします。固相上での合成はまた、過剰な反応物は、各ステップの終わりに容易に除去することができ、この方法は、異なる官能カチオン性モノマー（ すなわち、アルギニン型及びリジン型残基）は、同じ内に含まれることを可能にするためにここで変更されていますシーケンス。1,2 リニアペプトイドの合成 注意：合成を開始する前に、安全性評価を実施します。ヒュームフード内のすべての反応を実施し、適切な（ すなわち 、使い捨てニトリル手袋、安全メガネと白衣）として適切な個人用保護具を着用します。以下に示す試薬、溶媒を使用する際に特に注意してください。ジメチルホルムアミド（DMF）が疑われる催奇形物質およびdですichloromethane（DCM）が発がん性物質。N、N N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）およびピペリジンである呼吸吸入を介して、皮膚、目に有害であり、皮膚感作を引き起こすことがあります。ヒドラジンは吸入すると、致命的な疑いのある発癌物質であり、皮膚や目に重度のやけどを引き起こします。ブロモ酢酸はまた、皮膚、眼、気道に有害であるとの接触時にやけどを引き起こす可能性があります。トリフルオロ酢酸（TFA）は、揮発性の液体であり、重度の火傷は非常に注意して扱う引き起こす可能性があります。ヘビーデューティー手袋を推奨します。 2フリットでキャップ20ミリリットルポリプロピレン反応容器に0.12グラムFmoc-保護リンクアミド樹脂（0.1ミリモル、典型的なロード0.7ミリモル/ g）を追加します。樹脂を膨潤させ、室温で少なくとも60分間放置し、血管を残すために5ミリリットルのジメチルホルムアミド（DMF）を追加します。固相抽出真空プラットフォームを使用してDMFをドレイン。 膨潤した樹脂のFmoc基を脱保護するために、（DMF v / vで20％）2mLのピペリジンの溶液を加えます。上の容器を置きます室温（450 rpm）でシェーカープラットフォームと5分間振とうします。真空ステーションを経由してソリューションを削除します。 2mLのピペリジン溶液でFmoc脱保護を繰り返し、室温で15分間振とうします。以前のように解決策を排出します。 2ミリリットルのDMFを添加し、30秒間樹脂を混合して樹脂を洗浄。 DMFを排出し、さらに3回繰り返します。 アセチル化のために、ブロモ酢酸溶液（DMF中0.6 M）を1 mlを加え0.2 mlのN、N N'-ジイソプロピルカルボジイミド溶液（DIC、50％DMF中のv / v）でした。室温で20分間振って反応容器のままにしておきます。解決策を排出し、2ミリリットルのDMF 3回樹脂を洗浄。 変位のために、アミン溶液1ml（DMF中1.5 M）を加えます。室温で60分間樹脂を振ります。解決策を排出し、2ミリリットルのDMF 3回樹脂を洗浄。 アルギニン型モノマーを追加するには、ステップ1.7に従ってください。希望ペプトイドの配列に応じて、異なるアミン追加されます。 繰り返しは、1.1.4と1.1.5を繰り返します。 グアニジン官能モノマー（ すなわち 、NのArg）を含めるには、樹脂に保護されていないジアミン溶液（DMF中1.5 M）の1ミリリットルを追加し、室温で60分間振とうします。 解決策を排出し、2ミリリットルのDMF 3回樹脂を洗浄。 無料の第一級アミンへのDDEグループを追加し、室温で60分間振とうする2-acetyldimedone（0.2グラム、0.5ミリリットルのDMF中の1ミリモル、10当量）を追加します。解決策を排出し、2ミリリットルのDMF 3回樹脂を洗浄。 所望の配列がなされるまで、1.1.7に1.1.4のようにサブモノマー合成を続けます。樹脂を洗浄し、3回繰り返して2ミリリットルのDMFを追加します。 樹脂上のDDE基を脱保護するために、（DMFのV IN / V）4を2mlの％ヒドラジン溶液を加え、室温で3分間振とうします。解決策を排出し、3回繰り返します。 解決策を排出し、2ミリリットルのDMF 3トンで樹脂を洗浄IME。 （DMFの最小体積で、NのArgモノマーあたりの遊離アミンあたり6当量、 すなわち 、）ピラゾール-1-カルボキサミジンを追加して、N、N-ジイソプロピルエチルアミンまたはDIPEA（遊離アミンあたり6当量）と60分間室温で振ります。 解決策を排出し、2ミリリットルのジクロロメタン3回樹脂を洗浄。その後、樹脂を切断（セクション2）まで保存することができる10分間空気中で乾燥する樹脂を残します。 合成を一時停止するには、2ミリリットルのDMF 3回樹脂を洗浄。 2ミリリットルのDMFを追加し、合成容器の栓とヒュームフード中で室温で残します。 注：合成（ジケトピペラジンのような第2変位ステップが形成されていてもよい除く）任意の変位ステップの後に一時停止することができます。 側鎖脱保護および樹脂からの切断 displa後、合成中の任意の時点で合成（純度および質量）の進行状況を確認するためのテストを切断を行いますセメント工程、付加またはDDE保護基のまたは最後の配列がなされた後に除去します。 新しい8ミリリットルのポリプロピレンのフリットカートリッジに反応容器から約10樹脂ビーズを転送します。 トリフルオロ酢酸の切断カクテルを1ml加える（95％TFA、2.5％H 2 O、2.5％のトリイソプロピルシランを含有する）を、室温で90分間振とうします。 丸底フラスコ10ミリリットルにフリットの反応容器を用いて樹脂からTFA切断カクテルをフィルタリングします。 ロータリーエバポレーターを用いて切断カクテルを蒸発させ、LC-MSまたはHPLC分析に提出1mlのアセトニトリル/水で得られた油状物を再溶解。 最終的な切断のために：合成に用いたのと同じフリット化ポリプロピレンの反応カートリッジに、TFA開裂カクテル（95％TFA、2.5％H 2 O、2.5％トリイソプロピルシラン）4 mlを加え、容器を覆います。室温で90分間振とうします。 フィルターの目丸底フラスコ50 mlの中にフリットの反応容器を用いて樹脂から電子TFA切断カクテル。 ロータリーエバポレーターを用いて切断カクテルを蒸発させます。 TFAを除去した後、生成物を油状物として得られるべきです。この原油からTFAの除去を支援するために、2ミリリットルの無水ジエチルエーテルを追加し、ペプトイドが沈殿する必要があります。 いずれかのピペットを用いて、ジエチルエーテルを除去し、廃棄するか、ロータリーエバポレーターを用いて蒸発させます。反復ジエチルエーテル沈殿三回。 （V / Vの水、50％アセトニトリル、0.1％TFA）アセトニトリル10ml /酸性水溶液中の粗ペプトイドを溶かします。 、予め秤量した容器に移し、20℃で凍結乾燥粉末に凍結乾燥。 2.キャラクタリゼーションおよび精製注：ペプトイド合成をモニターすることができ、最終的なペプトイドは、C18カラム及びELを用いた分析用逆相HPLCによって評価しますectrospray液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）。 LC-MSのための溶媒のすべてのHPLC溶媒を新たに準備する必要があります。 分析HPLC 小さなガラスバイアルにペプトイド1mgを秤量します。溶解し、水で1mlに希釈し、アセトニトリルの最小容量を追加します。ペプトイドが完全に溶解していることを確認してください。 分析用HPLCに10μLを注入する（推奨傾斜0 – 溶媒A = 95％水、5％アセトニトリル、0.05％TFAおよび溶媒B = 95％アセトニトリル、5％水、0.03％TFA、30分にわたって100％の溶媒B）当たり製造元の指示として。 220 nmのUVスペクトルを可視化します。 ESI LC-MS ステップ2.1.1のように1mg / mlのペプトイドソリューションとなります。 製造者の指示に従って使用して、ターゲットペプトイドの分子量が存在するかどうかを決定するためにLC-MSをエレクトロために1μLを注入します。 PEPTを使用して、ペプトイド配列の標的質量をチェック電卓上の指示に従ってOID電卓、。26このWebユーティリティはまた、質量スペクトルに見られる任意の削除/追加の製品の割り当てを可能にする。26 分取逆相HPLC 酸性水2ml /アセトニトリル（95％水、5％のMeCN、0.1％TFA）中の粗ペプトイドを溶解し、製造業者のプロトコルを使用して分取RP-HPLCにより精製します。分析用HPLCおよびカラムの寸法に依存する注入量から得られた溶出時間によって勾配を決定します。 220 nmに設定し、検出器を使用して視覚化します。 15mlの遠心管中で画分を収集し、20℃および凍結乾燥で凍結。 製造業者のプロトコルに従ってLC-MSおよび分析用HPLCを用いて分画を再分析します。精製画分を再結合します。 リーシュマニアメキシカーナ寄生虫に対する3.生物学的試験コーン：。安全性の評価は、合成を開始する前に行わなければならないメキシコリーシュマニアは、英国と適切な対策で危険グループ2病原体が所定の位置にテストを開始する前でなければならない分類されています。すべての作業は、クラス2微生物学的安全キャビネットと適切な（ すなわち、ニトリル手袋、安全メガネと白衣）として着用適切な個人用保護具で行わなければなりません。 寄生虫のサブカルチャー 30秒間37℃の水浴中にバイアルを配置することによって、1ミリリットル-150°C凍結ストックリーシュマニアメキシカーナ M379を解凍。 非通気キャップ25 cm 3の細胞培養フラスコ（15％熱不活化ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したpH7.0で）を10 mlのシュナイダー昆虫培地にストック溶液を移します。 72時間26℃でインキュベートします。 状態を確認するために顕微鏡下で寄生虫（400X倍率）を調べます。目EYは、昆虫ステージプロマスチゴート、多くの分裂細胞で対数期のprocyclic形でなければなりません。 5×10 5寄生虫/ mlの3日ごとの濃度に継代培養寄生虫によってprocyclicプロマスチゴートを維持します。ノイバウアー改善された血球計数器を用いて細胞数を計測します。 L.の形質転換哺乳動物のステージへmexicanaの昆虫段階無菌無鞭毛フォーム27 0日25 cm 3の細胞（15％熱不活化ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したpH7.0で）シュナイダー昆虫培地中で5×10 5寄生虫/ mlで対数期寄生虫10mlの培養物を調製します非通気型キャップ付き培養フラスコ。 48時間26℃でインキュベートします。 3日目：5分間447×gで50ミリリットルの遠心分離管と遠心分離機に移し10ミリリットル文化。 古い培地を捨て、10mlのシュナイダーの昆虫培地を追加（pH5.5で20％の時間を補っ食べる不活化ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。静かにピペットを使用して、新しい培地中で寄生虫のペレットを再懸濁します。 ノイバウアー改善された血球計数器を用いて、寄生虫の数をカウントします。 pH5.5の培地及び25 cm 3の細胞培養フラスコに移し、5×10 5寄生虫/ mlの濃度に希釈します。 約6日間、26℃でインキュベートします。 9日目：顕微鏡（400X）の下で寄生虫を調べます。彼らは、非複製、感染metacyclic前鞭毛の段階であるべきです。 ノイバウアー改善された血球計数器を用いて、寄生虫の数をカウントします。 pH5.5の培地で5×10 5寄生虫/ mlの濃度に希釈します。 細胞培養液の10ミリリットルを削除して、細胞培養フラスコに移します。 5日間32℃でインキュベートします。 14日目：顕微鏡（400X）の下で寄生虫の外観を確認してください。彼らは、鞭毛の文字を欠いている、病原性の無鞭毛の段階であるべきです前鞭毛期のISTIC、およびアッセイのための準備ができました。 L.上の細胞毒性アッセイメキシカーナ無菌無鞭毛型。 注：ペプトイドの生物学的試験は、96ウェルプレート中で行わハイスループットアッセイを使用します。このプロトコルは、Lのテストを記述しますメキシカーナ無菌無鞭毛型が、同一のアッセイは、適切な培地中で前鞭毛期寄生虫に行うことができます。 60分間100μM、その後10倍希釈後24時間インキュベート – 化合物3の濃度で寄生虫とインキュベートします。結果は、レサズリンベースの細胞生存溶液（ 例えば 、アラマーブルー）とのインキュベーション後、ウェルの蛍光を測定することにより得ています。 化合物のストック溶液を準備します。化学天秤を使用して、最終的な精製されたペプトイド製品1mgを秤量。 5 mMの濃度に分子生物学グレードのジメチルスルホキシド（DMSO）の適切な量を追加します。 6μlのアリコートを作成し、-20℃で凍結します。 100から3μMに三連で96ウェルプレート（推奨プレートレイアウトは、結果セクションに見ることができる。図6）の化合物の溶液を調製します。一番上の行（ すなわち、A）中の各化合物の5 mMのストック溶液2μLを加えます。マルチチャンネルピペットを使用して、一番上の行に48μlの新鮮なシュナイダー昆虫培地（pH5.5で、20％ウシ胎児血清（FBS）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S））を加えます。他のすべての行（ – F B）に25μlのシュナイダーの昆虫培地を追加します。 一番上の行からの25μlの液をピペットで連続希釈を行います。下の行に加え、混合します。最後の25μlの溶液は廃棄すべき最後の行までの希釈を行います。 三重での陰性対照として、陽性対照及びDMSO（2％溶液）としてアムホテリシンB（5 mMのストック）を使用します。 転送50ミリリットルの遠心分離管に文化や遠心分離機で：寄生虫液を調製5分間、447×gで。古い培地を捨て、10mlのシュナイダーの昆虫培地（pHは5.5と20％でFBS、1％P / S）を追加します。 静かにピペットを使用して、新しい培地中の寄生虫のペレットを溶解し、ノイバウアー改善された血球計数器を使用してカウントされます。 8×10 6寄生虫/ mlに文化を希釈します。 25μlのL.を追加各ウェルにmexicanaの文化 。 32℃で60分間プレートをインキュベートします。 インキュベーターからプレートを取り外し、各ウェルから40μlの溶液を除去。 90μlの新鮮な培地を加え、32℃で24時間インキュベートします。 各ウェルに10μlのレサズリンベースの細胞生存率溶液を加えます。 32℃で4時間インキュベートします。 製造元の指示に従って、（λEMが 600nmのを=、λの元 = 540 nm）をプレートリーダーを用いて蛍光を測定します。 （媒体からのみのウェル）の平均バックグラウンドを除去し、tに対する正規化した後、ウェルの蛍光を比較することによりデータを分析彼はコントロールをDMSO。