Die Anwendung der undurchlässige Barrieren In Kombination mit Candidate Factor Soaked Beads zu studieren Induktive Signale im Küken

Das folgende Protokoll verwendet Hühnerembryonen in weniger als zehn Tagen Inkubation. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit Kings College London, Großbritannien und den britischen Home Office Tierpflege-Richtlinien durchgeführt. 1. Vorbereitung Erforderliche Vor Embryo Betrieb zu Chick Sammeln Sie die folgenden chirurgischen Instrumenten für die Operationen erforderlich, für die Ernte und zur Fixierung der Hühnerembryonen: Zwei Paare von No. 5 Uhrmachern Zange, ein Paar starke Zange, zB Typ AA, gebogene Scheren mit einer Klingen 2,5 cm lang, mit glatten Enden gebogen mit Enden Zange ca. 0,5 cm lang, und auch zwei Paare von No. 4 Uhrmachern Zange zu verwenden, während Folie Barrieren machen (1.6.3). Machen Sie ein Mikro Messer aus einem Stahlstift (0,3 mm Durchmesser) geschärft auf einem Schleifstein mit Öl. Mit einem Binokular, schärfen die Spitze des Stiftes zu einer flachen Klinge. Legen Sie den Stift in einem Nadelhalter und schützen seine scharfe Ende von geklopft und dented. HINWEIS: Die Schalungs das Messer mit einem 1000 ul Pipettenspitze ist eine einfache Möglichkeit dafür. Bereiten Sie 70% Ethanol in einer Plastikwaschflasche. Verwenden Sie einen Spritzer diese auf einem Papiertuch die chirurgischen Instrumente und das Mikro Messer wischen vor und nach dem Gebrauch zu sterilisieren und reinigen. Kaufen 5 cm breit klar Klebeband und einen geeigneten Spender. Finden oder einen Rest geeignet produzieren ein Hühnerei stetig auf seiner Seite zu halten. Machen Sie und speichern Lösungen zum Einweichen Perlen. Bereiten Sie eine 0,35 mg / ml-Lösung von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 4 (FGF4) Protein von 1 mg / ml eingefroren Lager indem sie sie mit Wasser und bei -20 ° C in 30 ul Aliquots verdünnt wird. Bereiten Sie Lösungen (entweder 0,05 oder 0,1 mg / ml) von all-trans-Retinsäure (RA), verdünnt mit Dimethylsulfoxid (DMSO) in dunklen Mikrozentrifugenröhrchen aus einer 5 mg / ml Lager. Lagern Sie die Lager und 100 ul Aliquots bei -20 ° C. Werden die Lösungen (entweder 2,5 oder 5 mg / ml) von BMS 493 (ein inverser agonist von RARs) in dunklen Mikrozentrifugenröhrchen mit DMSO verdünnt aus einer 10 mg / ml auf Lager. Lagern Sie die Lager und 100 ul Aliquots bei -20 ° C. Machen Sie Barrieren aus Aluminiumfolie. HINWEIS: Die Folie verwendet, um die Barrieren zu machen ist Standard Catering-Folie (gemessen durch Mikrometer als 0,013 mm dick). Jede inländische Aluminiumfolie würde wahrscheinlich geeignet sein. Schneiden Sie ein 1 cm im Quadrat Stück Aluminiumfolie und zu sterilisieren, indem sie es mit 70% Ethanol auf einem Gewebe abwischen. Legen Sie es auf eine 6 cm sterile Petrischale aus Kunststoff. Entsorgen Sie den Deckel ab und machen einen Deckel für die Schale aus Folie. HINWEIS: Dadurch werden die Schnitt Barrieren aus später das Festhalten an dem Kunststoff Deckel der Schale aufgrund statischer verhindern. Legen Sie die Petrischale auf einer Bühne graticule (1 cm lang aufgeteilt in 100 Abschnitte) unter dem Binokular mit Vergrößerung auf 1,6X. Verwendung einer Klinge No.15 kleinen Skalpell geschnitten Streifen der Folie auf eine exakte Breite, beispielsweise 0,7 mm oder 1,3 mm. Trennen Sie die FolieStreifen zwei Paar No. 4 Uhrmachern Pinzette. Dann machen Sie ein rechtwinkliges Biegung in der Mitte der Folienbarriere, so dass es ein Scharnier der spezifischen Breite ähnelt. HINWEIS: Diese Form der Barriere von 9, 10 aufgenommen wird. Eine schwenkbare Sperre bleibt an seinem Platz besser als eine gerade, flache Barriere. No. 4 Zange sind relativ stumpf und verwendet werden, da sie weniger wahrscheinlich Dellen oder Noten in den Folien Barrieren zu machen. Richten Sie die Barrieren in der Mitte der Petrischale mit einer Seite flach an der Schale und die andere aus der Schale nach oben zeigt, Bewegen der verbleibenden ungeschnittenen Folie auf einer Seite. Es werden 20 oder mehr Barrieren vor der Operation Tag. Legen Sie die Foliendeckel über die Schüssel und speichern Sie die Barrieren in einem Ort, wo sie nicht gestört werden. HINWEIS: Auch ein leichter Schlag kann die Barrieren umkippen oder bedeuten, dass sie mit statischen halten Sie sich an den Seiten der Schüssel. Inkubieren befruchtete Hühnereier auf ihren Seiten auf Karton Eierschalen bei 38 °C für die entsprechende Zeitdauer vor dem Betrieb Tag so daß die Embryonen in der gewünschten 8 der Bühne. 2. Herstellung von Hühnerembryonen und Perlen zum Betrieb Day 'Fenster' bebrüteten Hühnereiern. HINWEIS: Die folgende Methode für Eier Eröffnung wurde von Dennis Summer weitergegeben (wird nicht veröffentlicht). Mit dem Ei auf der Seite liegend, durchdringen das stumpfe Ende (Luftsack Ende) des Ei mit Typ AA starke Zange dafür sorgen, dass die Innenschale Membran gebrochen wurde. Um dies zu tun Griff fest zusammen die Zange und die Verwendung einer gesteuerten Messerstecherei Bewegung während das Ei mit der freien Hand. Nehmen Sie das Ei, immer noch auf der Seite liegend, in beiden Händen (eine auf jeder Seite) drehen um 180 ° entlang der horizontalen Achse und ersetzen Sie es in der Eierschale, so dass die Seite, die oberste war nun neben dem Fach befindet. HINWEIS: Dies ist der Embryo aus den Schalenmembranen lockert und bedeutet, dass der Embryo less wahrscheinlich geschnitten werden, wenn die Schale über dem Embryo entfernt wird. Nehmen Sie ein Stück durchsichtigem Klebeband ca. 5 cm im Quadrat und halten diese dicht über der obersten Oberfläche des Eies aus der Eischale zu stoppen auf den Embryo bröckelt, wenn das Ei geöffnet wird. Verwenden Sie die gebogene Schere sanft zu brechen durch die Schale und die Membranen in der Mitte des obersten Teils des Eies, machen ein sehr kleines Loch mit einer Klinge der Schere, so dass Luft in das Ei über den Embryo eingeben (die knapp liegt der oberste Teil der Hülle). HINWEIS: nur die Schalenmembranen brechen und keine der Membranen brechen für den Embryo, Luft das Ei eingeben, wird der Embryo aus der Schale zu trennen und der Embryo zur Ruhe auf dem Dotter kommen etwa 0,5-1 cm von der Schale . Verwenden Sie die gebogenen Schere, um das Loch in der Schale mit einem Durchmesser von etwa 1 cm zu einem Kreis zu vergrößern. Entfernen Sie das Stück ausgeschnittenen Shell und decken Sie das Loch im Ei mit einemStück durchsichtigem Klebeband ca. 5 cm im Quadrat. Um leicht dieses Band zu entfernen, drücken Sie das Band dabei bleiben nur an der Lippe des Lochs, so dass die verbleibenden Bandfrei. Das freie Band kann dann ergriffen werden, um das Ei zu entsiegeln. Bühnen Embryonen Nach der Inkubation bei 38 ° C (siehe Schritt 1.7) und Windowing (Schritt 2.1), verwenden Sie ein Binokular die Hühnerembryonen nach 8 zu inszenieren. Tun Sie dies, kurz bevor die Eier folgenden Windowing versiegelt werden. Schreiben Sie die Stufe von jedem Embryo auf der Eierschale. Bringen Sie die Eier in den Inkubator. HINWEIS: Die Embryos in den Stufen zwischen 8 und 15 sind geeignet für Sperr- und bead Experimenten. Embryos sind eher zu überleben, wenn sie nicht zu lange vor dem Betrieb aus dem Inkubator gelassen wurden. Das Einweichen Perlen vor dem Betrieb. FGF4 Nehmen Sie die Anzahl der Affinitätschromatographie Gelkügelchen (150-300 & mgr; m), die mit dem Ende einer 1000 ul Pipettenspitze halten und warh sie in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu entfernen, das Azid in sie gespeichert sind. Zentrifuge für 5 sec, die PBS verwerfen und das Verfahren zweimal wiederholt. Einweichen der Gelkügelchen in einem 30 ul Tropfen von 0,35 mg / ml FGF4 Protein auf eine sterile Petrischale auf Eis für 30 min. Pick beads etwa 150 & mgr; m im Durchmesser mit No. 5 microforceps zur Einführung in den Embryo. Hinweis: Behandeln Sie Ionenaustauscherharzkügelchen verwendet in den folgenden Schritten mit No. 5 microforceps und greifen sie sehr sanft, da die Perlen sind spröde und zerbrechen kann, wenn zu fest zusammengedrückt. Diese Warnung gilt für 2.3.2-2.3.3 und alle Harzperle Operationen. RA Auftauen ein Aliquot von 0,05 oder 0,1 mg / ml all-trans-RA mit DMSO verdünnt und legen eine 100 & mgr; l Tropfen auf eine sterile Petrischale (9 cm Durchmesser), die zuvor in Folie abgedeckt wurde, um die RA vor Licht zu schützen. Nehmen Sie eine 10 ul Pipettenspitze und holen einige Chloridform IonenaustauschHarzkügelchen an ihrem Ende und vor Licht für 20 min bei Raumtemperatur geschützt diese in der RA Tropfen einweichen. Spülen der Kügelchen in drei aufeinanderfolgenden Tropfen von 100 & mgr; l Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), die auf der gleichen Petrischale mindestens 1 cm auseinander. HINWEIS: Die Perlen des Phenol roten Farbstoff aus dem DMEM aufzunehmen. Dieses Verfahren basiert auf 5. Pick-Perlen ca. 100 & mgr; m im Durchmesser (Kügelchen liegen in der Größenordnung von 75 bis 180 & mgr; m, wenn sie nass) zum Einsetzen in den Embryo, ein Mikroskoptisch graticule Objektträger unter den Petrischale und No.5 microforceps mit den Perlen zu halten. Bei der Kommissionierung der Wulst aus dem 100 & mgr; l Tropfen DMEM, erster Stelle der Wulst nach unten auf die Petrischale und entfernen sie alle verbleibenden DMEM entweder durch den Wulst aus dem Drop-Schieben oder durch die geschlossene Zange neben dem Wulst (Kapillare platzieren Aktion zieht die Flüssigkeit von der Perle). BMS 493 Wie für die RA (2.3.2), tränken Ion Exchange-Harzperlen in einem 100 & mgr; l Tropfen von 2,5 oder 5,0 mg / ml BMS 493 in DMSO bei Raumtemperatur für 20 min, dann gründlich in 100 & mgr; l Tropfen DMEM. Pick Perlen ungefähr 100 & mgr; m im Durchmesser für die Einführung in den Embryo. DMSO-Kontrolle Wie bei der RA (2.3.2), Ionenaustauschharzperlen in einem 100 & mgr; l Tropfen DMSO bei Raumtemperatur für 20 min, dann gründlich in 100 & mgr; l Tropfen DMEM einweichen. Pick Perlen ungefähr 100 & mgr; m im Durchmesser für die Einführung in den Embryo. 3. Barrier und Bead Operationen Abbildung 1. Schema von Hühnerembryonen von verschiedenen Stadien zeigt , wo Barrieren und oder Perlen platziert werden soll. (A) Stufe 13 Hühnerembryo schematische Darstellung Sperrposition (grüne Linie) zwischen Somiten und LPM am presumptive Flügel Ebene (Somiten 15-20). (B) Das gleiche Schema wie in (A), die anzeigt , wo RA Wulst (roter Kreis) sollte vor der Barriere Einsetzen angeordnet werden. (C) schematische Darstellung Sperrposition (grüne Linie) an der vermutlichen Bein Ebene (Somiten 26-32) in einer Stufe 15 Embryo. (D) Das gleiche Schema wie in (C), die angibt , wo ein RA Wulst (roter Kreis) platziert werden soll. (E) Schematische anzeigt , wo BMS 493 Perlen (lila Kreise) sollte in der LPM einer Stufe 15 Embryo platziert werden. (F) Schematische Darstellung einer Stufe 9 Hühnerembryo – Anzeigesperrposition (grüne Linie) zwischen präsomitischen Mesoderm und LPM am vermutlichen Flügel Ebene. (G) Schematische Darstellung einer Stufe 9 Embryo zeigt die Positionen einer Barriere (grüne Linie) und RA Wulst (roter Kreis). (H) Schematische Darstellung einer Stufe 10 Hühnerembryo zeigen Barriere Position (grüne Linie) an der vermutlichen Bein Ebene. (I </strong>) Schematische Darstellung zeigt BMS 493 Wulstposition (lila Kreis) in der Stufe 10 Bein Ebene LPM. Diese Zahl wurde von 7 modifiziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Barrier bei Stufe 13 eingeführt Flügel Knospe Einleitung zu verhindern. Nehmen Sie eine Stufe 13 Embryo aus dem Inkubator und legen Sie das Ei auf einem Ei Rest unter dem Binokular auf 3,2x Vergrößerung und höher, wenn bevorzugt. Entfernen Sie die obere Schicht aus durchsichtigem Klebeband. Verwendung eines Stahlmikromesser, bilden einen Einschnitt durch die Dotterhaut und lateralen Mesoderm (LPM) benachbart Somiten 15 bis 20 (1A) auf der rechten Seite des Embryos (Somiten nicht alle in dieser Phase gebildet wird ). Schneiden Sie neben den letzten vier gebildeten Somiten und weiterhin die Schnitt zwei somite Längen kaudal. Pick-up die Barriere (0,7-1 mm breit) mit No. 5 microforceps am Ende aus der Petrischale vorsteht und die Hand verdrehen, das freie Ende der Barriere in den Einschnitt einzufügen. Das Scharnier förmige Barriere liegt flach auf der Vitellinmembran über dem LPM mit der Hälfte nach unten durch den Einschnitt distal zu den Somiten vorsteht. So bald wie möglich abzudichten das Ei mit durchsichtigem Klebeband und es in den Inkubator zurück. HINWEIS: Die Mikro Messer und Pinzetten werden klebrig bei Berührung mit der Dottermembran. Es ist wichtig, dass sie sauber und mit 70% Ethanol zu wischen, bevor eine nachfolgende Operation versucht. Dies gilt für alle nachfolgenden Betrieb Beschreibungen und Implantationen zu Wulst. Wenn ein Wulst mit einer Barriere in Verbindung eingefügt zu werden; die Sicke in No. 5 microforceps nehmen zum einen und in die Schnittfläche des LPM auf der distalen Seite des Einschnitts einzufügen und dann die Barriere in den Einschnitt proximal zu dem Wulst (1B) ein. Dichten Sie das Ei und senden Sie es sofort in den Inkubator. </li> Barrier bei Stufe 15 eingeführt Bein Knospe Einleitung zu verhindern. HINWEIS: Ein Beispiel für das Ergebnis dieser Operation auf Tbox 4 – Transkriptionsfaktor (TBX4) Expression in 2D und 2E gezeigt. Nehmen Sie eine Stufe 15 Embryo aus dem Inkubator und legen Sie das Ei auf einem Ei Rest unter dem Binokular auf 3,2x Vergrößerung und höher, wenn bevorzugt. Entfernen Sie die obere Schicht aus durchsichtigem Klebeband. Eine Stahlmikro Messer einen Schnitt durch die Dotterhaut und LPM benachbart Somiten 26 bis 32 (1C) auf der rechten Seite des Embryos unter Verwendung machen (Somiten nicht alle in dieser Phase gebildet wird ). Schneiden angrenzend an den letzten beiden gebildeten Somiten und weiterhin die geschnittenen fünf Somiten Längen kaudal. Pick-up die Barriere (1,2-1,3 mm breit) mit No. 5 microforceps an einem Ende und drehen Sie die Barriere, die das freie Ende in den Einschnitt einzufügen. So bald wie möglich abzudichten das Ei mit durchsichtigem Klebeband ein bisnd Rückkehr es in den Inkubator. HINWEIS: Das Scharnier förmige Barriere liegt flach auf der Vitellinmembran über dem LPM mit der Hälfte davon abstehenden nach unten durch den Einschnitt distal zu den Somiten. Wenn eine Sicke in Verbindung mit einer Barriere eingesetzt werden soll, zum einen, um die Wulst in No. 5 microforceps und in die Schnittfläche des LPM auf der distalen Seite des Einschnitts einzufügen und dann die Barriere in den Einschnitt proximal zu stecken der Wulst (Figur 1D). Dichten Sie das Ei und senden Sie es sofort in den Inkubator. Wenn eine Perle oder Perlen ohne Barriere eingesetzt werden sollen, zB BMS 493 Perlen Beinbereich in der Stufe 15 nicht den langen Schnitt machen (3.2.2.1). Machen Sie einen kleinen Schnitt durch die Dotterhaut und in die LPM an der Position der Wulst angeordnet werden soll. Nehmen Sie die Perle in No. 5 microforceps und es in das Loch in der LPM einfügen. Schieben es in einem etwas weiter mit den geschlossenen Enden der Zange (Figur 1E). </li> Barrier in der Stufe 9 eingeführt, um Flügel Knospe Induktion und Initiierung verhindern. Nehmen Sie eine Stufe 8 oder 9 Embryo aus dem Inkubator und legen Sie das Ei auf einem Ei Rest unter dem Binokular auf 3,2x Vergrößerung und höher, wenn bevorzugt. Mit Hilfe eines Stahlmikro Messer einen Schnitt durch die Vitellinmembran und LPM laterale und rostral des Primitivstreifens, am kaudalen Ende des Embryos im Einklang mit den Somiten (1F) etwa 5 somite Längen lang. Pick-up die Barriere (0,7-1 mm breit) mit No. 5 microforceps am Ende aus der Petrischale vorsteht und drehen Sie die Hand zu führen Sie das freie Ende der Barriere in den Einschnitt. So bald wie möglich abzudichten das Ei mit durchsichtigem Klebeband und es in den Inkubator zurück. HINWEIS: Das Scharnier förmige Barriere liegt flach auf der Vitellinmembran über dem LPM mit der Hälfte nach unten durch den Einschnitt vorsteht. Wenn eine Perle ist inserte seind in Verbindung mit einer Sperre; die Sicke in No. 5 microforceps nehmen zum einen und in die Schnittfläche des LPM auf der distalen Seite des Einschnitts einzufügen und dann die Barriere in den Einschnitt proximal zu dem Wulst (Figur 1G) einzufügen. Dichten Sie das Ei und senden Sie es sofort in den Inkubator. Barrier bei Stufe 10 eingeführt Bein Knospe Induktion und Initiierung zu verhindern. HINWEIS: Ein Beispiel für das Ergebnis dieser Operation auf TBX4 Expression in 2G gezeigt ist . Nehmen Sie eine Stufe 10 Embryo aus dem Inkubator und legen Sie das Ei auf einem Ei Rest unter dem Binokular auf 3,2x Vergrößerung und höher, wenn bevorzugt. Mit einem Stahlmikro Messer einen Schnitt durch die Vitellinmembran machen und LPM lateral des Primitivstreifens, am kaudalen Ende des Embryos im Einklang mit den Somiten (Abbildung 1 H) ca. 6 somite Längen lang. Pick-up die Barriere (1.2mm breit) mit No. 5 microforceps am Ende aus der Petrischale vorsteht und die Hand verdrehen, das freie Ende der Barriere in den Einschnitt einzufügen. So bald wie möglich abzudichten das Ei mit durchsichtigem Klebeband und es in den Inkubator zurück. HINWEIS: Das Scharnier förmige Barriere liegt flach auf der Vitellinmembran über dem LPM mit der Hälfte nach unten durch den Einschnitt vorsteht. Wenn ein Wulst ohne Barriere eingesetzt werden soll, beispielsweise BMS 493 Wulst zum Schenkelbereich an der Stufe 10, stellen einen kleinen Einschnitt durch die Dotterhaut und in die LPM an der Position platziert werden der Wulst ist. Nehmen Sie die Perle in No. 5 microforceps und es in das Loch in der LPM einfügen. Schieben Sie es in ein wenig weiter mit den geschlossenen Enden der Zange (1I). 24 Stunden oder mehr nach dem Vergleich mit dem aufstrebenden kontralateralen Extremitätenknospe überprüfen Sie die Position der Barriere arbeitet. Entsorgen Sie alle Embryonen, bei denen die Barriere deutlich ist nicht opposite der linken Extremitätenknospe. In diesem Fall wurde die Barriere falsch positioniert. 4. Ernten Embryonen, Fixierung und Vorbereitung für Wholemount In – situ – Hybridisierung (WISH) Ernte Embryonen nach der Operation. Ernte Embryonen im Stadium 19-23, so dass Gliedmaßenknospe Morphologie ist deutlich sichtbar in beiden betrieben und Gegensteuer Seiten. Mit einer gebogenen Schere geschnitten, um ein größeres Loch in der Eierschale. Cut um den Embryo während die große Blutgefäß, das mit microforceps des Embryos nach links zu halten. Verwenden Sie diesen Griff des Schiffes, den Embryo zu entfernen und legen Sie sie in einer Petrischale von phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,3. Unter dem Binokular, sezieren entfernt zusätzliche embryonale Gefäße und Membranen, die eine Kombination aus gebogenen Schere und nein. 5 microforceps. Entfernen Sie den Kopf mit der Schere. Die Fixierung von Embryonen Post Ernte. Mit gekrümmten blunt Zange, heben Sie den Embryo und legen Sie es in 5 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS bei Raumtemperatur für zwei Stunden rocken und dann bei 4 ° C über Nacht in einem 20 ml-Glasflasche mit Schraubverschluss. Achtung: PFA ist eine ernste Gefahr für die Gesundheit. Es ist ein gesundheitsschädlich, ätzend reizend und das Pulver muss in Berührung kommen mit der Haut, Augen und Lungen verhindert werden. Persönliche Schutzkleidung verwenden und eine Abzugshaube während der Herstellung der Lösung. Sobald es eine 4% ige Lösung, Handschuhe ist, eine Schutzbrille und einen Laborkittel zu tragen. HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Embryonen in Verlegenheit schnell zu bekommen, um beste mRNA Integrität bewahren. Zur Beseitigung von Hindernissen vor In – situ – Hybridisierung an Wholemount. HINWEIS: Barrieren entfernt werden , weil sie scharf sind und Embryonen schädigen , wenn sie durch die gehen in – situ – Hybridisierung Protokoll, vor allem , wenn mehrere Embryonen auf einmal gefärbt sind. Nach der Fixierung, stellen Sie den Embryo in eine Schüssel mit PBS unter einem Binokular mikop. Die Verwendung von zwei Paaren von No. 5 microforceps, legen Sie das linke Paar eng auf beiden Seiten der Barriere in der operierten Seite des Embryos. Fassen Sie die Sperre mit dem rechten Paar und sanft die Barriere aus dem Embryo ziehen Sie das linke Paar mit dem Embryo zu halten und jedes Gewebe zu verhindern, dass die Barriere von anhaftenden, wie es entfernt wird. Führen wollen im Wesentlichen wie in 11 beschrieben.