Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.
Cnidari, e in particolare Hydra, sono stati i primi animali indicati per rigenerare le strutture danneggiate o mozzate, e in effetti questi studi probabilmente lanciati indagine biologica moderna attraverso il lavoro di Trembley più di 250 anni fa. Attualmente lo studio della rigenerazione ha visto una rinascita utilizzando entrambi i microrganismi rigenerativi "classici", come l'Hydra, planaria e urodeli, nonché uno spettro ampliamento di specie che misurano la gamma di metazoi, dalle spugne attraverso mammiferi. Oltre al suo interesse intrinseco come fenomeno biologico, la comprensione di come la rigenerazione lavora in una varietà di specie ci illustrerà se i processi rigenerativi condividono caratteristiche e / o specie comuni o meccanismi cellulari e molecolari specifici al contesto. L'anemone di mare starlet, Nematostella vectensis, è un organismo modello emergente per la rigenerazione. Come Hydra, Nematostella è un membro delle antiche phylum, Cnidaria, ma all'interno di tLa classe Anthozoa, un clade sorella al Hydrozoa che è evolutivamente più basale. Così gli aspetti della rigenerazione in Nematostella sarà interessante mettere a confronto con quelli di Hydra e altri cnidari. In questo articolo, vi presentiamo un metodo per bisect, di osservare e classificare la rigenerazione della fine aboral dell'adulto Nematostella, che si chiama il Physa. Il Physa subisce naturalmente la fissione come mezzo di riproduzione asessuata, e sia la fissione naturali o amputazione manuale del Physa innesca ricrescita e la riforma delle morfologie complesse. Qui abbiamo codificato questi semplici cambiamenti morfologici in un sistema di gestione temporanea Nematostella rigenerazione (il NRSS). Usiamo il NRSS per testare gli effetti di clorochina, un inibitore della funzione lisosomiale che blocca l'autofagia. I risultati mostrano che la rigenerazione delle strutture polipo, in particolare i mesenteri, è anormale quando autofagia è inibita.
L'osservazione della rigenerazione in un unico idra è stato l'evento seminale l'avvento della biologia come scienza sperimentale 1,2. Rigenerazione rimane un fenomeno di straordinariamente ampio ricorso al biologo e laico allo stesso modo. Il potenziale di biologi dello sviluppo, medici, scienziati e ingegneri biomedici tessuti per comprendere e superare i limiti di rigenerazione umana rende biologia rigenerazione più di intrinsecamente interessante.
Ora, con l'uso di tecnologie emergenti come il sequenziamento del genoma e il guadagno e la perdita di strumenti di funzione, il campo è pronta a prendere in giro i meccanismi rigenerativi a parte e in ultima analisi, per capire come le varie specie in grado di rigenerare, mentre altri non possono. Il grado di comunanza di risposte molecolari, cellulari e morfologiche rimane da chiarire, ma finora sembra che le risposte di base tra gli animali che possono rigenerare è più simile di quanto sarebbe stato Imagined solo un decennio fa 3.
Cnidari in particolare, sono facile a rigenerare quasi tutte le loro parti del corpo in mezzo a un ampio spettro di diversità morfologica. Dal solitari polipo acqua dolce, Hydra insieme con i minuscoli polipi marini che costruiscono enormi coralli, alle complesse sifonofore coloniale, come il portoghese Man-O-Guerra, la rigenerazione è spesso una modalità di riproduzione, in aggiunta a un meccanismo di la riparazione o la riforma parti del corpo danneggiate o perse derivanti da un infortunio e predazione. Se le diverse specie di Cnidaria utilizzano meccanismi simili o differenti per la rigenerazione è una domanda interessante fondamentalmente 4-6.
Noi e altri abbiamo sviluppato il antozoo, Nematostella vectensis come modello per la rigenerazione 7-17. Abbiamo recentemente sviluppato un sistema di stadiazione per descrivere la rigenerazione di un intero corpo da un pezzo morfologicamente uniforme di tessuto tagliato in due dai Aboral fine del polipo 10. Mentre polipi Nematostella possono rigenerare quando attraversata a qualsiasi livello, abbiamo scelto di tagliare adulti in posizione aboral nella regione più morfologicamente semplice, il Physa, in parte perché questo è vicino al piano normale della naturale fissione asessuata 18, ed anche perché permessi osservazione e analisi molecolari di come un intero corpo viene ricomposto dai componenti morfologiche semplici.
Il Staging System Nematostella Regeneration (NRSS) fornisce una relativamente semplice serie di parametri morfologici che potrebbero essere utilizzati per segnare il progresso di qualsiasi aspetto della rigenerazione da un Physa amputata, in condizioni di coltura normali o sperimentalmente perturbato situazioni come trattamenti di piccole molecole, manipolazione genetica o alterazione ambientale. Come anticipato, il NRSS sta diventando adottato da impalcatura morfologica su cui è possibile fare riferimento gli eventi cellulari e molecolari della rigenerazione10.
Infine il nostro metodo di taglio produce un Gaping fori diversi ordini di grandezza superiore alla puntura fenomenale utilizzato in uno studio recente 17, ma entrambe le ferite guariscono in circa 6 ore. Documentare le fasi visivamente arrestando e distinti di chiusura della ferita dovrebbe suggerire approcci sperimentali per spiegare l'apparente indipendenza della dimensione di una ferita e il tempo necessario per chiuderla. Così, una più profonda comprensione visiva del processo di amputazione aboral, fornita da questo protocollo, sarà di aiuto ulteriori indagini in questo sistema di rigenerazione del modello e ampliare l'applicazione di questo sistema di stadiazione utilizzando Nematostella vectensis.
L'utilizzo di Nematostella come modello di guarigione delle ferite e la rigenerazione sta diventando sempre più popolare. Pertanto, è importante essere in grado di visualizzare i modelli morfologici di un particolare protocollo prima analisi cellulari e molecolari efficaci possono essere assegnati e confrontati. Nematostella hanno un alto grado di rigenerazione "flessibilità", potendo riformare quasi ogni struttura mancante amputati in qualsiasi luogo, nelle fasi post-planula di vita. …
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da una Stem Cell Science di New York (NYSTEM C028107) Concessione di GHT.
Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
Glass Culture Dish, 250 ml | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 ml |
Glass Culture Dish, 1,500 ml | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 ml |
Polyethylene transfer pipette, 5ml | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
#5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
Pyrex petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass petri plates |
Sterile 6 well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
Sterile 12 well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
Sterile 24 well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
Beaker, Graduated, 4,000ml | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 – 40x magnification |