Metodi per studiare lipidiche Alterazioni nei neutrofili e la formazione successiva di neutrofili extracellulare Traps

I lipidi hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nella omeostasi cellulare, morte cellulare, interazioni ospite-patogeno, e di citochine rilascio ^1. Nel corso del tempo, l'interesse e la conoscenza sull'impatto dei lipidi nelle interazioni ospite-patogeno o infiammazioni sono aumentati, e diverse pubblicazioni confermano il ruolo centrale di alcuni lipidi, in particolare il colesterolo di steroidi, in risposte cellulari. trattamento farmacologico con statine, che vengono utilizzati come inibitori della biosintesi del colesterolo bloccando 3-idrossi-3-metilglutaril-Coenzima-A-reduttasi (HMG-CoA reduttasi), può agire come agenti anti-infiammatori abbassando i livelli sierici di interleuchina 6 e proteina C-reattiva ^2. Colesterolo e strutture glicosfingolipidi arricchiti possono essere usate da diversi agenti patogeni, come batteri e virus, come un gateway nell'ospite ^{3, 4, 5,}class = "xref"> 6. Sfingolipidi (ad esempio, sfingomielina) hanno dimostrato di essere utilizzati da patogeni per promuovere la loro patogenicità ^7. Nei macrofagi, domini per entrare nelle cellule uso micobatteri colesterolo arricchita; una deplezione di colesterolo inibisce l'assorbimento micobatterica ^8. Inoltre, infezione di macrofagi con Francisella tularensis, un agente zoonotico responsabile tularemia (noto anche come febbre dei conigli) ^9, ha portato ad un'infezione che è stata abolita quando il colesterolo è stata esaurita dalle membrane ^10. Analogamente, l'invasione delle cellule ospiti di Escherichia coli tramite strutture ricche di lipidi è stata dimostrata per essere il colesterolo-dipendente ^4. Inoltre, Salmonella typhimurium esperimenti di infezione di cellule epiteliali hanno dimostrato che il colesterolo è essenziale per l'ingresso del patogeno nelle cellule ^11. Colesterolo esaurimento inhibited l'assorbimento di Salmonella ^11. Inoltre, un recente studio condotto da Gilk et al. ha dimostrato che il colesterolo svolge un ruolo importante nella diffusione di Coxiella burnetti ^12. Inoltre, Tuong et al. rilevato che il 25-idrossicolesterolo gioca un ruolo cruciale nella fagocitosi da lipopolisaccaride (LPS) -stimulated macrofagi ^13. La fagocitosi è stato ridotto quando i macrofagi sono stati trattati farmacologicamente per esaurire il colesterolo ^14. Così, il colesterolo e altri lipidi sembrano giocare un ruolo importante nella infezione e infiammazione, dal momento che il loro esaurimento può ridurre il rischio di invasione da diversi agenti patogeni ^{10, 11, 12.}

Recentemente, siamo stati in grado di dimostrare che alterazioni lipidiche, in particolare l'esaurimento del colesterolo dalla cella, indurre la formazione di spazio extracellulare neutrofilir trappole (NET) in derivati dal sangue umano neutrofili ^15. Dalla scoperta del NET nel 2004, essi hanno dimostrato di giocare un ruolo critico nel intrappolamento batterica, e quindi nel ostacolare la diffusione di infezioni ^{16, 17.} NET consistono di una dorsale DNA associato con istoni, proteasi, e peptidi antimicrobici ^16. Il rilascio delle reti da neutrofili può essere indotta da patogeni invasori ^{18, 19} e sostanze chimiche come forbolo miristato-acetato (PMA) o statine ^{16, 20.} Tuttavia, i meccanismi cellulari dettagliati e in particolare il ruolo dei lipidi in questo processo, non sono ancora del tutto chiaro. L'analisi dei lipidi può portare ad una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti in una varietà di processi e interazioni cellulari, come ad esempio il rilascio di NET. Cholesterol e sfingomielina sono costituenti fondamentali della membrana cellulare e lipidi microdomini, dove si aggiungono la stabilità e facilitare il raggruppamento delle proteine coinvolte nel traffico di proteine e gli eventi ²¹ di segnalazione. Per studiare il ruolo meccanicistico di alcuni lipidi, agenti farmacologici anfifilici, come il ciclico oligosaccaride metil-β-ciclodestrina (MβCD), può essere utilizzato per modificare la composizione lipidica di una cella e per ridurre il colesterolo in vitro ^15. Qui vi presentiamo un metodo per utilizzare HPTLC per analizzare la composizione lipidica dei neutrofili in risposta a MβCD. HPLC è stata utilizzata per confermare il livello di colesterolo nella popolazione dei neutrofili. Inoltre, si descrive un metodo per visualizzare la formazione di NET mediante immunofluorescenza microscopia in neutrofili derivati ​​dal sangue umano in risposta a MβCD.