Summary

Наводить Complete полипа Регенерация от спинных Physa из Starlet актинии<em> Nematostella vectensis</em

Published: January 14, 2017
doi:

Summary

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Abstract

Стрекающие, и , в частности Hydra, были первыми животными , показанные для регенерации поврежденных или разорванных структур, и действительно такие исследования , возможно , запускаемые современный биологический запрос через работу Трамбле более 250 лет назад. В настоящее время исследование регенерации видел возрождение с использованием как "классические" регенеративные организмы, такие как гидры, планарий и хвостатых, а также расширяющийся спектр видов , охватывающих диапазон от многоклеточных, губок через млекопитающих. Кроме того, ее внутренний интерес как биологическое явление, понимание того, как регенерация работает в различных видах будет информировать нас о том, разделяют регенеративные процессы общие черты и / или видов или контекстно-зависимые клеточные и молекулярные механизмы. Актинии стерлядь, Nematostella vectensis, является новой моделью организма к регенерации. Как Hydra, Nematostella является членом древнего филюма, книдарий, но в тон класс Anthozoa, сестра клады к Нуйгогоа, которая является эволюционно более базальной. Таким образом , аспекты регенерации в Nematostella будет интересно сравнить и сопоставить с теми гидры и других кишечнополостных. В этой статье мы представляем метод Bisect, наблюдать и классифицируют регенерацию аборальной конца взрослого Nematostella, который называется physa. Physa естественным образом подвергается делению как средство бесполого размножения, а также естественное деление или ручной ампутация physa вызывает возобновление роста и реформирование сложных морфологией. Здесь мы кодифицированы эти простые морфологические изменения в системе Staging Nematostella регенерации (The NRSS). Мы используем NRSS, чтобы проверить влияние хлорохин, ингибитор лизосомных функции, которая блокирует аутофагии. Результаты показывают, что регенерация полип структур, в частности мезентериев, ненормально, когда аутофагия ингибируется.

Introduction

Наблюдение регенерации в одной гидры была знаковым событием в биологии появления как экспериментальной науки 1,2. Регенерация остается явление чрезвычайно широкое обращение к биологу и мирянина, так. Потенциал для онтогенетики, клиницистов, биомедицинской ученых и инженеров ткани , чтобы понять и преодолеть ограничения на регенерации человека делает регенерацию биологии более чем внутренне интересно.

Теперь, с использованием новейших технологий, таких как секвенирование генома и усиления и потери функциональных инструментов, поле готова дразнить друг от друга регенеративные механизмы и в конечном счете понять, как различные виды могут регенерировать в то время как другие не могут. Степень общности в молекулярном, клеточном и морфологических реакций еще предстоит выяснить, но до сих пор кажется, что основные реакции среди животных, которые могут регенерировать более похожи, чем был бы томографовНед только десять лет назад 3.

Стрекающие, в частности, являются снисходительный при регенерации почти все их части тела на фоне широкого спектра морфологического разнообразия. Из одиночного полипа пресной воды, Hydra вместе с крошечных морских полипов, которые строят огромные коралловые рифы, до сложных колониальных сифонофор, таких как Португальской Man-O-War, регенерация часто является способом размножения, в дополнение к механизму ремонта или реформирования поврежденных или утраченных частей тела в результате травмы и хищничества. Являются ли различные виды книдарий используют сходные или различные механизмы для регенерации принципиально интересный вопрос 4-6.

Мы, и другие были разработки anthozoan, Nematostella vectensis в качестве модели для регенерации 7-17. Недавно мы разработали систему определения стадии для описания регенерации всего тела от морфологически однородного куска ткани надвое от Aboraл конец полипа 10. В то время как Nematostella полипы могут регенерировать , когда разрезанный на любом уровне, мы решили сократить взрослых на аборальной позиции в наиболее морфологически простого региона, physa, отчасти потому , что это близко к нормальной плоскости естественного бесполого деления 18, а также из – за него наблюдение разрешений и молекулярный анализ того, как все тело повторно собраны от простейших морфологических компонентов.

Балетмейстер система Nematostella Регенерация (NRSS) обеспечивает относительно простой набор морфологических критериев , которые могут быть использованы , чтобы выиграть прогресс любого аспекта регенерации путем ампутированной physa, при нормальных условиях культивирования или экспериментально возмущенных ситуаций , таких как небольшие лечения молекулы, генетических манипуляций или экологического изменения. Как и ожидалось, NRSS становится принята в качестве морфологического помост, на котором можно ссылаться на клеточные и молекулярные события регенерации10.

Наконец наш метод резки производит зияющую дыру на несколько порядков больше , чем контактный точки прокола , используемой в недавнем исследовании 17, но оба раны заживают в течение около 6 часов. Документирование визуально арестовывая и отдельные фазы закрытия раны следует предложить экспериментальные подходы для объяснения кажущейся независимости от размера раны и времени, которое требуется, чтобы закрыть. Таким образом, более глубокое визуальное понимание аборальной процесса ампутации, предусмотренных этим протоколом, будет способствовать дальнейшие исследования в этой системе регенерации модели и расширить применение этой системы с использованием промежуточной Nematostella vectensis.

Protocol

1. Кондиционер животных для температуры, питания и цикл свет / темнота Получить Nematostella vectensis взрослых от одного из многочисленных лабораторий Nematostella по всему миру, или поставщика некоммерческий (таблица 1) Поддерживать Nematostella при постоянной температур…

Representative Results

Прогрессирование морфологических событий во время регенерации в отрезанной physa показана на рисунке 1А, который включает в себя представительные вид physa на каждом этапе NRSS. Типичный сайт physa разрез показан на взрослого (Arrowheads). На фотографиях на рисунке 1А</s…

Discussion

Использование Nematostella в качестве модели заживления ран и регенерации становится все более популярным. Таким образом, важно, чтобы иметь возможность визуализировать морфологические закономерности конкретного протокола, прежде чем эффективных клеточных и молекулярных анализов м?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Нью-Йорк Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Грант на ОТВ.

Materials

Nematostella vectensis, adults Marine Biological Lab (MBL) non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 ml Carolina Biological Supply 741004 250 ml
Glass Culture Dish, 1,500 ml Carolina Biological Supply 741006 1,500 ml
Polyethylene transfer pipette, 5ml  USA Scientific  1022-2500 narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered Samco 202-205 cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel Feather Safety Razor Co. Ltd no. 10 blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers Roboz RS5045 alternative suppliers available
Pyrex petri dish, 100 mm diameter Corning  3160 can substitute other glass petri plates
Sterile 6 well plate Corning Falcon  353046 or similar from other manufacturer
Sterile 12 well plate Nunc  150628 or similar from other manufacturer
Sterile 24 well plate Cellstar, Greiner bio-one 662-160 or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit San Francisco Bay; drsfostersmith.com CD-154005 option for growing brine shrimp
pyrex baking dish common in grocery stores option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more  Instant Ocean; drsfoster-smith.com CD-116528 others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation various common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy Carolina Biological Supply 716391 For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000ml PhytoTechnology Laboratories B199 For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source various  with continuous 1 – 40x magnification 

References

  1. Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. . Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley’s Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , (1986).
  2. Trembley, A. . Mémoires pour servir à l’histoire d’un genre de polypes d’eau douce, à bras en forme de cornes. , (1744).
  3. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  4. Galliot, B. Hydra, a fruitful model system for 270 years. Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).
  5. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles?. Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).
  6. Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration?. Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).
  7. Amiel, A. R., et al. Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis. Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).
  8. Warren, C. R., et al. Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis. PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).
  9. Gong, Q., et al. Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis. Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).
  10. Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis. Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).
  11. Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).
  12. Tucker, R. P., et al. A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration. Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).
  13. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Dev Biol. 12, (2012).
  14. Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis. Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).
  15. Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).
  16. Burton, P. M., Finnerty, J. R. Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).
  17. DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis. BMC Biol. 12, (2014).
  18. Hand, C., Uhlinger, K. R. Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis. Invert Biol. 114, 9-18 (1995).
  19. Fritzenwanker, J. H., Technau, U. Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa). Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).
  20. Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. Science’s super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry. The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).
  21. Genikhovich, G., Technau, U. In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps. Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).
  22. Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis. Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).
  23. Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system. Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).
  24. Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission. Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).
  25. Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nat Commun. 5, 5486 (2014).
  26. Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis. Front Zool. 11, 44 (2014).
  27. Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).
  28. Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms. Development. 139 (2), 347-357 (2012).
  29. Richards, G. S., Rentzsch, F. Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis. Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).
  30. DuBuc, T. Q., et al. In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes. BMC Cell Biol. 15, (2014).
  31. Kaur, J., Debnath, J. Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).
  32. Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis. Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).
  33. Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).
  34. Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. Autophagy in stem and progenitor cells. Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).
  35. Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).
  36. Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging. Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).
  37. Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. Autophagy in zebrafish. Methods. 75, 172-180 (2015).
  38. Varga, M., et al. Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration. Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).
  39. Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. Autophagy and apoptosis in planarians. Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).
  40. Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra. Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).
  41. Tettamanti, G., et al. Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling. Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).

Play Video

Citer Cet Article
Bossert, P., Thomsen, G. H. Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis. J. Vis. Exp. (119), e54626, doi:10.3791/54626 (2017).

View Video