Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK

Come parte del natural killer del sistema immunitario innato (NK), le cellule contribuiscono alla prima linea di difesa contro le cellule infettate da virus o malignamente trasformati. Un sistema di recettori inibitori e attivatori consente loro di distinguere tra cellule sane e trasformate senza alcun priming antigene rispetto alle cellule T. Al momento dell'incontro delle cellule bersaglio cellule NK rilasciare il contenuto dei loro granuli citotossici (ad esempio, perforina, il granzimi) nella sinapsi immunitario per uccidere il loro obiettivo. Inoltre, le cellule NK producono e secernono diversi tipi di citochine (ad esempio, gamma interferone: IFN-γ; fattore di necrosi tumorale-α: TNF-α) e chemochine (ad esempio, macrofagi infiammatori proteina-1β: MIP-1b) su cellule bersaglio interazione o citochina stimolazione ^1.

funzioni delle cellule NK sufficienti come la citotossicità, chemochine e la produzione di citochine hanno un impatto importante sulla sorte di diversi disfacilita. Pazienti affetti da leucemia mostrano un aumento tassi di recidiva se presentano un profilo delle cellule NK difettose al momento della diagnosi consiste di produzione di IFN-γ ridotta e ridotta espressione di attivare i recettori delle cellule NK ^2. Un recupero precoce del numero di cellule NK e le funzioni, tra cui la produzione di citochine in seguito all'interazione cellula bersaglio è associato ad una ricaduta ridotta e il tasso di sopravvivenza migliore nei pazienti trattati con trapianto di cellule staminali allogeniche ^3. Inoltre, dopo l'inizio della terapia con interferone nei pazienti con infezione da virus dell'epatite C la capacità degranulazione delle cellule NK periferiche è più forte nei primi responder rispetto ai non-responder ^4. Il numero di cellule NK (> 80 / ml) al giorno 15 dopo il trapianto autologo di cellule staminali (trapianto autologo) in pazienti affetti da linfoma o mieloma multiplo sono predittivi per una migliore libera da progressione e la sopravvivenza globale ^5. Nei pazienti affetti da melanoma l'espressione della cellule T immunoglobuline e mucina-domain-contenentg molecola-3 (TIM-3), una proteina immuno-normativo sulle cellule NK, correla con stadio di malattia e la prognosi ^6.

Gli scienziati hanno monitorato le funzioni delle cellule NK nel corso degli ultimi decenni. L'analisi iniziale di citotossicità delle cellule NK contro le cellule tumorali senza obbligo di adescamento è stato affrontato con un saggio di ⁵¹ Cr-release ^7. Più recentemente, gli scienziati hanno sviluppato un metodo non radioattivo per valutare la citotossicità delle cellule NK espanse ^8. Citochine e chemochine è stato spesso valutata utilizzando test immunoenzimatico (ELISA) tecniche enzyme-linked ^9,10. Nel corso degli ultimi decenni, questi metodi sono stati integrati da analisi di flusso citometria-based. L'uso di inibitori della proteina di trasporto (ad esempio, brefeldina A e monensin) e metodi di permeabilizzazione delle cellule in combinazione con protocolli di colorazione della superficie convenzionale ha permesso agli scienziati di studiare chemochine e la produzione di citochine in diversi linfa specificosottoinsiemi ocyte (ad esempio, T, B o cellule NK) ^11. Inoltre, le analisi di citometria a base di diversi flussi sono stati sviluppati per monitorare T e NK citotossicità delle cellule. Nel 2004 Alter et al. Descrive l'espressione di superficie della proteina lisosomi associata CD107a (Lamp1) sulle cellule NK su incontro cellula bersaglio come marker per la degranulazione dei granuli citotossici ^12. Dal momento che una vasta gamma di differenti fluorocromi e multicanale citometri a flusso sono disponibili ai nostri giorni, è diventato possibile monitorare contemporaneamente diverse funzioni delle cellule NK (citotossicità, citochine e chemochine produzione) in diverse sottopopolazioni di cellule NK. Questo diventa particolarmente importante in situazioni in cui la dimensione del campione è limitato, ad esempio, in biopsie o campioni di sangue di pazienti affetti da leucopenia.

Per provare le funzioni delle cellule NK globali, i saggi di citometria a base di diversa portata può essere efficacemente combinati. Theorell et al. Cellule NK stimolate da headonatori lthy con la linea di cellule tumorali K562 e analizzato la produzione di degranulazione, segnale dentro-fuori e chemochine NK tramite citometria di flusso ^13. Recentemente sottogruppi di cellule NK, fenotipi e funzioni in pazienti con tumore durante trapianto autologo sono stati analizzati utilizzando flusso saggi citometria-based. E 'stato dimostrato che le cellule NK sono stati in grado di degranulano e produrre citochine / chemochine su riconoscimento delle cellule tumorali in momenti molto precoce dopo trapianto autologo ^11.

Qui un protocollo è descritto per valutare le funzioni delle cellule NK mediante interazione con le cellule tumorali compresa la capacità di degranulazione, chemochine e produzione di citochine mediante un flusso assay citometria-based che consente di controllare le funzioni delle cellule NK in diversi sottoinsiemi simultaneamente.