ストレス植物から単離された葉緑体へのタンパク質のインポートの分析

1.シロイヌナズナ植物の成長とストレス処理 MS基礎塩混合物4.3グラム添加することによって、1ムラシゲのL及びスクーグ（MS）培地を調製し、10gのスクロース0.5 gで2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）1 Lの純水まで、および調整水酸化カリウム（KOH）で5.7のpH。 120℃で20分間phytoagar、オートクレーブの6グラムを追加します。 固化する前に、（ – プレートあたり25 mLのMS培地20と直径9センチメートル、高さ1.5センチメートル、）ラウンドペトリ皿に培地を注ぎます。プレートは蓋を閉じる前に、層流フード中〜1時間乾燥することができます。 70％の1mLの0.02％（v / v）のトリトンX-100を含有し、連続して5〜10分間振盪（v / v）エタノールを添加することによって表面滅菌1.5 mLの試験管にシロイヌナズナの種子を置きます。 150本の苗木 – 各遺伝子型/条件については、10ペトリ皿ごと運ぶ〜100を準備します。 種子がに落ち着くまで、約10秒間待ってくださいチューブの底、その後、ピペッティングにより上清を捨てます。 100％エタノール1 mLを加え、10分間再びチューブを振ります。 種子は殺菌されている間、層流フードを準備します。 、サンプルあたりろ紙一枚を取る播種を容易にするために、半分に折り、そしてフード100％エタノール中に浸します。それが完全に乾くまで待ってください。それは、より迅速に、70％エタノールより蒸発するように100％エタノールを使用することに留意されたいです。 細かい端から〜5ミリメートル1 mLのピペットチップカットを使用してピペットで濾紙上に種子を転送します。 15分 – 約10を取るべきである、それらを乾燥することができます。 各MS培地ペトリ皿上に均等に150殺菌した種子、および外科テープで各プレートをシール – 〜100をまきます。 奨励し、発芽を同期させるために4日間 – 逆さま2用の4℃でプレートを保管してください。古い種子を4℃で（週まで）長く滞在する必要があるかもしれません。 植物組織培養室にプレートを移し、逆さまアップそれらを残します。20℃で長い日サイクルで8 D（1、光、8時間暗- – 2・sで16時間100マイクロモル・メートル）のために植物を育てます。 植物が流フード中で、8日齢であるストレス処理については、優しくストレッサーを含む液体MS培地の滅菌フラスコに、エタノール滅菌手袋を着用して手でそれらを掻き落とし、寒天培地からそれらを転送する（ 例えば 、 、200mMのマンニトール）。寒天培地の上に運ぶことは避けてください。滅菌ホイルでフラスコの口を覆い、植物が穏やかに振盪（〜100 rpm）ででオービタルシェーカーでさらに2日間の工程1.8と同様の条件で成長することができます。 2. in vitro転写/翻訳により前駆体タンパク質を作ります注：このプロトコルは、私は、テンプレート/プレタンパク質としてD前駆体（pPsaDを）サブユニットシロイヌナズナ光化学系の使用を想定していますが、この方法は、他の人と互換性があります。 <ol> pBlueScript II SKベクター（または上流のT7プロモーターを有する任意の他の同様のベクター）13の多重クローニング部位（MCS）にpPsaDのコード配列（CDS）をクローニング。 DNA単離キットを用いてプラスミド（をpBSK-pPsaD）を精製し、DNA配列決定により配列を確認してください。 注：すべての手順は、標準的な分子クローニング技術を採用しています。 260 nmの吸光度を測定するように設定し、分光光度計を用いたpBSK-pPsaDプラスミドDNA濃度を決定します。 10 ngの/μLの最終濃度にプラスミドを希釈します。 テンプレートとして希釈したプラスミドを用いて、（35サイクル）20μLPCRを実行します。 2μLの10×ポリメラーゼバッファー、2μLの2mMのdNTPを、1μLの5 mMのM13フォワードプライマー（5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '）、1μL5 mMのM13リバースプライマー（5：次のように反応を準備します「-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3 '）、1μLは、最大全反応容量を作ることをpBSK-pPsaDプラスミド、1 UのTaqポリメラーゼ、及び蒸留水を希釈20μL。以下のように、標準的なPCRプログラムを使用してください：95°C、5分。 [95°C、30秒の35サイクル。 56℃、30秒。 72℃、30秒）。 72℃、5分間。 cDNAの正確​​な増幅を確認し、関連を定量化するためにTAE緩衝液中の1％（w / v）アガロースゲル（トリス-HCl、pH7.6の、20mMの酢酸、1mMのEDTA）でPCR産物の5μLを実行します濃度を確認するための基準に相対的なバンド。さらにアプリケーションのために-20℃で製品の残りの部分を格納します。 以下のように、PCR DNAと互換性のウサギ網状赤血球溶解物ベースの無細胞転写/翻訳系を用いて、50μLの反応を準備します。40μL網状赤血球溶解液を転写/翻訳系から、2.5μL放射性標識された[35 S]メチオニン、11μCiの/ mLの（比活性：>千CI /ミリモル）、2.5μLの滅菌蒸留水、および5μLpPsaD PCR産物（100から800 ngの）。 注意：手袋、実験用衣類や安全GLASを着用SES放射性物質を取り扱います。作業面や機器を監視し、除染。承認された廃棄物容器内のすべての放射性廃棄物を処分。 30℃の水浴中で90分間、反応をインキュベートします。氷の上にサンプルを置くことによって反応を停止させます。 オートラジオグラフィー、フルオロまたは蛍光イメージングに続く標準ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で確認するための試験試料と反応（同じ体積でも、ステップ5.7の入力コントロールとして機能することができる）の1μLを除去します。良好な結果がpPsaD（〜23 kD）の分子量に対応するはっきりと強いバンドの観察によって示されています。さらにアプリケーションのために-80℃で反応の残りの部分を格納します。 3.葉緑体の単離以下のストック溶液を準備します。 0.6 Mソルビトール、10mM塩化マグネシウム：葉緑体の単離緩衝液（CIB、2倍）を準備（のMgCl 2）、10 mMのエチレングリコール四酢酸（EGTA）、10mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、20mMの重炭酸ナトリウム（ 炭酸水素ナトリウム）、40mMの4-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES） ; KOHでpH 8.0に調整します。 、2X CIBの2リットルを調製し、アリコートを作製し、長期保存のために-20℃に保管し、又は短期貯蔵のために4℃で。蒸留水で1;：1xのCIBを作成するには、2倍CIB 1を希釈これは、葉緑体の分離実験の日に新たに調製することができます。 HEPES-のMgSO 4 -Sorbitolバッファ（HMS、1倍）を準備します50mMのHEPES、3mMの硫酸マグネシウム（MgSO 4）し、0.3 Mソルビトール;水酸化ナトリウム（NaOH）でpH8.0に調整します。 、緩衝液を400mLを調製アリコートを作成し、長期保存のために-20℃に保管し、又は短期貯蔵のために4℃で。 低温室でまたは氷の上で次の手順のすべてを行っています。目の前にソリューション、デバイス、機器、およびローターのすべてを予冷arting。 50 mL遠心チューブに13 mLのパーコール、13 mLの2倍CIBバッファ、および5mgのグルタチオンを混合し、4℃で30分（ブレーキオフ）のために43,000×gで混合物を遠心分離することにより、連続的な密度勾配を準備します。遠心分離した後、勾配を乱さないよう、後で使用するために氷の上にそれを維持するために注意してチューブを処理します。 1リットルのビーカーに遺伝子型/条件当たり1×CIBの100ミリリットルを転送します。 ふるいにそれらを傾けて液体媒体から苗を取り出し、別のCIB含有ビーカーに移します。その後、新鮮なCIBの100mLでそれを交換する前に、すべての残留液体培地を除去するために、CIBで組織をすすぎます。 均質化のために、各50 mLビーカーに開催された新鮮なCIBの20ミリリットルを使用してラウンド、均質化の5つの連続したラウンドでサンプルあたり1×CIBの100ミリリットルの合計を使用します。 均質化の最初のラウンドのために、できるように、手で50 mLのビーカーに植物組織を転送前の保持バッファは、あなたの指を介して排出します。最初のラウンドでの組織のほとんどを使用してみてください、それは緩衝液で浸されていることを確認します。これが不可能な場合は、第二ラウンドで残りの未使用の組織をご紹介します。 組織内に組織ホモジナイザーのプローブを配置し、1の2つのパルスを用いて均質化 – 2秒ごと。穏やかな圧搾により250 mLの遠心管に濾過布の2層を通してホモジネートをフィルタリングします。ろ液を保持し、50 mLビーカーに戻って組織を移します。 均質化の最初のラウンドで使用されていない残りの組織を追加し、50 mLのビーカーに第20 mLのCIBのアリコートを配置し、均質化および濾過手順を繰り返します。このように、繰り返しCIBの100ミリリットルの全てまで、3.5と3.6のステップ（ すなわち 、20ミリリットルの5アリコート）まで使用し、得られたろ液を組み合わせてきました。 遠心分離機4℃で5分（上のブレーキ）1,000×gでプールされたホモジネート、およびオフ注ぎます上清をすぐにペレットを乱さないように注意しながら、遠心分離が完了したことを以下に示します。軽くチューブを氷上に攪拌することにより、チューブ内に残っ残留上清中にペレットを再懸濁。ピペッティングまたはボルテックスによって活発に再懸濁されません。 穏やか受信チューブの壁を介してそれを適用するためにパスツールピペットを使用して、既成の連続的な密度勾配の上部にホモジネートを転送します。勾配を乱すことは避けてください。 4℃で10分（ブレーキオフ）のための7800×gで、スイングバケットローターで遠心分離。 注：2つの緑のバンドが、遠心分離後の勾配で見ることができます下のバンドは、無傷の葉緑体を含み、上のバンドは、壊れた葉緑体が含まれています。 ピペッティングによりトップバンドを捨て、その後、勾配当たり最大8ミリリットルの容量を維持し、新鮮な50 mL遠心管にパスツールピペットで下側のバンドを移します。 トン〜1×HMSの25 mLのチューブにバッファを追加し、二回チューブを反転O葉緑体からパーコールを洗います。 4℃で5分（上のブレーキ）1,000×gで、スイングバケットローターと遠心機で再びチューブを置きます。 上清を捨て、慎重に穏やかにチューブを氷上に攪拌することにより、チューブ内に残っ残留HMSで葉緑体ペレットを再懸濁します。 （ペレットの大きさと第4節でカウントに基づいて）必要であれば、HMSの300μL、あまりにも多くのサンプルを希釈しないようにしてください – 追加の100を追加します。 氷の上で葉緑体を保管してください。葉緑体は、下流の用途に使用される前に、毎回、それらを再懸濁し、チューブを横に振ります。常に葉緑体を転送する（拡大細孔を持つ）カットピペットチップを使用します。 葉緑体の収量および無傷の4分析 1.5 mLのチューブで495μLの1x HMSのバッファに分離された葉緑体の5μLを追加し、1得るためにチューブを転倒混和：100希釈を。 プラ血球計の計数室の上にカバーガラスをCE。ゆっくりピペット〜40 – カバーガラスと計数室との間の隙間に希釈された葉緑体懸濁液60μL。 10Xや20X目的とした位相差顕微鏡を使用して、無傷の葉緑体は、ラウンドと明るく見える光のハローに囲まれています。 注：顕微鏡下で、1ミリメートル2カウント面積が25大きな四角であり、計数室の中心に16の小さな正方形を含む各。 10大きな四角内の葉緑体の数をカウントします。少なすぎたり多すぎたり、葉緑体が存在する場合、それに応じて希釈係数（上記のステップ4.1）を調整し、手順を繰り返して10〜30の大平方あたりの葉緑体の数が平均化する必要があります。 次のようミリリットル（濃度）あたりの葉緑体の数を計算します。nは（ステップ4.3で算出された大きな広場あたりの葉緑体の平均数）25×（大正方形の総数））100（希釈係数×25の正方形上記のボリュームが0.1mm 3であるので、（）、1ミリリットルあたりのデータを表現するためにスケーリング係数10×4。 ステップ3.12で得られた葉緑体懸濁液の体積濃度を乗じて葉緑体の実際の収量を計算します。通常、50以上×10 6葉緑体を得ることができます。 5.葉緑体のタンパク質のインポート以下のストック溶液を準備します。 10倍HMSバッファを準備します：500mMのHEPES、30mMのMgSO 4を、および3.0 Mソルビトール; NaOHでpHを8.0に調整します。短期保存用の長期保存のために4℃で、このバッファ、アリコートし、-20℃で保存、50mLのを準備します。 1×HMS緩衝液に溶解し、50mMのEDTA：輸入停止緩衝液を準備します。 -20℃で、このバッファ、アリコート、および店舗の50ミリリットルを準備します。 （W 60mMのトリス-HCl、pH6.8の、10％（v / v）グリセロール、2％：2×タンパク質装填緩衝液を調製します/ V）SDS、0.005％（w / v）のブロモフェノールブルー。 4℃で50ミリリットル、およびストアを作成します。使用直前に、バッファの900μLの1 Mの1,4-ジチオスレイトール（DTT）の100μLを追加します。 、3の時点で時間経過を実行する3つの管の輸入停止緩衝液の130μLアリコートを含む各を用意し、氷の上に置いておくにします。 （遺伝子型/条件あたり）2 mL試験管中の450μLのインポート反応を準備します。使用直前にすべての材料を解凍します。 1インポート反応のために、一般的にμL容積の10×10 6葉緑体を使用します。例えば、葉緑体の濃度が2.5×10 8 / mLである場合、40μL葉緑体の懸濁液を使用しています。 3つの時間点は、3×μLが必要になります（ つまり 、この例では120μL）。 、;（この例では、すなわち、48 B = [600-3×A] / 10）蒸留水（全量600μLを作るために）、BμLの10x HMSバッファ：次の順序で氷上で反応成分を混ぜます12μL1 Mグルコン酸（カリウム塩）、6μLの1MのNaHCO 3、6μL20％（w / v）のBSA、30μLの100mMアデノシン5'-三リン酸マグネシウム塩（をMgATP）、24μLの250mMのメチオニン（放射標識されません）、および30μL、タンパク質前駆体。すぐにインポート反応を開始する前に、3×葉緑体のμLを加え、穏やかにチューブをタップして混ぜます。 2・sで- – 1光100マイクロモル・メートル下の水浴中で25℃で反応チューブをインキュベートします。時折、葉緑体を再懸濁し、チューブをフリック。 時間経過を行うために、pPsaDのために〜12分（4,8及び12分の時点が適当であるまである輸入の直線範囲内で必要な時点で反応から130μLアリコートを撤回この場合）。線形範囲の期間は、異なるタンパク質14のために変化することができます。したがって、Tを最適化する前に、各個々のプレをテストするために提案されています彼は時間を指します。 すぐに撤退時に、優しくチューブをタップして混ぜ、氷冷輸入停止緩衝液のチューブにそれぞれ130μLのアリコートを転送し、時間経過が完了するまで氷上ですべてのチューブを保持しています。 遠心分離機マイクロフュージで12,000×gで30秒のすべてのサンプルは、ピペットで上清を破棄し、再懸濁ペレットボルテックスで15μL2倍のタンパク質ローディングバッファーインチ全てのサンプルに加えて、標準的なSDS-PAGE及びオートラジオグラフィー、フルオロまたは蛍光イメージング15によってpPsaD入力制御（ステップ2.7からの各インポート反応に添加量の10％にpPsaD相当を含有）を分析します。結果を定量化し、分析するために画像解析ソフトウェアを使用してください。取り込み効率の指標を提供するために、異なる遺伝子型/状態にインポートされたタンパク質の量は、それぞれ、成熟バンドに関連した放射能を測定することによって評価することができます。