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Immunologie et infection

Un test basé CFSE pour étudier la migration de la peau murine cellules dendritiques dans les ganglions lymphatiques de drainage lors de l'infection avec<em> Mycobacterium bovis</em> Bacille Calmette-Guérin

Published: October 09, 2016
doi:
10.3791/54620
, ,
1Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology (MTC),Karolinska Institutet

Summary

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Guérin.

Abstract

Les cellules dendritiques (CD) sont importants pour déclencher des réponses immunitaires, en partie grâce à leur capacité d'acquérir et de l'antigène de navette pour le ganglion lymphatique de drainage (DLN). La mobilisation des PED au DLN est complexe et reste à être pleinement élucidé lors de l'infection. On décrit ici l'utilisation d'un simple essai innovant qui repose sur le fluorochrome 5- et 6-carboxyfluorescéine ester diacétate de succinimidyle (CFSE) pour suivre la migration des CD au cours de l' infection par le coussinet plantaire par le Mycobacterium bovis bacille de Calmette-Guérin (BCG) chez des souris C57BL / 6 souris. Ce test permet la caractérisation de la peau DC sous-populations qui délocalisent activement à la vidange, LN poplitée en réponse au BCG. Ce protocole provient d'un modèle BCG où les PED migratoires de la peau ont été identifiés par cytométrie en flux. Le dosage est aimable à l'étude et l'identification des CD ou d'autres cellules qui abrite la LN poplitée après l'inoculation de microbes, de leurs métabolites ou d'autres inflammatoiresstimuli dans le coussinet plantaire, et par conséquent d'étudier les facteurs qui régulent la migration de ces cellules.

Introduction

DC localisées dans les surfaces du corps détectent les microbes ou de leurs produits, et ce faisant, mobiliser via les vaisseaux lymphatiques à la LN drainante (DLN) 1,2. Ce déplacement est nécessaire pour le transport de l'antigène microbien à l'DLN et l'amorçage conséquente des réponses immunitaires au microbe envahissant. En effet, le blocage ou l' échec des PED à migrer à partir du tissu infecté à l'DLN assourdit la réponse des lymphocytes T 3-5. En conséquence, des essais conçus pour suivre la migration au niveau d'une seule cellule sont utiles pour aider à attribuer la fonction de migration à un sous-ensemble DC donné.

Il y a un grand nombre de données sur la mobilisation des CD de la peau à l'DLN. Ce dernier représente une grande partie de la connaissance sur la migration continue des sites enflammés ou infectés 2. Cela ne surprend pas puisque la peau abrite une grande population des PED et est une surface très accessible pour l'expérimentation chez la souris de laboratoire. Plusieurs techniques ont ainsi été développées pour évaluerla migration des CD de souris à partir de la peau au DLN 2. FITC peinture de la peau est de loin l'approche la plus couramment utilisée. Dans cet essai, le fluorescéine-5-isothiocyanate de fluorochrome (FITC) est préparé dans un mélange d'acétone et d'une irritation de contact. Ce cocktail est appliqué sur la peau épilée ou rasée et l'accumulation de cellules marquées au FITC est à son tour analysé dans le DLN. La migration peut également être étudiée par injection de la peau avec des nano- ou microparticules fluorochrome étiquetée, ce qui permet le suivi des cellules phagocytaires qui ont intériorisé les particules fluorescentes dans la peau. Les vaisseaux lymphatiques peuvent également être canules pour extraire directement les PED qui migrent de la lymphe. Cela est toutefois techniquement difficile, surtout chez les souris. Le nombre de DCs obtenues pour une analyse ultérieure est également un facteur limitatif.

En dépit de nombreuses études antérieures sur la peau migration DC, il reste un manque d'information au sujet de la peau mobilisation DC à DLN vacci suivantenation avec le bacille de Calmette-Guérin (BCG), la souche vivante atténuée de Mycobacterium bovis utilisé pour vacciner contre M. la tuberculose. Le BCG est inoculé dans la peau, provoquant une infection limitée qui déclenche un T helper de type 1-cellule de réponse. Les deux sous-populations de DC qui se mobilisent pour la DLN de la peau BCG infectées et les facteurs qui régulent leur migration au cours de ce processus ne sont pas pleinement compris. À la lumière de ce qui précède, une méthode simple mais roman a été développé où le fluorochrome 5 et 6-carboxyfluorescéine ester diacétate succinimidyl (CFSE) est injecté in situ pour suivre la migration des CD dans le DLN 3. C57BL / 6 sont injectées dans le coussinet plantaire arrière avec un inoculum de BCG et le jour avant le sacrifice, les animaux sont injectés dans le coussinet plantaire même avec une forte concentration de CFSE. Vingt-quatre heures plus tard, les animaux sont sacrifiés et la vidange LN poplitées (PLN) enlevés et préparés pour cytométrie en flux. Ce test permet à l'identification des cellules qui migrent de nuit de la peau du coussinet plantaire à la DLN (Figure 1).

En outre, les souris de gènes ciblés peuvent être utilisés pour aider à identifier les facteurs requis pour les cellules à se mobiliser pour la DLN. L' utilisation de ce test, les auteurs de ce rapport ont déjà constaté que EpCAM faible CD11b élevé migrateurs transport de PED de la peau BCG à l'DLN dans un processus régulé par l' interleukine-1 récepteur et l'adaptateur intracellulaire molécule MyD88 3. Le protocole de cet essai de migration basée CFSE qui provient du rapport ci – dessus par Bollampalli et al. 3 , où la cytométrie de flux a été utilisé pour détecter et analyser les PED migratoires de la peau, est décrit ici. Les avantages et les inconvénients de ce test sont discutés.

Protocol

NOTE: C67BL / 6 souris ont été utilisés pour les expériences présentées dans ce manuscrit. Ces animaux étaient la maison dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques à l'animalerie MTC, Karolinska Institutet, Stockholm, Suède. Les expérimentations animales ont été réalisées selon les directives et lignes directrices du Conseil suédois de l'agriculture, de l'Agence de protection des animaux suédois et Karolinska Institutet. Des expériences ont été approuvées par le Conseil d'éthique du Nord animal Stockholm. 1. Préparation des stocks CFSE et stockage Préparer un stock de 5 mM de 5 et 6-carboxyfluorescéine ester diacétate succinimidyl (CFSE) dans le diméthylsulfoxyde. Vortex. Distribuer 100 aliquotes ul dans stérile, 0,5 ml Microtubes à vis. aliquotes Conserver à -80 ° C. 2. Souris Utilisez des souris mâles et femelles consanguines ou entre 8 et 12 semaines d'âge. animaux par sexe et par âge correspondant sont préférés. Assurez-vous que les autorisations éthiques animaux nécessaires are en place avant le début des expériences. 3. Immobilisation des animaux avec isoflurane Gas Anesthesia Charger l'unité d'anesthésie avec de l'isoflurane. Remplir la seringue en verre de 10 ml étanche aux gaz avec de l'isoflurane. Eviter l'introduction de bulles d'air. Relier la seringue et l'entrée de liquide avec le tuyau fourni et déplacer le poussoir vers l'avant jusqu'à ce que le liquide dans le tube de raccordement est visible sur le point d'entrer dans l'évaporateur. NOTE: Ne pas stocker isoflurane dans la seringue lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation. Anesthésier les animaux avec de l'isoflurane dans la chambre d'aspiration, avec un débit d'air maintenue à environ 400-500 ml / min et la concentration d'isoflurane à 3,5%. REMARQUE: L'appareil ne fonctionnera pas sans flux d'air. Une fois que les animaux sont endormis, tournez le robinet d'arrêt de l'unité d'anesthésie pour acheminer le gaz isoflurane à la pièce de masque. Vérifiez que la pièce de masque est intact pour éviter les fuites de gaz. Airflow peut être maintenue à 400 ml / min, alternativement diminué à 200 ml / min. Réduire la concentration isoflurane à 2,6%. REMARQUE: L'effet anesthésiant peut être augmentée et / ou réduite en ajustant le débit d'écoulement. 4. BCG Injections et récupération Visuellement confirmer et effectuer des tests tels que le test de pincement réflexe d'orteil pour vérifier que les souris sont immobilisés / endormi sur la pièce de masque isoflurane avant d'effectuer des injections. Inoculer dans le coussinet plantaire arrière, 1 x 10 6 unités de Mycobacterium bovis bacille de Calmette-Guérin (BCG) formant des colonies dans 30 pi de PBS à l' aide d' une seringue munie d'une aiguille 29 x ½ G pouces. NOTE: La génération des stocks de mycobactéries est brièvement décrit dans la description originale de cette procédure 3, et en détail substantiel ailleurs 6. Le BCG est également facilement disponibles auprès de sources commerciales. Les auteurs recommandent que le BCG soit pulse-soniqué ou passé à travers une seringue pour perturber touffes avant ses inoculatisur des souris. Le BCG est rappelé ici en tant que stimuli microbiens compte tenu de son emploi dans la description originale de ce protocole 3 mais les auteurs certainement encourager l'essai d'autres stimuli microbiens. Effectuer la même procédure décrite ci-dessus pour l'injection de PBS chez les souris témoins. Surveiller les animaux après les injections pour confirmer que la reprise de l'anesthésie est réussie et que les animaux peuvent se prendre en charge sur le injecté, patte arrière. 5. CFSE Injections Préparation de CFSE pour Injections: Décongeler une fiole de mM CFSE solution stock 5 de -80 ° C. Diluer le 10 fois CFSE dans du PBS. Remettre en suspension la solution à fond avant le remplissage de la seringue en vue de l'injection. CFSE Injection and Recovery: Répétez la procédure pour anesthésier les animaux dans la section 3. Injecter 20 ul de 0,5 mM CFSE dans la patte arrière qui a déjà reçu le BCG ou PBS. <br/> NOTE: L'injection de CFSE doit être effectué la veille (24 h) la date prévue pour le sacrifice. 6. L'ablation chirurgicale de poplitée ganglion (PLN) NOTE: L'utilisation d'instruments chirurgicaux stérilisés et leur décontamination répétée dans 70% d'éthanol sont encouragés tout au long de cette étape. Euthanasier les souris. Vaporiser l'animal avec 70% d'éthanol. La broche de l'animal en décubitus dorsal sur une planche de dissection. NOTE: Les auteurs peuvent recommander l'euthanasie par dislocation cervicale. faire avec précaution une incision verticale dans la cuisse arrière. Effacer les muscles et la graisse à l'aide des ciseaux et des pinces pour exposer et par conséquent exciser les pLN situés profondément dans la poche de graisse, dans le creux du genou. Transférer le pLN PBS 0,5 ml stérile, sur la glace. 7. Génération de suspension unique de cellules à partir de PLN Homogénéiser le pLN à travers un 70 microns tamis cellulaire placed dans un puits-plaque 6 contenant 5 ml de PBS ou de cellules activées par fluorescence (FACS) tampon (PBS contenant 2% de sérum de veau foetal (FCS), 5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), et azoture de sodium à 1 mM). Homogénéiser à travers le tamis à l'aide de l'extrémité arrière d'une seringue de 3 ml. NOTE: L'azoture de sodium est toxique et doit être manipulé avec précaution. Laver le filtre avec un autre 5 ml de tampon PBS ou FACS, recueillir le matériau dans un tube de 15 ml et un culot les cellules à 277 x g (1 200 tours par minute, R = 172 mm) pendant 5 min, 4 ° C. Alternativement, homogénéiser PNLS directement dans des tubes à centrifuger en utilisant homogénéisateurs en polypropylène. Sur la base de la taille du culot, remise en suspension de la suspension de pLN dans un volume approprié de PBS ou dans un tampon FACS, par exemple 200 – 1000 ul. Utiliser une chambre de comptage pour quantifier le nombre total de cellules obtenues à partir de chaque suspension LN. Utilisez bleu trypan pour exclure les cellules mortes / mourantes. 8. Cellule Coloration et cytométrie de flux Transfert 1 – 10 x 10 6 cellules à 5 ml à fond rond tubes en polystyrène. Laver avec un tampon FACS, et le culot par centrifugation à 277 xg (1200 rpm, R = 172 mm) pendant 5 min, 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre le culot dans 50 – 100 pi de cocktail d' anticorps (voir cellules dendritiques [DC] marqueurs utilisés pour la coloration de la surface, le tableau Matériaux) contenant 0,5 – 1 ug d'anti-souris CD16 / CD32 (pour bloquer Fc médiée non spécifique interactions) dans un tampon FACS pour 30 – 45 min, sur la glace. Protéger les échantillons de la lumière. Après incubation, laver les cellules avec un tampon FACS et le culot par centrifugation à 277 xg (1200 rpm, R = 172 mm) pendant 5 min, 4 ° C. Remettre en suspension les cellules dans 50 – 100 pi de tampon FACS. Acquérir des données sur un cytomètre de flux 7-10. NOTE: Pour d'excellentes critiques sur cytométrie en flux, nous renvoyons le lecteur aux publications suivantes qui relaient à la fois des informations théoriques et pratiques sur cette méthode.

Representative Results

L'essai de migration à base de CFSE (figure 1) a été utilisée conjointement avec la cytométrie de flux pour détecter et caractériser les cellules CFSE marqués qui apparaissent dans l'infection par le BCG pLN après dans le coussinet plantaire. Une grande partie de l' étiquetage CFSE dans le pLN se trouve sur MHC-II élevé et CD11c + / cellules faibles (figure 2A), compatible avec les CD de la peau qui ont migré vers DLN de la peau 11. À la fois la fréquence et le nombre total de CFSE marqué au CMH-II haut CD11c + / cellules faibles sont augmentées PLNS de souris BCG infectées par rapport aux témoins PBS injecté (figure 2B-C), ce qui suggère que le BCG augmente le déplacement de ceux – ci cellules à la DLN. Depuis cette migration des mesures d'essai pendant une période de 24 heures, il a été possible d'établir que les contrôleurs de la peau continuent à entrer dans le DLN 5 jours après l' infection (figure 2C). Cela prolonge la migration continue dans le modèle actuel au-delà de l'échéancier initial activatisur des lymphocytes T CD4 + spécifiques de l' antigène dans le pLN 3. En outre, les DC migratoires de la peau expriment des niveaux élevés de molécules de costimulation CD80 et CD86 (figure 2D). Ceci est cohérent avec les observations antérieures provenant de cultures d'explants de peau et de peau FITC peinture 11, supportant le concept selon lequel des DC sont des cellules migratrices activées. DC Il est important, à la fois LN-résidents (MHC-II + CD11c cellules élevées) et DCS plasmacytoïdes (CMH-II faible CD11c 1 PDCA cellules faibles +), qui entrent NLs enflammées par des veinules endothéliales et non lymphatiques afférents 12, où négatif pour CFSE (Figure 2EF), ce qui suggère en effet que l' étiquetage CFSE a eu lieu principalement dans le coussinet plantaire. Étant donné que la haute CD11c MHC-II cellules + / bas représentent non pas un mais plusieurs sous-populations de DC 13, les marqueurs de surface supplémentaires CD103, EpCAM (CD326) et CD11b ont été inclus dans le panneau de coloration d' anticorps utilisé pour la détection par cytométrie de flux (tableau des matériaux) pour caractériser davantage la population de DCs migratrices (figure 3). Ce faisant, une sous-population de cellules EpCAM élevées faibles CD11b a été identifiée comme la principale peau migratoire DC sous – ensemble en réponse à l' infection par le BCG (figure 3). Les données de cytométrie de flux présentés ici ont été acquises sur un cytomètre de flux équipé de 4 lasers (488, 532, 640 et 405 nm). Les données ont été analysées avec un logiciel d'analyse de cellules. Autres cytomètres de flux multi-couleur que celle spécifiée dans le tableau des matériaux peuvent être utilisés pour la détection réussie des marqueurs mentionnés dans les études ci – dessus, ou la détection d'autres marqueurs, sur d' autres types de cellules pour cette question. Pour le protocole décrit ci-après, d'un cytomètre capable de détecter 6 fluorochromes différents est nécessaire. Fait important, les clones pour chaque anticorps utilisés sont spécifiés (tableau des matériaux). Le choix du conjugué de fluorochrome doit être considérée comme cela peut dépendre des lasers et des canaux de détection sur le cytomètre en flux disponibles. De même, les anticorps doivent être titrés pour déterminer les dilutions les plus appropriées pour la coloration. les fréquences de la population en BCG- et des échantillons PBS-injectés ont été tracées et utilisées conjointement avec nombre total de cellules pour calculer le nombre absolu de définis, des sous-ensembles résidentiels protégés des PED. La signification des différences dans les moyens de groupe de données a été analysé par Student essai ou ANOVA le cas échéant, avec une coupure de p <0,05. Outliers ont été exclus de l'analyse ci-après le test de Grubbs pour les valeurs aberrantes. Figure 1. Plan: BCG Footpad InfectionModèle et CFSE-Based Assay Migration. BCG est inoculé dans la patte arrière de souris C57BL / 6. A différents points temporels après l'infection et 24 h avant le sacrifice, le CFSE fluorochrome est injecté dans le coussinet plantaire même que précédemment reçue par le BCG. Le drainage, noeud lymphatique poplité est isolé et les cellules caractérisées par un écoulement CFSE marqué cytométrie. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. DC de la peau migrateurs sont une population Major Déménager à l'DLN Après BCG Footpad Infection. C57BL / 6 souris ont été infectées avec 1 x 10 6 CFU de BCG dans le coussinet plantaire. Vingt-quatre heures avant le sacrifice, les animaux ont été injectés avec 0,5 mM CFSE dans le même coussinet plantaire. NLs poplité ont été récoltés, homogénéisésdans une seule cellule suspensions et soumis à la cytométrie de flux. Pour les mesures effectuées 1 jour après le BCG, CFSE a été injecté 2hr après BCG. (A et B) des parcelles de Zebra montrant l' expression prédominante de CFSE sur + / cellules faibles et élevées CD11c CMHII dans BCG-drainage pLN 3 jours après l' infection. (C) fréquence et le nombre total de CFSE marqué MHCII haute CD11c + / bas cellules dans pLN de BCG- et les souris PBS-injectés ont été tracées à différents points de temps. (D) intensité de fluorescence moyenne (MFI) pour CD80 et CD86 a été déterminée sur CFSE + et CFSE neg MHC-II haute CD11c + / bas DC de la peau en pLN 3 jours après l' infection par le BCG. (E) l' expression de CFSE dans les pays en développement de la peau (MHC-II haute CD11c + / bas), LN-résident PED (MHC-II + CD11c haute) et (F) DC plasmacytoïdes (faible CD11c CMH-II faible PDCA-1 +)a été déterminé par cytométrie de flux 3 jours après le BCG. Pour chaque expérience, au moins 5 souris ont été utilisées pour les groupes infectés par le BCG et 3 pour le contrôle du PBS-injectées. Les barres indiquent l'erreur standard de la moyenne. Nombre total de cellules CFSE marquées au sein de chaque sous – ensemble sont donnés dans Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:. E1005206 3. * Désigne différences statistiquement significatives entre les contrôles BCG-infectés et PBS. L'une des deux expériences indépendantes indiquées. Figure adaptée de Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:… E1005206 3, avec l' autorisation de l'éditeur S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. EpCAM faible CD11b élevées DC sont la peau principale DC Subset Traffickment à la DLN Après BCG Footpad Infection. C57BL / 6 souris ont été injectés par le BCG et CFSE comme dans la figure 2. parcelles (A) Zebra montrant gating stratégie employée (en haut) et la fréquence des cellules CFSE + dans chaque, défini sous – ensemble à différentes des points de temps après l'infection par le BCG (panels du bas). Fréquences au sein de chaque sous-ensemble peuvent varier en fonction du point de temps après l'infection. Après 3 jours de BCG , on peut espérer trouver environ 0,2% du CMH-II haute cd11c / bas cellules parmi toutes les cellules LN. Parmi ceux – ci, environ 6% sont CD103 + cellules. Pour les sous – ensembles trouvés au sein de la haute CD103 porte MHC-II négative, on peut trouver environ 42% CD11b haute EpCAM cellules faibles, 27% CD11b bas EpCAM cellules faibles et 7% LCS. (B) Le nombre total de cellules CFSE + dans chaque, sous – ensemble défini à différents points temporels après l' infection par le BCG est signalée. Pour chaque experiment, d'au moins 5 souris ont été utilisées pour les groupes infectés par le BCG et 3 pour le contrôle PBS. Les barres indiquent l'erreur standard de la moyenne. * Indique les différences statistiquement significatives par rapport aux témoins PBS-injectés. L'une des trois expériences indépendantes indiquées. Figure re-imprimée à partir de Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015, 11:.. E1005206 3, avec l' autorisation de l'éditeur S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

CNDO sont des cellules présentatrices d'antigènes spécialisés qui peuvent répondre aux défis microbienne à la surface du corps par l'acquisition de l'antigène microbien et la migration vers DLN via lymphatics. Là, DCs présentent cet antigène aux lymphocytes T d'une manière qui entraîne des réponses des cellules T primaires. Le processus de migration DC à partir du tissu à DLN est donc très important pour comprendre comment une réponse productive des cellules T est lancée. Les méthodes pour mesurer la migration DC sont par conséquent très utiles dans le déroulement ci-dessus.

Un modèle de souris a été utilisé pour étudier la peau migration DC à DLN après l'infection par le BCG, un vaccin vivant qui est injecté dans la peau cliniquement. En ligne, le BCG est injecté dans la patte arrière pour imiter cette voie cutanée de vaccination. Un test simple a été développé et, par conséquent incorporé à ce modèle pour étudier la migration de la peau DC sous-populations à partir du site d'inoculation BCG dans la peau du coussinet plantaire à l'pLN de drainage. Ce protocole relies sur l'injection du CFSE fluorochrome dans le même coussinet plantaire qui, auparavant, a reçu le BCG, puis l'isolement de la vidange pLN 24 h plus tard pour analyser la présence de cellules marquées au CFSE par cytométrie en flux. Bien que non décrite dans le protocole, NLs de cette configuration peuvent également être préparés pour l' analyse par microscopie confocale, pour étudier les processus de migration tels que le positionnement des cellules migratrices dans la LN 3. En outre, des résultats similaires sur la peau BCG déclenchée par la migration DC ont été obtenus en utilisant à la fois le BCG Pasteur 1173P2 3 et BCG SSI 1331 14.

CFSE est couramment utilisé pour étiqueter des cellules in vitro et de suivre ces cellules marquées in vivo après transferts cellulaires 15. Dans le protocole actuel cependant, il a été utilisé pour marquer directement les cellules de la peau in situ. La base moléculaire de l'étiquetage CFSE est similaire à FITC, qui est aussi un colorant fluorescent, une amine réactive. CFSE est cependant préférable à FITC pour la conjugaison comme il creAtes bonds carboxamide très stables 16. En outre, CFSE est très perméable et diffuse passivement dans les cellules. A l' intérieur, il forme une amine intracellulaire (fluorescente) des conjugués qui sont conservés dans la cellule 15 marquée.

Le test de migration basée CFSE-développé par les auteurs permet l'identification des cellules de la peau à la relocalisation DLN dans un délai de 24 heures en réponse au BCG. Il mesure ainsi la migration aiguë pendant un laps de temps défini et permet d'étudier la capacité des différents, injecté stimuli pour déclencher la migration. Ce dosage est différent de la technique classique de FITC peinture de la peau, qui mesure un événement déclenché par la migration cumulative cutanée, l'application topique d'un agent de sensibilisation par contact. Ainsi, l'analyse de migration à base CFSE peut être utilisé pour identifier les contrôleurs de la peau de migration ou d'autres cellules qui abrite le pLN après l'injection des micro-organismes, des produits microbiens ou d'autres stimuli pro-inflammatoires dans le footpad. En effet, les deux neutrophiles et γ: On a montré ô cellules T à déménager de la peau à DLN en réponse au BCG 17,18. En fait, l'essai a été récemment utilisé dans un cadre de co-infection à montrer qu'une infection par les nématodes gut-localisée pourrait couper le BCG déclenché par la peau migration DC à DLN 14.

Migration DC est souvent évaluée entre 24-72 h dans FITC peinture de la peau depuis FITC PED sont difficiles à détecter 4 à 5 jours après avoir peint 19. La perte du signal CFSE sur étiqueté DC est pas un problème dans l'analyse présentée ici puisque l'analyse de la migration a été limitée à 24 heures; la raison étant que les auteurs ont voulu étudier spécifiquement "une nuit" événements de migration. D'autres intéressés dans cet essai sont toutefois invitées à rechercher les points précédents ou même plus tard temps pour le suivi basé sur CFSE. En outre, depuis CFSE est introduit par injection, il peut être donné à tout moment défini. Cette flexibilité a permis à l'unuteurs pour évaluer la migration DC entre le jour 5 et 6 après l' infection par le BCG (figure 2C) 3. Injecter CFSE pourrait limiter les types accessibles in situ pour la réaction de marquage des cellules. Pour les cellules de Langerhans instance (LCS), qui sont les CD qui résident dans la couche supérieure de la peau, l'épiderme, migrent peu en réponse au BCG dans l'essai de migration basé sur CFSE (Figure 3) 3. Cependant, au cours de FITC peinture de la peau, les PED positionnés dans le derme, la couche inférieure de l'épiderme, sont facilement étiquetés et migrent vers le DLN plus rapide que LCS 20,21. Ceci suggère que les cellules peuvent être marquées au fluorochrome sans avoir nécessairement besoin de localiser à la couche de la peau où la solution de marquage est appliquée.

En tant que modèle pour l' infection par le BCG, l'oreille de la souris fournit une voie intradermique de bonne foi de l' inoculation qui est plus en ligne avec l'administration clinique du BCG comme vaccin contre la tuberculose. foinjection otpad d'autre part, est probablement une combinaison de l'intradermique et sous-cutanée. Cela dit, il exige des compétences et de la formation pour fournir correctement et reproductible BCG dans le derme 22, dans la pratique clinique , il ne peut pas toujours être donnée véritablement intradermique mais plutôt sous – cutanée ou une combinaison des deux. En tant que site d'inoculation du coussinet plantaire fait avoir deux avantages très clairs sur l'oreille que la mention de mérite. Tout d'abord, la réponse immunitaire est concentrée à l'pLN de drainage après une injection du coussinet plantaire, ce qui facilite l'examen des réponses. Les auteurs de ce rapport ont trouvé la pLN pour être le premier et principal LN drainant la patte 3. D' autres ont suggéré de drainage partagé entre les poplités et subiliaque NLs après injection de Evan bleu 23. Néanmoins, en ce qui concerne l'oreille, il y a plus d'une oreille DLN chez la souris et ceux – ci peuvent ne pas être régulièrement présents ou faciles à localiser 24. Ce dernier présente clairement un liabilité dans les études qui cherchent à enquêter sur les réponses à DLN. D'autre part, des volumes plus importants peuvent être inoculés dans le coussinet plantaire (10-50 ul) par rapport à l'oreille. Ceci à son tour à la fois minimise la responsabilité de l'introduction de modifications importantes dans la circulation lymphatique et d'avoir à travailler avec de très faibles volumes d'injection, ce qui est en elle-même un problème quand il vient à inoculer de grandes quantités de mycobactéries. Dans l'oreille où les volumes d'injection doivent être de petite taille (1-10 pi), même 5 pi peuvent modifier la circulation lymphatique et potentiellement forcer une plus grande quantité de la matière injectée directement dans le DLN de manière incontrôlée. Il est donc important de tenir compte des volumes d'injection. Ceci est particulièrement important dans les expériences portant sur la contribution des cellules dans convoyant des bactéries à LN. Dans le modèle du coussinet plantaire BCG, certains BCG peut avoir atteint le DLN en l'absence de transport cellulaire. Ceci est basé sur l'observation que l'on peut encore détecter le BCG dans le DLN de souris où la migration des cellules du piedpad a été entièrement ablatée par injection locale de la toxine pertussis 3. Que ce soit une indication que le BCG peut accéder directement à lymphatics et atteindre le DLN d'une manière vraiment exempt de cellules reste à déterminer, car il ne peut pas être exclu que les mycobactéries dans ce cas où donner accès à lymphatics par la force du volume injecté.

Une considération pratique pour les vaccinations dans l'oreille ou capiton plantaire est que les animaux doivent être immobilisés de manière adéquate pour les injections à effectuer correctement et de façon reproductible. gaz isoflurane est décrit dans le protocole actuel comme une méthode pour immobiliser les animaux en cours de préparation pour les injections de footpad. L'induction et de récupération relativement rapide pour l' anesthésie isoflurane médiée font une méthode populaire, mais semblable à d' autres agents anesthésiques, elle affecte la physiologie, qui peuvent interférer avec les résultats expérimentaux 25. En effet, les anesthésiques volatiles à la fois et injectables diminuent le flux lymphatique en supprimantmouvements musculaires volontaires, ce qui réduit le tonus musculaire, et la diminution des lymphangion contraction 26. En outre, une réduction de 5 fois la migration vers DLN des PED transfert adoptif dans le coussinet plantaire a été rapportée chez des animaux anesthésiés 27. Compte tenu de ce qui précède, et étant donné que les procédures de manipulation avant l'anesthésie sont susceptibles de causer plus de stress aux animaux que l'injection elle-même, qui est à la fois rapide à administrer et ne nécessite pas une étape de récupération, la possibilité de restreindre de manière adéquate l'animal sans anesthésie devrait être considéré. Un dispositif de retenue de la souris sur mesure pour les injections footpad, où l'animal peut être rapidement amené à une position immobilisée et on l'inocule dans le coussinet plantaire de 30 à 40 secondes serait idéal pour injecter la souris dans le coussinet plantaire arrière sans altérer d'autres aspects de la physiologie du processus et serait extrêmement utile dans les études portant sur la migration des cellules à travers les vaisseaux lymphatiques.

En conclusion, ce rapportmet en évidence un nouveau protocole pour le suivi des PED de la peau lors de leur mobilisation à l'DLN en utilisant un test qui surveille la migration au cours d'une fenêtre de 24 heures définie. Cet essai de migration sur la base CFSE permet la détection et l' analyse des cellules migratrices par cytométrie de flux, tel que décrit ici, ainsi que par microscopie confocale 3. Il fournit une plate-forme flexible pour étudier une variété de stimuli injectés et leur capacité à déclencher la migration DC, et surtout, peut être utilisé pour suivre non seulement les CD, mais aussi d'autres populations mobiles de la peau au cours de DLN différents paramètres expérimentaux.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Karolinska Institutet, a project grant from the Swedish Research Council VR (Dnr 2014-2794) and a KID Doctoral Grant from Karolinska Institutet (All to A.G.R). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Materials

Isoflurane Baxter 1001936060
5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
(CFSE)		 Invitrogen C1157
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma D2650
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
Bacille Calmette-Guérin (BCG) strain Pasteur, in house
Trypan blue solution Sigma T8154
EDTA In house
Sodium azide Sigma S2002
PBS In house
Filtered water In house
BD Plastipak 3 ml syringe BD Medical Surgical Systems 309658 alternative: 5 ml syringe 
6 well plates TPP 92006
15 ml centrifuge tubes TPP 91015 Polypropylene
5 ml round bottom tubes BD Falcon 3272948 Polystyrene
Univentor  400 anaesthesia unit Univentor 8323001
Monojet 3/10ml syringe Medicarrier 8881511144 29 G x 1/2 in.
Sterile filter unit TPP 99500 PES membrane 
EPPI-Pistill homogenizer Schuett biotech 3.200 512 Polypropylene
Allegra X-30R centrifuge Beckman Coulter B01145
Bürker counting chamber VWR 631-0920
0.5 ml screw cap microtube  Sarstedt 72.730 Polypropylene
1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube VWR 700-5239 Polypropylene
70 micron cell strainers VWR 734-0003
BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software BD Biosciences Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed
FlowJo cell analysis software Tree Star
Antibody Clone Company 
Antibodies
MHC-II I-A/I-E  M5/114.15.2 BD Biosciences
CD11b M1/70 BD Biosciences
CD11c HL3 BD Biosciences
CD16/CD32 (Fc-block) 2.4G2 BD Biosciences
CD326/EpCAM G8.8 Biolegend
CD103 2E7 Biolegend
CD80 16-10A1 Biolegend
CD86 GL-1 Biolegend
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References

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Citer Cet Article
Bollampalli, V. P., Nylén, S., Rothfuchs, A. G. A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin. J. Vis. Exp. (116), e54620, doi:10.3791/54620 (2016).
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