発光時計レポーターとシロイヌナズナプロトプラストトランスフェにおける概日表現型の迅速分析

注：このプロトコルでは、記載の試薬およびボリュームがテストされるシロイヌナズナラインごとに表現され、その遺伝子型について6複製ウェルになります。複数の行を分析する場合、分析される行数を有する材料を掛けます。ビデオでは、野生型シロイヌナズナは、（追加の行からの代表的な結果が続いて提供されますが）概日時計突然変異体のラインZTLと比較されます。 酵素液 セルラーゼ 0.5％（w / v）のペクチナーゼR10 0.25％（w / v）の D-マンニトール 400 mMの CaCl 2 10 mMの塩化カリウム 20 mMのウシ血清アルブミン 0.1％（w / v）の MES、pHは5.7 20 mMの W5ソリューション NaClを 150mMの CaCl 2 125 mMの塩化カリウム 5 mMの MES、pHは5.7 2 mMのグルコース 5 mMの MMGソリューション MES、pHは5.7 4 mMの D-マンニトール 400 mMの MgCl 2 15 mMの PEG溶液 PEG4000 40％（w / v）の D-マンニトール 200 mMの CaCl 2 </td> 100 mMの イメージングソリューション W5ソリューション最終容量ウシ胎仔血清 5％（v / v）のルシフェリン 1.2 mMのアンピシリン 50 mg / mlで 表1： ソリューションの一覧。 材料およびバッファの作製植物材料シロイヌナズナコルを保つ-0水に種子を1.5mlチューブ中で4℃の暗所で4日間。ポットに土に種をピペットし、7日間21℃で長日条件下（16時間明8時間の暗）に移します。高湿度を確保するために、最初の3日間、鍋に蓋をしたままにしておきます。移植6新しい8センチメートルのx 13センチメートル×5センチポットに苗とanothため同じ条件で植物を成長を続けます21日えー。土壌は全体で湿っていることを確認してください。 レポータープラスミド製造業者の説明書に従ってDNA単離キットを使用して、事前に細菌の培養物からLUCレポータープラスミド19：CCA1proを精製します 。 注：20μgのレポータープラスミドをトランスフェクションのため（のdH 2 O中に2μg/μlので10μl）を必要とされます。 ソリューション注：このプロトコルのための5つのソリューションが必要とされる：酵素液、洗浄5（W5）溶液、マンニトール、マグネシウム（MMG）溶液を、ポリエチレングリコール（PEG）溶液、及び撮像溶液（ 表1）。プロトプラスト単離工程に進む前に、これらを準備します。 表1のとおりの酵素溶液10mlを調製し、最後の酵素を追加し、フィルタは、0.22μmのシリンジフィルターを通して溶液を滅菌します。 次のボリュームに残っている溶液を調製：15ミリリットルW5ソリューション、10ミリリットルMMG秒表1のとおりolution、1ミリリットルPEG溶液と1.5ミリリットルのイメージングソリューション。 注：これは、PEG溶液は、PEGが完全に溶解していることを確認するために、トランスフェクション前に時間未満何を準備されていないことが重要です。フィルターは、0.22μmのシリンジフィルターを通してイメージング溶液を滅菌します。 図1：プロトプラスト単離成人シロイヌナズナ植物（A）の葉を（B）に上向き下部表皮層でオートクレーブテープで固定されています。 （C）マジックテープを穏やかに15ミリリットルコニカルチューブの先端と下側の表皮層に押し付けられます。 （D）マジックテープは葉肉細胞（E）を露出させます。 （F）休暇でオートクレーブテープのストリップ添付の溶液にプロトプラストを放出し、セルラーゼおよびペクチナーゼを含む酵素液に浮いています。 （G）は、葉の骨格は、酵素溶液（H）でプロトプラストを残して、酵素消化後、オートクレーブテープ上に残り、廃棄されます。 （I）の最終結果の葉肉プロトプラスト（スケールバー=50μm）を。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 2.プロトプラストの単離シャーレにラベルを付け、10ミリリットルフィルター滅菌酵素溶液を加えます。 きれいなラボの表面に粘着面を上にしてオートクレーブテープの4ストリップを修正し、ストリップ上のペトリ皿のサイズをマーク。 （4週齢の植物（ 図1a）の葉をカットし、オートクレーブテープに表皮上層を押してください（上を向いすなわち低い表皮面<strong>図1b））。 ゆっくり15ミリリットルコニカルチューブを使用して、下側の表皮表面にマジックテープのストリップを押してください。葉組織（ 図1c）を鎮圧しないように注意してください。慎重に下表皮（ 図1D）を除去し、葉肉細胞（ 図1eの）を露出するためにマジックテープをやってのけます。 ペトリ皿にテープを移動し、酵素液（ 図1F）上に浮遊するように、使用ピンセットをペトリ皿に合うようにオートクレーブテープをカットし、下向きに残します。プロトプラストを溶液中に放出される時に60分のためのプラットフォームシェーカー上で60rpmで回転させます。 オートクレーブテープ片を除去し、廃棄するためにピンセットを使用します（ 図1グラム ）と50mlコニカルチューブにプロトプラスト（ 図1H）を含む溶液をピペット。 （端を切断して、このようなP5000チップまたはP1000チップとして）ワイドボアピペットチップを使用してください。 遠心分離機100 xにおけるプロトプラスト4℃で3分間グラムとピペットで上清を除去します。ペレットは非常に緩んでいるとして、注意してください。 チューブを穏やかに渦巻くことにより、10ミリリットルのW5プロトプラストに対する解決策と再懸濁を追加します。 30〜60分間氷上でプロトプラストを休ま。このステップの間、血球計数器（ 図1I）にプロトプラストをカウントすることにより、歩留まりを評価します。 4℃で3分間、100×gでの遠心分離によってプロトプラストを収集し、ピペットで上清を除去します。ペレットは非常に緩んでいるとして、注意してください。 MMG溶液中の5×10 5個のプロトプラスト/ mlの濃度にプロトプラストを再懸濁します。 3.プロトプラストトランスフェクション 15ミリリットルコニカルチューブに10μlのレポータープラスミド（2μgの/μl）を追加します。 チューブに400μlのプロトプラストを追加します。 1ボリューム（410μl）をPEG溶液を追加し、プロトプラストをトランスフェクションするためにチューブを穏やかに12回転倒混和します。 8-15分INC後室温でubationは、4つのボリューム（1640μL）W5溶液でプロトプラスト-DNA-PEG混合物を希釈し、軽く6回転倒混和します。 室温で2分間100×gで遠心分離することによってトランスフェクトされたプロトプラストを収集し、ピペットで上清を除去します。ペレットは非常に緩んでいるようにもう一度、注意してください。 1250μlのイメージングソリューションでプロトプラストを再懸濁します。 6へのアリコート200μlを、96ウェルプレートのウェルを複製W5溶液で任意の空のウェルを満たし、及び発光イメージングに適した接着剤明確な蓋でプレートをシール。 4.イメージング植物イメージングに適した任意の発光イメージングセットアップにプレートを転送します。撮影を開始し、その後、ウェル間の凝縮および圧力の違いを回避するために、転送した後、プレート上に接着剤の蓋に10〜15分を変更します。室温で5日間のプレート毎〜45分（ウェル当たり3秒）を読みます。 注記：プレートの頻度は、読み取り、ウェルあたりのリードタイムは、撮影設定によって異なります。 5.データ解析任意の解析ソフトウェア（例えば、生体リズム解析ソフトウェアシステム（BRASS）22）を用いた発光結果を分析します。概日の欠陥を明らかにするために、野生型コントロールに変異体のラインを比較してください。