Métodos para el estudio de lípidos Las alteraciones en neutrófilos y la posterior formación de los neutrófilos extracelular Trampas

Los lípidos han sido demostrado que desempeñan papeles importantes en la homeostasis celular, la muerte celular, las interacciones huésped-patógeno, y la liberación de citoquinas ^1. Con el tiempo, el interés y el conocimiento sobre el impacto de los lípidos en interacciones huésped-patógeno o la inflamación se han incrementado, y varias publicaciones confirmar el papel central de ciertos lípidos, especialmente el colesterol esteroide, en las respuestas celulares. El tratamiento farmacológico con estatinas, que se utilizan como inhibidores de la biosíntesis del colesterol mediante el bloqueo de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima-A-reductasa (HMG-CoA-reductasa), puede actuar como agentes anti-inflamatorios mediante la reducción de los niveles séricos de interleucina 6 y la proteína C-reactiva ^2. Colesterol y estructuras de glicoesfingolípidos enriquecido puede ser utilizado por varios patógenos, tales como bacterias y virus, tal como una puerta de entrada en el huésped ^{3, 4, 5,}class = "xref"> 6. Los esfingolípidos (por ejemplo, esfingomielina) se han mostrado para ser utilizados por patógenos para promover su patogenicidad ^7. En los macrófagos, el uso de micobacterias dominios para entrar en las células enriquecida en colesterol; un agotamiento de colesterol inhibe la captación micobacteriana ^8. Además, la infección de macrófagos con Francisella tularensis, un agente zoonótica responsable de la tularemia (también conocida como fiebre del conejo) ^9, condujo a una infección que fue abolida cuando el colesterol se agotó de las membranas ^10. Del mismo modo, la invasión de las células huésped por Escherichia coli a través de estructuras ricas en lípidos se demostró que el colesterol dependiente ^4. Además, Salmonella typhimurium experimentos de infección de las células epiteliales demostraron que el colesterol es esencial para la entrada de patógenos en las células ^11. El colesterol agotamiento inhiben estad la absorción de Salmonella ^11. Además, un estudio reciente de Gilk et al. demostró que el colesterol juega un papel importante en la absorción de Coxiella burnetii ^12. Además, Tuong et al. encontró que el 25-hidroxicolesterol juega un papel crucial en la fagocitosis por lipopolisacárido (LPS) estimulada por los macrófagos ^13. La fagocitosis se redujo cuando los macrófagos fueron tratados farmacológicamente para agotar colesterol ^14. Por lo tanto, el colesterol y otros lípidos parecen jugar un papel importante en la infección y la inflamación, ya que su agotamiento puede reducir el riesgo de invasión de varios patógenos ^{10, 11, 12.}

Recientemente, hemos sido capaces de demostrar que las alteraciones lipídicas, especialmente el agotamiento de colesterol a partir de la célula, inducir la formación de extracellula neutrófilostrampas r (TNE) en neutrófilos derivados de sangre humana ^15. Desde el descubrimiento de los TNE en 2004, que se ha demostrado que desempeñan un papel crítico en el atrapamiento bacteriana, y por lo tanto en obstaculizar la propagación de la infección ^{16, 17.} TNE consisten en una cadena principal de ADN asociado con histonas, proteasas, y péptidos antimicrobianos ^16. La liberación de las redes por los neutrófilos puede ser inducida por patógenos invasores ^{18, 19} y sustancias químicas tales como de forbol-miristato-acetato (PMA) o estatinas ^{16, 20.} Sin embargo, los mecanismos celulares detalladas, y especialmente el papel de los lípidos en este proceso, aún no están totalmente claras. El análisis de los lípidos puede conducir a una mejor comprensión de los mecanismos implicados en una amplia variedad de procesos y las interacciones celulares, tales como la liberación de TNE. CholesteLOD y esfingomielina son constituyentes esenciales de la membrana celular y lípidos microdominios, donde se añaden estabilidad y facilitan el agrupamiento de las proteínas implicadas en el tráfico de proteínas y eventos ²¹ de señalización. Para investigar el papel mecanicista de ciertos lípidos, agentes farmacológicos anfifílicos, tales como el oligosacárido cíclico metil-β-ciclodextrina (MβCD), se puede utilizar para alterar la composición lipídica de una célula y para reducir el colesterol in vitro ^15. A continuación, presentamos un método para utilizar HPTLC para analizar la composición de lípidos de los neutrófilos en respuesta a MβCD. HPLC se utilizó para confirmar el nivel de colesterol en la población de neutrófilos. Además, se describe un método para visualizar la formación de los TNE por microscopía de inmunofluorescencia en los neutrófilos derivados de sangre humana en respuesta a MβCD.