단백질의 품질 관리 시스템을 공부<em> D. discoideum</em> 온도 제어 라이브 셀 이미징을 사용하여
Summary
The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
Abstract
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Introduction
Dictyostelium의 discoideum은 식균 작용에 의해 촬영 박테리아 및 기타 미생물에 먹이 독방 토양 생활 아메바입니다. 그것은 그것의 발견 1 일 이후 연구의 주요 영역을했습니다 독특하고 놀라운 수명주기를 가지고있다. 다세포 개발 2과 화성 3의 분자 기준에 초기 관심은 곧 세포 운동성, 세포 극성, 선천성 면역에 초점을 맞춘 연구에 의해 보완되었다. 또한, D. discoideum는 생물 의학 연구 4,5를위한 모델 시스템으로 도입되었다.
최근에, 우리는 D. 설립 discoideum 단백질 품질 관리 (PQC) -6,7- 시스템을 연구하기위한 새로운 시스템이있다. 그 프로테옴 단백질 품질 관리 8에 도전을 제기 응집 경향 프리온과 같은 단백질이 풍부한된다. D. 여부를 조사하려면 discoideum은 매우 AG를 제어하는 특별한 분자 메커니즘을 개발했다회중하기 쉬운 프로테옴 우리는 정상적인 성장 조건 하에서 스트레스 동안 모두 응집 경향 마커 단백질의 거동을 연구 하였다. 이러한 열 응력 등의 응력 조건은, 단백질 미스 폴딩 (9)의 속도를 증가시키기 위해 사용될 수있다. 따라서, 우리는 온도 변화를 유도하고, 동시에 마커 단백질의 동작을 수행 할 수있는 시스템을 찾았다. 이를 위해, 우리는 열 단 삽입 (냉각 실)를 사용하여 펠티에 제어형 가열 라이브 세포 이미징을 조합. 이 방식은 우리가 일정하고 균일 한 온도를 유지하기 위해뿐만 아니라 신속하면서도 정확한 온도 변화를 유도 할 수 있었다.
라이브 세포 이미징 D. 생물학적 다양한 공정을 연구하는 데 사용되는 discoideum. 그러나,이 방법은 두 가지 한계에 직면 해있다. 첫째, 세포 따라서 개별 셀의 추적, 높은 운동성을 표시하고 시야에서 마이그레이션하는 경향이 종종 넓은 지역의 영상을 필요로한다. 세포 이동성 수한천 오버레이 (10)에 의해 감소 될 수 있지만, 이러한 조건으로 인해 생존의 감소로 장기 촬상에는 적합하지 않다. 둘째, D. discoideum 세포는 세포 라운딩과 유사 분열 체포 (11) 결과 사진 독성에 특히 높은 감도를 보여줍니다. 이전 프로토콜은 라디칼 스 캐빈 및 노출 시간 (12)의 감소와 같은 아스 코르 빈산을 첨가하여이 문제를 해결. 관심의 단백질이 낮은 수준으로 발현과 약한 형광 신호를 표시하는 경우 후자는 중요 할 수 있습니다. 저자는 또한 에어컨의 영상 또는 목적 및 현미경 스테이지 (12)을 포함 온도 조절 배양 상자를 사용하여 하나 21 ° C의 온도를 일정하게 제공하는 것이 좋습니다.
여기에서는 23 ℃로 설정된 냉각 실을 사용하여 개선 된 온도 제어 방법을 설명한다. 우리 셋업 촬상 동안 상당히 광 독성에 대한 저항성을 향상시킨다. 이것높은 노출 시간 및 더 높은 여기 광 강도의 사용을 허용한다. 시간 간격은 묘화 위치의 수 및 사용되는 노광 시간에 대한 균형 잡힌해야 이것은, 저속 촬상 중에 특히 중요하다. 결상 위치의 수를 증가시킬 가능성이 넓은 묘화 영역의 범위를 허용하고 더 긴 시간 동안 각 셀의 추적을 용이하게한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜에 열 유도 응력에 응답하여 특정 관심 단백질의 거동을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 30 ° C까지 승온 열 스트레스 반응을 유발하는 것으로보고하고 D. 이러한 조건에서 생존 한 discoideum는 현저하게 감소된다.
수정
프로토콜은 동일한 응력 조건 하에서 다양한 단백질의 거동을 비교하기 위해 수정 될 수있다. 이를 위해, 같은 형광 태그와 다른 단백질을 발현하는 세포가 이러한 네 개의 챔버 접시 (섹션 1.3.1)로 다중 – 웰 접시에 옮기고있다. 프로토콜은 또한 GFP 또는 RFP 같은 다른 마커 단백질과 함께 공동 발현하는 세포에 적용 할 수있다. 이 단백질의 품질 관리 (PQC) 시스템의 다른 구성 요소의 동작을 모니터링하는 데, 예를 들어 수있다. GFP-태그 집계 마커 다른 RFP-태그 PCQ 성분을 발현하는 세포를 다중 웰을 사용하여 관찰 할 수있다이미징 걸려. 이것은 동일한 응력 조건 (온도 증가 / 감소, 온도 증가 / 감소 구간의 속도) 보장 및 비교 연구를 허용한다.
또한, 프로토콜은 열 스트레스 반응에 PQC 시스템의 영향을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 구성 요소의 활성은 이러한 녹아웃 또는 과발현 유전 도구를 사용하여 발현 수준을 변화시킴으로써 또는 시판 특정 억제제 (6)을 이용하여 변조 될 수있다. 프로 테아 좀은 성장 배지로 MG132 (100 μM) 또는 인 lactacystin (10 μM)를 첨가함으로써 억제 할 수있다. 샤프론의 Hsp90는 젤다 나 마이신 (6 μM) 또는 라디 (10 μM)를 사용하여 억제 할 수있다. 우리가 지금까지 우리의 실험 설정에서 억제 효능을 확인하지 수 있지만 보호자 인 Hsp70은 VER-155088으로 억제 할 수있다. 억제제 촬상 하루 전에 첨가되어야하고, 세포를 14 시간 동안 배양 하였다.
Criti 프로토콜 내 칼 단계
열 – 유도 교란의 평가를위한 중요한 단계 촬상 실험 이전의 셀의 상태이다. 효모의 연구는 세포가 정지상 (13) 동안 환경 스트레스의 다양한 저항을 얻을 것으로 나타났다. 우리는 또한 D. 경우 적용 열 스트레스에 최소한의 응답 성을 관찰 discoideum 세포는 이전의 이미지로 고정 단계에 도달했다. 따라서, 일정한 세포 수를 유지 <5 × 105 세포 / ㎖가 중요하다.
또한, 높은 셀 번호 D. 식물의 사이클에서 천이를 유도 할 수있다 따라서 스트레스를 가열하는 다른 반응으로 이어질 수 있습니다 기아 경로를, 트리거, 발달주기에 discoideum. 높은 세포 수는 열 스트레스 스트리밍 후의 회복 단계에 도달하고 전지가 초점 이동 응집 세포 데이터 분석을 방해 할 수있는 경우 (도 4 참조).
콘텐츠 ">는 기술의 한계포커스의 손실은 프로토콜의 병목 현상이다. 온도 변화 동안, 초점면은 즉시 온도를 변경 한 후 시간에 재 집속 설명서를 요구하는 대폭 전환 할 수있다. 포커스의 점프 때때로 시점 사이의 시간이 높고, 특히, 소프트웨어의 오토 포커스에 의해 극복하기에는 너무 극단적 일 수있다. 사용한 현미경 하드웨어 자동 초점이 장착되는 경우,이 병목 현상이 회피 될 수있다.
기존 방법에 대하여 기술의 중요성
이러한 에어컨 방, 목적 및 현미경 스테이지 또는 온도 제어 단계와 대물 옷깃을 덮는 온도 제어 배양 상자의 사용과 같은 기존의 셋업에 비하여, 냉각 실의 사용은 주위의보다 정확한 제어를 제공한다 온도. 냉각 실의 펠티에 소자는 일정하고 균일 한 템을 유지할 수 있습니다실험 설정을 통해 가능한 온도. 고전적인 설정에서, 지역의 온도 차이는 서로 다른 관측 결과로 이어질 수 있습니다. 고전 셋업 특히 강온 유도 온도 변화에 매우 느리게 적응하면서 또한, 온도에 의한 변화에 신속하고 빠르게 응답 할 수있다. 냉각 실의 펠티에 소자는 또한 15 ° C, 40 ° C로서 도달 온도가 매우 어렵다되는 고전 설정보다 더 넓은 온도 범위 (15 ~ 40 °의 C)을 커버 할 수있다.
Dictyostelium의 discoideum은 사진 독성에 특히 민감하다. 이전의 연구는 광 독성을 감소 소제로서 아스코르브 산을 사용했다. 그러나, 긴 촬영 기간이 추가 보완이 필요합니다. 또, 아스코르브 산의 사용이 주목기구는 항산화 보조 식품에 의해 영향을받지 않는다 연구에 제한된다. 우리는 온도 제어 이미징 appr 대안으로 사용될 수 제안oach는 광 독성을 최소화하고 더 독성을 감소 아스코르브 산의 첨가와 조합 될 수있다.
광독성 효과는 냉각 실을 사용하여 23 ° C의 일정하고 균일 한 온도를 제공함으로써 최소화 될 수있다. 온도 조절 장치를 이용하여 묘화 셀들은 긴 시간 동안 광 독성, 휴대 라운딩 적은 징후를 나타낸다. 이것은 또한 높은 강도, 작은 시간 간격 또는 뷰 (영상 범위)의 더 필드 이미징을 할 수 있습니다.
일반 응용 프로그램
고온에서 열 스트레스가 다른 열 스트레스 반응 (14)을 트리거하기 위해 도시되었다. 따라서, 34 ℃ 이상 37 ℃로 온도를 증가시키는 것은 다른 반응을 유도 할 수있다. 적용된 온도 응력에 더하여, 특정 응력 상태의 지속 기간은 열 응력 즉각적인 응답 또는 장기 적응 학습하도록 변형 될 수있다.
일반적으로, 설명 된 프로토콜이 될 수있다응용 프로그램의 다양한 세트로 확대했다. 정확한 온도 제어는 상당히 광 독성을 감소시키기 때문에, 프로토콜은, 또는 짧은 시간 간격과 함께 낮은 발현 수준으로 단백질을 가시화 등 높은 노출 시간 및 / 또는 더 높은 여기 광 강도를 요구 설정에 사용될 수있다 시간 경과 이미징 동안 이미징, 예를 들어, 사이. 또한 전체 셀에 걸쳐 물체를 이미징하는 것이 유리할 수있다, 예를 들어, 미세 소관, 이러한 설정은 광학 Z 섹션 높은 번호를 필요로.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no Acknowledgements.
Materials
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
References
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