Un test CFSE-based per studiare la migrazione delle cellule dendritiche murini della pelle in drenanti linfonodi durante l'infezione con<em> Mycobacterium bovis</em> Bacille Calmette-Guérin

noDCs sono cellule specializzate che presentano l'antigene in grado di rispondere alla sfida microbica alle superfici del corpo con l'acquisizione di antigene microbica e la migrazione a DLN via linfatica. Ci, DC presentano questo antigene alle cellule T in modo che guida le risposte T-cellulari primarie. Il processo di migrazione DC da tessuto a DLN è quindi estremamente importante per comprendere come si avvia una risposta T-cellulare produttivo. Metodi per misurare la migrazione DC sono quindi molto utili nel dispiegamento sopra.

Un modello di topo è stato impiegato per studiare pelle migrazione CC per DLN dopo infezione con BCG, un vaccino vivo che viene iniettato clinicamente nella pelle. In linea, BCG viene iniettato nella zampa posteriore di imitare questo percorso cutanea della vaccinazione. Un semplice test è stato sviluppato e quindi incorporato in questo modello per studiare la migrazione di pelle DC sottopopolazioni dal sito di inoculazione BCG nella pelle zampa al pln drenaggio. Questo protocollo relies sulla iniettare il fluorocromo CFSE nella stessa zampa che precedentemente ricevuto BCG e quindi isolare il drenaggio PLN 24 ore dopo per analizzare la presenza di cellule CFSE etichettati mediante citometria di flusso. Anche se non è descritto nel protocollo, LNs da questa configurazione possono anche essere preparati per l'analisi al microscopio confocale, per studiare i processi di migrazione, come il posizionamento delle cellule migratorie nel LN ^3. Inoltre, i risultati simili in materia di migrazione DC pelle BCG-triggered sono stati ottenuti utilizzando sia BCG Pasteur 1173P2 ³ e BCG SSI 1331 ^14.

CFSE è comunemente usato per etichettare le cellule in vitro e per tenere traccia di tali cellule marcate in vivo dopo i trasferimenti di cella ^15. Nel protocollo attuale, però, è stato utilizzato per etichettare direttamente le cellule della pelle in situ. La base molecolare di etichettatura CFSE è simile a FITC, che è anche un colorante fluorescente ammina reattiva. CFSE è comunque preferibile rispetto FITC per coniugazione come creAtes obbligazioni carbossamide molto stabili ^16. Inoltre, CFSE è altamente membrana permeabile e diffonde passivamente nelle cellule. Una volta dentro, si forma ammina intracellulare (fluorescente) coniugati che vengono conservati nella cella con l'etichetta ^15.

Il test di migrazione CFSE-based sviluppato dagli autori consente l'identificazione delle cellule trasferirsi dalla pelle a DLN entro un periodo di 24 ore in risposta alla BCG. Misura quindi la migrazione acuta nel corso di un periodo di tempo definito e permette di indagare la capacità di diverso, iniettato stimoli per innescare la migrazione. Questo test è diverso dalla tecnica classica di FITC pittura pelle, che misura un evento di migrazione cumulativa innescato da cutanea, applicazione topica di un agente contatto sensibilizzante. Così, il saggio di migrazione CFSE-based può essere impiegato per identificare DC pelle migratori o altre cellule che ospita il pln dopo l'iniezione di microbi, prodotti microbici o altri stimoli infiammatori nel footpad. Infatti, entrambi i neutrofili e γ: δ cellule T hanno dimostrato di trasferirsi dalla pelle al DLN in risposta al BCG ^17,18. In realtà, il test è stato recentemente utilizzato in un ambiente co-infezione per dimostrare che una infezione nematode gut-localizzato potrebbe disattivare migrazione DC pelle BCG-triggered per DLN ^14.

Migrazione DC è spesso valutato tra i 24 a 72 ore a FITC pittura pelle in quanto coniugati con fluoresceina DC sono difficili da individuare 4 o 5 giorni dopo la verniciatura ^19. Perdita del segnale CFSE su etichetta DC non è un problema nel test qui presentata poiché l'analisi della migrazione è stato limitato a 24 ore; La ragione di questo è che gli autori hanno voluto studiare specificamente "di notte" eventi di migrazione. Altri interessati a questo test sono comunque invitati a verificare precedenti o anche più tardi punti di tempo per il monitoraggio CFSE-based. Inoltre, poiché CFSE è introdotto per iniezione può essere somministrato in qualsiasi tempo definito. Questa flessibilità ha permesso l'unauthors per valutare la migrazione continua tra il giorno 5 e 6 dopo l'infezione BCG (Figura 2C) ^3. Iniettare CFSE potrebbe potenzialmente limitare i tipi di cellule accessibili in situ per la reazione di marcatura. Ad esempio cellule di Langerhans (LCS), che sono cellule dendritiche che risiedono nello strato superiore della pelle, l'epidermide, migrano male in risposta al BCG nel test di migrazione CFSE-based (Figura 3) ^3. Tuttavia, durante FITC pittura pelle, DC posizionati nel derma, lo strato sotto l'epidermide, sono facilmente etichettati e migrare verso il DLN più veloce di LC ^20,21. Questo suggerisce che le cellule possono diventare fluorocromo marcato senza necessariamente dover localizzare allo strato di pelle in cui viene applicata la soluzione di etichettatura.

Come modello per l'infezione BCG, l'orecchio del mouse fornisce una via intradermica in buona fede di inoculazione che è più in linea con l'amministrazione clinica di BCG come vaccino tubercolosi. foiniezione otpad invece, è probabile che una combinazione di intradermica e via sottocutanea. Detto questo, richiede abilità e formazione correttamente e riproducibile fornire BCG al derma ^22, quindi in pratica clinica non sempre può essere dato veramente intradermica bensì sottocutanea o una combinazione di entrambi. Come un sito di inoculazione della zampa ha due vantaggi molto chiari sopra l'orecchio che il merito di nota. Innanzitutto, la risposta immunitaria viene concentrato a PLN scarico dopo un'iniezione zampa e questo facilita l'esame delle risposte. Gli autori di questo rapporto ha trovato il pln di essere il primo e principale LN scaricare la zampa ^3. Altri hanno suggerito di drenaggio spaccatura tra i poplitea e subiliac LNs dopo l'iniezione di Evan di blu ^23. Tuttavia, per quanto riguarda l'orecchio, vi è più di un orecchio DLN nei topi e questi possono non essere presenti regolarmente o facile da individuare ^24. Quest'ultimo presenta chiaramente un liability in studi che cercano di indagare le risposte a DLN. In secondo luogo, i volumi più grandi possono essere inoculati nella zampa (10 – 50 ml), rispetto per l'orecchio. Questo a sua volta riduce al minimo sia la responsabilità di introdurre importanti modifiche nel flusso linfatico e di dover lavorare con molto piccoli volumi di iniezione, che è di per sé un problema quando si tratta di inoculando grandi quantità di micobatteri. In dell'orecchio dove volumi di iniezione devono essere piccoli (1-10 ml), anche 5 microlitri possono alterare il flusso linfatico e potenzialmente forzare una maggiore quantità di materiale iniettato direttamente nel DLN in modo incontrollato. È quindi importante tenere conto di volumi di iniezione. Ciò è particolarmente importante in esperimenti affrontano il contributo delle cellule in traghettare batteri alla LN. Nel modello zampa BCG, alcuni BCG può aver raggiunto il DLN in assenza di trasporto cellulare. Questo si basa sull'osservazione che si può ancora rilevare BCG nel DLN di topi in cui migrazione delle cellule dal piedepad è stato interamente ablated da iniezione locale di tossina della pertosse ^3. Se questa è un'indicazione che BCG può accedere direttamente linfatici e raggiungere il DLN in maniera veramente acellulare resta da determinare poiché non si può escludere che i micobatteri in questo caso dato accesso linfatici forza del volume iniettato.

Una considerazione pratica per vaccinazioni nell'orecchio o zampa è che gli animali devono essere adeguatamente immobilizzato per iniezioni da effettuare correttamente e in modo riproducibile. gas isoflurano è descritto nel protocollo corrente come metodo per trattenere gli animali in preparazione per iniezioni zampa. I tempi di induzione e di recupero relativamente rapido per l'anestesia isoflurano mediata rendono un metodo popolare, ma simile ad altri agenti anestetici, colpisce la fisiologia, che può interferire con i risultati sperimentali ^25. Infatti, anestetici sia volatili e iniettabili diminuiscono il flusso linfatico attraverso l'abolizionemovimenti muscolari volontari, riducendo il tono muscolare, e la diminuzione linfangione contrazione ^26. Inoltre, una riduzione di 5 volte nella migrazione a DLN delle DC adoptively trasferito nella zampa è stato riportato in animali anestetizzati ^27. Ciò premesso, e poiché le procedure di manipolazione prima dell'anestesia sono suscettibili di causare più stress per gli animali che l'iniezione stessa, che è rapida da gestire e non richiede una fase di recupero, la possibilità di trattenere adeguatamente l'animale senza anestesia dovrebbe essere considerato. Un dispositivo di immobilizzazione del mouse personalizzato per iniezioni zampa, dove l'animale può essere rapidamente portato ad una posizione immobilizzato e inoculata nella zampa in 30 a 40 sec sarebbe ideale per iniettare il mouse nella zampa posteriore senza alterare altri aspetti della sua fisiologia nel processo e sarebbe estremamente utile in studi che riguardano la migrazione delle cellule attraverso i vasi linfatici.

In conclusione, questo rapportomette in evidenza un nuovo protocollo per il monitoraggio DC pelle durante la loro mobilitazione per il DLN utilizzando un test che controlla migrazione durante una finestra di 24 ore definito. Questo test migrazione CFSE-based permette la rilevazione e l'analisi di cellule migranti mediante citometria di flusso, come descritto qui, nonché mediante microscopia confocale ^3. Esso fornisce una piattaforma flessibile per studiare una varietà di stimoli iniettati e la loro capacità di attivare la migrazione DC, e soprattutto, può essere impiegato per monitorare non solo controller, ma anche altre popolazioni spostano dalla pelle al DLN durante diverse impostazioni sperimentali.